Summary
Het huidige protocol beschrijft hoe draadloze optogenetica in combinatie met high-speed videografie kan worden gebruikt in een enkele pellet reach-to-grab-taak om de neurale circuits te karakteriseren die betrokken zijn bij de uitvoering van bekwaam motorisch gedrag bij vrij bewegende muizen.
Abstract
Fijne motoriek is essentieel in het dagelijks leven en kan worden aangetast bij verschillende aandoeningen van het zenuwstelsel. De verwerving en uitvoering van deze taken vereisen sensorisch-motorische integratie en omvatten nauwkeurige controle van bilaterale hersencircuits. Het implementeren van unimanuele gedragsparadigma's in diermodellen zal het begrip verbeteren van de bijdrage van hersenstructuren, zoals het striatum, aan complex motorisch gedrag, omdat het manipulatie en registratie van neurale activiteit van specifieke kernen in controleomstandigheden en ziekte tijdens de uitvoering van de taak mogelijk maakt.
Sinds de oprichting is optogenetica een dominant hulpmiddel geweest voor het ondervragen van de hersenen door selectieve en gerichte activering of remming van neuronale populaties mogelijk te maken. De combinatie van optogenetica met gedragstesten werpt licht op de onderliggende mechanismen van specifieke hersenfuncties. Draadloze op het hoofd gemonteerde systemen met geminiaturiseerde lichtgevende diodes (LED's) maken op afstand optogenetische controle mogelijk in een volledig vrij bewegend dier. Dit voorkomt dat de beperkingen van een bedraad systeem minder beperkend zijn voor het gedrag van dieren zonder afbreuk te doen aan de efficiëntie van de lichtemissie. Het huidige protocol combineert een draadloze optogenetische benadering met snelle videografie in een unimanuele behendigheidstaak om de bijdrage van specifieke neuronale populaties aan fijn motorisch gedrag te ontleden.
Introduction
Motorisch geschoold gedrag is aanwezig tijdens de meeste bewegingen die door ons worden uitgevoerd, en het is bekend dat het wordt beïnvloed bij verschillende hersenaandoeningen 1,2,3,4,5,6. Het implementeren van taken die het mogelijk maken om de ontwikkeling, het leren en de prestaties van bekwame bewegingen te bestuderen, is cruciaal voor het begrijpen van de neurobiologische onderbouwing van de motorische functie, vooral in modellen van hersenletsel, neurodegeneratieve en neurologische ontwikkelingsstoornissen 2,7,8,9,10,11,12,13 . Het reiken naar en ophalen van objecten wordt routinematig gedaan in het dagelijks leven, en het is een van de eerste motorische vaardigheden die tijdens de vroege ontwikkeling zijn verworven en vervolgens door de jaren heen zijn verfijnd 5,6. Het omvat een complex gedrag dat sensorisch-motorische processen vereist, zoals de perceptie van de kenmerken van het object, bewegingsplanning, actieselectie, bewegingsuitvoering, lichaamscoördinatie en snelheidsmodulatie 7,14,15,16. Unimanuele taken met hoge behendigheid vereisen dus de deelname van vele hersenstructuren van beide hemisferen 16,17,18,19,20,21,22. Bij muizen wordt de single pellet reach-to-grasp-taak gekenmerkt voor verschillende fasen die afzonderlijk kunnen worden gecontroleerd en geanalyseerd 7,13,23. Deze functie maakt het mogelijk om de bijdrage van specifieke neuronale subpopulaties in verschillende stadia van acquisitie en gedragsprestaties te bestuderen en biedt een platform voor gedetailleerde studies van motorische systemen 13,23,24. De beweging vindt plaats in een paar seconden; daarom moet snelle videografie worden gebruikt voor kinematische analyse in verschillende stadia van het geschoolde motorische traject 7,25. Verschillende parameters kunnen uit de video's worden geëxtraheerd, waaronder lichaamshouding, traject, snelheid en type fouten25. Kinematische analyse kan worden gebruikt om subtiele veranderingen tijdens draadloze optogenetische manipulatie te detecteren 7,23.
Het gebruik van geminiaturiseerde light-emitting diodes (LED's) om licht te leveren via een draadloos head-mounted systeem maakt het mogelijk om op afstand optogenetische controle te hebben terwijl het dier de taak uitvoert. De draadloze optogenetische controller accepteert single-pulse of continue triggercommando's van een stimulator en stuurt infraroodsignalen (IR) naar een ontvanger die is aangesloten op de geminiaturiseerde LED23,26. Het huidige protocol combineert deze draadloze optogenetische benadering met snelle videografie van een behendigheidstaak om de rol van specifieke neuronale populaties te ontleden tijdens de uitvoering van fijn motorisch gedrag23. Omdat het een unimanuele taak is, maakt het het mogelijk om de deelname van structuren in beide hemisferen te beoordelen. Traditioneel regelen de hersenen de lichaamsbeweging op een zeer asymmetrische manier; taken met een hoge behendigheid vereisen echter zorgvuldige coördinatie en controle van vele hersenstructuren, waaronder ipsilaterale kernen en differentiële bijdrage van neuronale subpopulaties binnen kernen 10,20,21,22,23. Dit protocol laat zien dat subcorticale structuren van beide hemisferen de baan van de voorpoot23 regelen. Dit paradigma kan geschikt zijn om andere hersengebieden en modellen van hersenziekten te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures met betrekking tot diergebruik werden uitgevoerd volgens lokale en nationale richtlijnen en goedgekeurd door het overeenkomstige Institutional Animal Care and Use Committee (Institute of Cellular Physiology IACUC-protocol VLH151-19). Drd1-Cre transgene mannelijke muizen27, 35-40 dagen postnatale met C57BL/6 achtergrond werden gebruikt in het huidige protocol. Muizen werden gehouden onder de volgende omstandigheden: temperatuur 22±1 °C; vochtigheid 55%; lichtschema 12/12 uur met lichten uit om 19.00 uur en gespeend op postnatale dag 21. Gespeende pups werden gehuisvest in groepen van hetzelfde geslacht van 2-5. Dieren werden gehuisvest in statische behuizingen met micro-barrièretoppen. Het beddengoed bestond uit steriel espenkrullen. Knaagdierkorrels en RO-gezuiverd water werden ad libitum verstrekt, behalve wanneer dit werd opgemerkt.
1. Chirurgische ingrepen
- Bereid een LED-canule voor op de gewenste lengte volgens de dorsoventrale coördinaten van de structuur van belang (idealiter 0,5 mm langer om rekening te houden met de dikte van de schedel, voor het dorsolaterale striatum 3,5 mm) (figuur 1).
- Knip de glasvezel tot een lengte langer dan de uiteindelijke gewenste maat, slijp de vezelpunt tot de doellengte met ruw schuurpapier en polijst ten slotte de vezelpunt met fijn schuurpapier.
OPMERKING: LED-canule is een glasvezel met een diameter van 250 μm die is bevestigd aan een infraroodontvanger (zie Tabel met materialen).
- Knip de glasvezel tot een lengte langer dan de uiteindelijke gewenste maat, slijp de vezelpunt tot de doellengte met ruw schuurpapier en polijst ten slotte de vezelpunt met fijn schuurpapier.
- Trek glazen pipetten (1,14 mm buitendiameter, 0,53 mm binnendiameter en 3,5 inch lengte) voor de nano-injector met een horizontale trekker (zie Tabel met materialen) en bewaar ze voor later. Programmeer de trekker in één lus om een tipdiameter van 15-20 μm te krijgen met een lange geleidelijke helling taps toelopend (4-5 mm).
- Bereid het operatiegebied voor door het stereotaxische apparaat, de kap, de micro-injector (zie Materiaaltabel) en de omliggende oppervlakken grondig te desinfecteren met 70% ethanol.
OPMERKING: Een stereotaxisch muisapparaat is essentieel om Adeno Associated Virus (AAV's) nauwkeurig te injecteren en de LED-canule in het betreffende gebied te plaatsen. - Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen voor de procedure, waaronder een schone laboratoriumjas of chirurgische wegwerpjas, steriele handschoenen, gezichtsmasker en wegwerphoofdkap.
- Plaats de benodigde apparatuur dicht bij het operatiegebied, zoals steriele chirurgische hulpmiddelen, wattenstaafjes, oplossingen, micropipette, pipetpunten, haarvaten, microvulling met minerale olie en marker.
- Vul een pipet voor micro-injecties met minerale olie en plaats deze in de micro-injector. Zorg ervoor dat de micro-injector correct werkt door wat minerale olie uit te werpen.
OPMERKING: Alle instrumenten die tijdens de operatie worden gebruikt, moeten worden geautoclaveerd en steriel zijn. Aseptische techniek moet worden gebruikt. - Verdoof dieren met gasvormig isofluraan 4-5% om anesthesie te induceren en 1,2% gedurende de hele operatie met 0,5-1 l / min zuivere zuurstof. De operatie begint pas nadat het dier een punt van diepe anesthesie heeft bereikt, beoordeeld door de afwezigheid van pootontwenning na een lichte knijp.
- Controleer continu de ademhalingssnelheid en temperatuur van het dier. Houd de lichaamstemperatuur op peil door een verwarmingskussen op 34 °C te zetten.
- Breng een oogheelkundige zalf aan. Verwijder het haar van de hoofdhuid met een trimer en ontharingscrème. Veeg de hoofdhuid af met wattenstaafjes met 8% povidon-jodium (zie Tabel met materialen) en 70% ethanol, elk driemaal afgewisseld.
- Plaats de muis in het stereotaxische apparaat en zet het hoofd vast, zodat de schedel in de middelste en voorste achterste assen wordt geëgaliseerd.
- Maak een incisie van 1 cm met een scalpel door de hoofdhuid ter hoogte van de ogen langs de sagittale as. Trek de huid terug om de schedel bloot te leggen en reinig het botvlies met wattenstaafjes.
- Reinig het schedeloppervlak met zoutoplossing en steriele wattenstaafjes. Los eventuele bloedingen aan het oppervlak op met steriele absorberende oogsperen (zie Materiaaltabel) of vergelijkbaar steriel absorberend materiaal.
- Breng een druppel 2,5% waterstofperoxide aan met een wattenstaafje en laat het een paar seconden inwerken om de schedelnaden zichtbaar te maken en een betere referentie te hebben. Reinig na een paar seconden grondig met een schoon wattenstaafje.
- Plaats met de glazen pipet (15 μm eindpuntdiameter) bregma en lambda om te controleren of de schedel in de voorste-achterste as is geëgaliseerd.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een stereoscopische microscoop of USB-microscoop te hebben om de punt van de glazen pipet te zien. Als het nodig is, past u de hoogte van de mondhouder aan om de schedel waterpas te maken. - Verplaats het capillair naar de geselecteerde anterieur-posterieure (AP) en mediaal-laterale (ML) coördinaten (dorsolateraal striatum AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Schilder een referentiepunt in de hoofdhuid boven de geselecteerde coördinaten met een steriele marker.
- Voer in het referentiepunt een craniotomie met een diameter van ~ 1 mm uit die zachte druk uitoefent op de schedel met een steriel roterend gereedschap of tandartsboor met een lage tot gemiddelde snelheid met een kleine ronde tandheelkundige boor (zie Tabel met materialen).
- Laad het capillair met 300-400 nL Cre-afhankelijk adeno-geassocieerd virus (AAV) zoals AAV1-dflox-hChR-2-mCherry om Channelrhodopsin of een AAV tot expressie te brengen om alleen het reportereiwit (bijv. mCherry) tot expressie te brengen als een controle in het betreffende gebied (zie Tabel met materialen). Controleer of de punt niet verstopt is en breng vervolgens de glazen pipet in de hersenen in op de gewenste dorso-ventrale (DV) coördinaten (dorsolaterale striatum DV -3,35 mm).
- Injecteer 200 nL met behulp van een automatische injector met een snelheid van 23 nL/s. Wacht 10 minuten na het beëindigen van de injectie, trek de glazen pipet langzaam terug om morsen te voorkomen.
OPMERKING: Het is mogelijk om een naald van 30 G te gebruiken om te injecteren met de juiste micro-injector.
- Injecteer 200 nL met behulp van een automatische injector met een snelheid van 23 nL/s. Wacht 10 minuten na het beëindigen van de injectie, trek de glazen pipet langzaam terug om morsen te voorkomen.
- Reinig en droog eventuele resten met wattenstaafjes.
- Bevestig de steriele glazen LED-canule aan de stereotaxische arm en kalibreer de coördinaten met bregma als referentie. Breng de canule zeer langzaam (300 μm/min) in om weefselbeschadiging te voorkomen en plaats deze 100 μm boven de injectieplaats.
- Zodra de LED-canule op zijn plaats zit, voegt u een druppel (100 μL) weefsellijm toe aan de rand van de craniotomie.
- Bereid tandheelkundig cementmengsel voor (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant om de vezel aan de schedel te bevestigen.
OPMERKING: Gebruik kort een gekoelde porseleinen schaal om meer werktijd te hebben voordat cement uitzet. Voeg 2 schepjes hars helder poeder toe aan de porseleinen schaal, voeg 4 druppels snelle basis en 1 druppel katalysator toe en meng goed. De poeder/vloeistofverhouding kan worden aangepast als een dunnere of dikkere viscositeit nodig is. - Breng met een steriele borstel het tandcementmengsel beetje bij beetje rond de canuleconnector aan en bouw lagen op totdat de schedel bedekt is en de connector stevig aan de schedel is bevestigd, waardoor de pinnen volledig vrij blijven. Vermijd het krijgen van tandcement op de huid van de muis.
- Laat het volledig drogen.
- Sluit de huid rond het implantaat met weefsellijm (zie Tabel met materialen).
- Plaats de muis in een herstelkooi boven een verwarmingskussen bij 33 ° C. Controleer op de aanwezigheid van een of meer van de volgende tekenen van pijn / ongemak: 1) Gebogen, gebrek aan of vermindering van motorische activiteit, 2) Niet verzorgen weerspiegeld in een niet-gesneden vuile vacht, 3) Overmatig likken of krabben, roodheid op de incisieplaats, 4) agressief gedrag, 5) anorexia of uitdroging en 6) Gebrek aan nestvorming.
OPMERKING: Houd de muis individueel gekooid tijdens alle procedures om te voorkomen dat het implantaat losraakt. In geval van loslating van de canule, voer euthanasie uit door 150 mg / kg natriumpentobarbital te injecteren, gevolgd door onthoofding nadat diepe anesthesie is bereikt. - Injecteer subcutaan (SC) meloxicam 1 mg / kg eenmaal daags gedurende drie dagen na de operatie om analgesie te bieden.
- Wacht ten minste 7 dagen voor volledig herstel en 14 dagen voor opsinexpressie vóór verdere procedures.
OPMERKING: Voer gedurende drie dagen elke 12 uur een postoperatieve follow-up uit en controleer vervolgens elke dag dieren tot de dag van euthanasie aan het einde van het experiment.
2. Reach-to-grasp training
- Start op dag 7 na de operatie met het voedseldeprivatieprotocol28. Weeg muizen gedurende drie opeenvolgende dagen om hun gemiddelde ad libitum lichaamsgewicht te bepalen. Plan vervolgens voedselbeperkingen in zodat de dieren voldoende voedingsstoffen krijgen om ongeveer 90% en niet minder dan 85% van het lichaamsgewicht te behouden.
OPMERKING: Dit wordt bereikt door dagelijks 2,5-3 g voedsel te verstrekken. Controleer het gewicht van dieren dagelijks en scoor voor het algehele welzijn door het gedrag en uiterlijk van dieren te observeren, bijvoorbeeld het uiterlijk van de vacht en de ogen. Gebruik het scoresysteem voor lichaamscondities van referentie29. - Tijdens de pre-training, training en testperiodes, voorzie elke muis dagelijks van 20 pellets (20 mg stofloze pellets met chocoladesmaak) (zie Tabel met materialen) (gegeten tijdens de taak of daarna) naast de standaard voedselpellets.
- Strooi drie dagen voor de gewenning 0,4 g / dier / dag 20 mg stofloze pellets met chocoladesmaak in hun thuiskooien, zodat muizen kennis maken met de pellets die als beloning dienen tijdens de reach-to-grab-taak.
- Laat muizen wennen door ze een dag voor de pre-training 10 minuten in de testkamer te plaatsen met pellets verspreid over de kamervloer (figuur 1A).
- Laat dagelijks voedsel toe na training en testen. Houd elke dag een vergelijkbaar schema aan.
- Plaats de muizen op de eerste dag van de pre-training in de reach-to-grab-kamer en observeer van voren. Plaats de pellets voor de kamer dicht bij de opening, zodat ze de pellets gaan consumeren. In dit stadium mogen muizen de pellets in elke vorm grijpen.
- Plaats de pellets op dag twee van de pre-training steeds verder van de opening totdat ze bij de inkeping (1 cm van de opening) komen, zodat muizen hun reach-to-grab-beweging kunnen vormen (figuur 1C).
- Train muizen om naar de achterkant van de kooi te rennen en terug te keren naar de kooiopening om de volgende voedselkorrel te ontvangen als een strategie om proeven te individualiseren.
OPMERKING: Dit kan worden bereikt door te wachten tot de muis zich achterin de kooi bevindt voordat u voor elke proef een pellet in de inkeping plaatst. - Plaats pellets die door hun rechter- of linkerpoot moeten worden vastgepakt.
OPMERKING: Muizen beginnen bij voorkeur één poot te gebruiken om te grijpen, die de volgende dagen van training en testen zal worden gebruikt. - Train dieren gedurende 6 dagen in dagelijkse sessies van 20 proeven of tot een maximum van 10 minuten verstreken. Plaats vanaf dag 2 van de training de mock-ontvanger (afmetingen 12 x 18 x 7 mm, 1 g, zie Materialentabel), zodat muizen tijdens het uitvoeren van de taak gewend raken aan het gewicht (figuur 1B). Scoor elke dag het aantal hit and missed trials.
- Neem gedrag op met een gewone camera en leg 30-60 frames / s vast vanaf de voorkant van de kamer. Daarnaast kan men een spiegel onder de trainingskamer plaatsen in een hoek van 45° om de houding van de dieren te monitoren (figuur 1D,E).
- Monteer voor post-hoc kinematische analyse (figuur 2) een hogesnelheidscamera (zie materiaaltabel) onder een hoek van 45° om vanaf de zijkant van de kooi op te nemen. Als een 3D-analyse vereist is, plaatst u een tweede hogesnelheidscamera om op te nemen in een hoek van 35 ° vanaf de voorkant van de kamer; beide camera's moeten in de rechter- of linkerkant van de kooi worden geplaatst, afhankelijk van de zijdelingse houding van de dieren en moeten met dezelfde framesnelheid vastleggen engesynchroniseerd zijn 7 (figuur 3D,E).
- Stel de hogesnelheidscamera's in op 100 frames/s met indien mogelijk een resolutie van 376 x 252 pixels of meer. Plaats witte piepschuimwanden achter de zijkanten en achterkant van de kamer om de achtergrond te verminderen en het contrast te verhogen (figuur 1E).
- Vervang op de testdag de mock unit door een infraroodontvanger voor draadloze optogenetische stimulatie (figuur 1B,C).
- Wanneer muizen beginnen te reiken, draait u de LED-canule handmatig met de afstandsbediening om een continue stimulatie te hebben voor de tijd dat het gedrag wordt uitgevoerd en niet langer dan 2 s. Het programmeren van een automatisch stimulatieparadigma heeft de voorkeur. Het stimulatieapparaat activeert een LED van 470 nm (blauw licht) met een intensiteit aan de punt van 1,0 mW/mm2.
- Verzamel de video's voor verder onderzoek, inclusief scoring en kinematische analyse.
3. Post-hoc histologische bevestiging
- Bevestig na voltooiing van een experiment de virale expressie en led-canuleplaatsing. Verdoof het dier met een cocktail van ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg. Zodra de muis tekenen van diepe anesthesie vertoont (stap 1.7), perfuseer met ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 4% PFA.
- Verwijder de geïmplanteerde canule voorzichtig door de connector stevig vast te pakken met een tang en voorzichtig omhoog te trekken.
- Extract en post-fix de hersenen gedurende 24 uur in 4% PFA23.
- Voer wasbeurten van 3-10 minuten uit met PBS.
- Snijd de hersenen in secties van 50 μm met behulp van een microtoom (zie Tabel met materialen).
- Monteer de secties in dia's met hard ingestelde montagemedia met DAPI om kernen te beitsen en dia's af te dekken.
- Observeer na het drogen de secties onder de confocale microscoop en controleer de locatie en expressie van de geïmplanteerde canule en expressie van Ch2R gefuseerd met fluorescerend eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De reach-to-grasp-taak is een paradigma dat veel wordt gebruikt om vormgeving, leren, prestaties en kinematica van fijne vaardigheidsbewegingen onder verschillende experimentele manipulaties te bestuderen. Muizen leren de taak in een paar dagen uit te voeren en bereiken meer dan 55% nauwkeurigheid bij het bereiken van een plateau na 5 dagen training (figuur 2A, B). Net als wat eerder is gemeld, voert een percentage dieren de taak niet naar behoren uit (29,62%), en die moeten worden uitgesloten van verdere analyse30. Deze omvatten een subset van niet-lerende muizen (6/54 muizen, 11,1%) die vanaf het begin van de training het doel missen dat te ver van de pellet mikt of de grijpbeweging uitvoeren voordat ze zich in de juiste positie boven de pellet bevinden. Tijdens de eerste trainingsdagen voerde een andere groep de taak met hoge nauwkeurigheid uit, maar begon slecht te presteren door te ver van de pellet te richten op dag 3-4 (10/54 muizen, 18,51%). Binnen deze groep beginnen sommige muizen te trainen met behulp van een voorkeurspoot, maar veranderen hun voorkeur na een paar dagen; dit is eerder besproken door Chen et al., 201430.
De reach-to-grasp-beweging is zeer stereotiep van proef naar proef en binnen dieren (figuur 2). Het gebruik van high-speed videografie maakt het mogelijk om het traject van bewegingen te volgen, waardoor het mogelijk is om kinematica te analyseren in verschillende fasen in de controleconditie en tijdens optogenetische stimulatie (figuur 1E en figuur 2C). Deze benadering resulteert in een kwantificeerbare beoordeling van parameters zoals afgelegde afstand, snelheid, versnelling, eindpunt en traject (figuur 2 C-E). Het is mogelijk om zowel multi-reach trials te analyseren, waarbij de muis meerdere keren bereikt voordat hij de pellet ophaalt, als single-trial events, waarbij de muis de pellet in een enkele reikende beweging ophaalt. De proef is voltooid wanneer dieren de pellet wegduwen of de proef opnieuw starten door naar de achterkant van de kooi te gaan. Een kwantitatieve vergelijking van trajecten onder verschillende experimentele omstandigheden wordt bereikt met principal component analysis (PCA) gevolgd door k-means clustering (Figuur 3J-K)23,25.
Tijdens de meeste trainingssessies slagen muizen er soms niet in om de pellet te begrijpen (gemiste proeven). Sommige manipulaties veranderen het aantal gemiste proeven en dus de nauwkeurigheid van de taak. Vervolgens is het essentieel om de verschillen tussen geraakte en gemiste proeven te analyseren. In onze handen zijn gemiste proeven het gevolg van veranderingen in drie verschillende fasen van de beweging: (1) de poot wijzigt zijn traject voordat hij de kameropening passeert (initiële fout), (2) de poot wijzigt zijn traject nadat de poot de opening kruist (laatste fout) en (3) het niet verzamelen van de pellet (grijpfout) (figuur 2 I, J) 13 . Een algemeen kenmerk van gemiste proeven is dat muizen de grijpbeweging verder van de pellet (eindpunt) starten in vergelijking met hitproeven (figuur 2G). Bovendien worden missers geassocieerd met de muishouding gemeten als significante verschillen in lichaamshoek tussen geraakte en gemiste proeven (figuur 2H).
Afhankelijk van de structuur of neuronale populatie gericht met optogenetica, kan men differentiële effecten verwachten over gedrag 7,19,23,31,32,33. Het huidige protocol beschrijft de impact van het activeren van stekelige projectieneuronen (SPN's) in het striatum in contralaterale of ipsilaterale hemisferen over de voorkeurspoot die door de muis wordt gebruikt tijdens de bereikende beweging (figuur 3). Contralaterale activering van D1 dopamine-expressie SPN's, die de oorsprong geven aan de basale ganglia directe route, verminderde het grijpsucces tot 64,9±8,8% in vergelijking met controleomstandigheden (figuur 3B). Kinematische analyse laat zien dat tijdens optogenetische stimulatie het poottraject een oscillerend patroon beschreef, wat blijkt uit een toename van de afgelegde afstand tot 218,4±19,2% van de controle, wat leidt tot het onvermogen om de pellet te richten en een toename van initiële fouttype I (figuur 3F). PCA-analyse toont aan dat alle trajecten van de proeven tijdens contralaterale D1 SPN-activering gescheiden zijn in een cluster met bijna geen overlap met een controlecluster, wat wijst op een lage gelijkenis (figuur 3J-K).
Aan de andere kant leidt activering van dSAL's in de ipsilaterale zijde tot een toename van de trajectdispersie die wordt aangetoond door PCA-analyse (figuur 3K) zonder dat dit van invloed is op het bereiken van succes (120,7±23,6%, n = 4), de totale afgelegde afstand (136,3±35,5%) of de maximale snelheid tijdens de bereikende fase (117,3±10,3%) (figuur 3C), wat aangeeft dat ipsilaterale D1 SPN-activering in zekere mate het bereiktraject heeft gewijzigd zonder de gedragsuitkomst te veranderen (figuur 3G-I ). Kinematische analyse wijst op subtiele veranderingen in bewegingscontrole door ipsilaterale manipulatie. Ten slotte toont lichaamshoudingsanalyse een verschuiving in de lichaamshoek tijdens contralaterale D1SPN-activering (figuur 3L). Er wordt benadrukt dat zelfs deze eenvoudige taak veel componenten heeft die een goede bewegingsuitvoering mogelijk maken om een doel te bereiken.
Figuur 1: Experimentele opstelling. (A) Schema's van de gedragskamer. Een kamer gemaakt met acrylplaat met de volgende afmetingen in cm: 18,5 (h) x 8,5 (b) x 20 (d) met een voorraam 1 (b) x 5 (h) en een kleine plank 8,5 (b) x 4 (d). (B) Foto van LED-canule (links) en draadloze ontvanger (rechts). (C) Zijaanzicht van een muis met de geïmplanteerde LED-canule aangesloten op de ontvanger tijdens het uitvoeren van de reach-to-grab-taak (de witte pijlpunt toont de ontvanger, het sterretje toont het tandcement dat de canule vasthoudt en de lege pijlpunt toont de pellet). D) Schets van de experimentele opstelling. Twee hogesnelheidscamera's registreren het bereik in twee dimensies, terwijl een derde een panoramisch beeld van de taak verzamelde, inclusief de locatie van de muis vanuit de spiegel onder de kamer. Dieren waren vrij om hun favoriete poot te kiezen en stimulatiezijden verwijzen altijd naar de kant van de voorkeurspoot. (E) De exacte positie van de camera's en het representatieve beeld van elke camera tijdens een proef. Dit cijfer is overgenomen uit referentie23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kinematische analyse van bereikgedrag. (A) Tijdlijn van het experiment van dag-0 (d0) tot dag-25 (d25). (B) Prestaties tijdens de reach-to-grab-taak in de loop van de tijd gemeten als nauwkeurigheid van het ophalen van pellets (totaal aantal succesvolle grepen/totaal aantal proeven x 100). (C) Voorbeeld van trajecttracking van een hogesnelheidsvideo. (D) Individuele trajecten van de poot tijdens de hit and missed trials. (E) Totale afstand afgelegd door de poot tijdens de hit and missed trials. (F) Versnelling van de poot door het traject in de hit and missed trials uitgezet als afstand vs. snelheid. (G) Samenvatting van eindpuntafstand in treffers = 3,16 mm, mist 6,08 mm (Mann-Whitney-Wilcoxon testgemist vs. hit U = 4184, p<0,0001, n = 28 muizen). (H) Verschillen in lichaamshoek in de twee soorten proeven, missers = 8,4±5,3°, raakt 6,7±4° (Mann-Whitney-Wilcoxon test U = 6437, P = 0,0243, n = 28 muizen). (I) Schema's van de drie soorten fouten. (J) Verhoudingen van de drie soorten fouten die de muizen maken in controleomstandigheden. Dit cijfer is overgenomen uit referentie23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Optogenetische activering van contralaterale en ipsilaterale D1 SPN's tijdens reach-to-grasp gedrag. (A) Schema's van het stimulatieparadigma. (B) Slagingspercentage in vergelijking met niet-stimulatiestudies. (C) Verandering in afgelegde afstand ten opzichte van controleomstandigheden. (D), (G) Tweedimensionale plots van paden gemaakt door de poot met en zonder optogenetische stimulatie. E) , (H) Totale afstand afgelegd door de poot tijdens het bereiken van bewegingen. (F) , (I) Samenvatting van de verdelingen van de verschillende soorten fouten. D1 contralateraal: Beginfout of type I (controle = 18,2±11,6 %, stimulatie = 79,9±8,2 % Fisher's exacte test, p<0,0001). (J) Voorbeeld van PCA-analyse van de trajecten in controleomstandigheden in vergelijking met contralaterale activering van D1SPN's. Het gearceerde gebied vertegenwoordigt de cluster van elke aandoening en de ster is de cluster centroïde. K) Samenvatting van de overlapping tussen clusters van de verschillende experimentele omstandigheden. (L) Veranderingen in de lichaamshoek. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van optogenetische manipulatie van neuronale populaties in goed gedefinieerde gedragsparadigma's bevordert onze kennis over de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorische controle 7,23. Draadloze methoden zijn vooral geschikt voor taken die tests op meerdere dieren of vrije beweging vereisen34,35. Niettemin, naarmate technieken en apparaten worden verfijnd, zou het de go-to-optie moeten zijn voor elke gedragstaak in combinatie met optogenetica34,36.
De huidige methode heeft veel voordelen omdat geminiaturiseerde LED's een betrouwbare lichtbron met hoge intensiteit bieden en implantaten kunnen worden gebruikt in onderzoeken die gedurende meerdere dagen stimulatie vereisen. Niettemin kan het inbrengen van een optische vezel voor opsinestimulatie mechanisch hersenweefsel beschadigen, infecties en af en toe ontstekingen veroorzaken op de locatie van de canula37. Van langdurige hoogfrequente optogenetische stimulatie is aangetoond dat het warmte produceert en fototoxiteit kan veroorzaken37. Het is mogelijk om fototoxiciteit te verminderen door rood-verschoven effectoropsinen te gebruiken die worden geactiveerd met rood of zelfs nabij-infrarood licht, wat de warmteontwikkeling vermindert38.
Omdat de pinnen om de ontvanger te verbinden buiten de schedel blijven, kunnen muizen soms verplaatsing of loslating van de canule veroorzaken als tandcement niet correct wordt aangebracht; dit leidt vaak tot schade aan hersenweefsel en vermindert het aantal proefpersonen waarmee rekening moet worden gehouden voor verdere analyse. Recente ontwikkelingen hebben vezelloze optogenetica geïntroduceerd, die deeltjes gebruikt die zichtbaar licht kunnen uitzenden door up-conversie luminescentie als reactie op nabij-infrarood licht dat diep in het hersenweefsel doordringt36. Vezelloze apparaten bieden de mogelijkheid om optogenetisch te stimuleren over langere tijdframes bij vrij gedragende dieren met onmerkbare implantaten35. Dit zorgt voor ongeremde beweging, zelfs in waterdoolhoven, om meerdere dieren samen te huisvesten (om de impact van sociaal isolement te voorkomen) en om dieren in meer naturalistische omgevingen te bestuderen35,36.
Zelfs met alle voordelen die glasvezeloptogenetica biedt, wordt het nog steeds geconfronteerd met uitdagingen op het gebied van biocompatibiliteit en warmteopwekking. De efficiëntie van fotonconversie beperkt het ook. Tot slot is verdere verbetering nodig voor een hoog emissierendement 34,36.
De combinatie van dit paradigma met snelle videografie maakt kinematische analyse onder verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Dit biedt gevoelige detectie van zelfs subtiele effecten over verschillende componenten van gedrag en motorische controle. Naarmate meer analytische hulpmiddelen zich ontwikkelen, is het mogelijk om online kinematische analyse en een diepgaande karakterisering van motorisch gedrag in verschillende contexten te hebben. Een grondige kwantificering van muis bereikende bewegingskinematica is onlangs gepubliceerd door Becker et al.25.
De mogelijkheid om neuronale populaties selectief te manipuleren in vrij bewegende dieren met minimaal invasieve technieken stelt men in staat om de bijdrage van specifieke neuronale typen in precieze gedragstaken te ontleden23. De reach-to-grasp taak is een vertaalbaar paradigma voor motorisch gedrag13,19. Het is bekend dat geconserveerde hersenstructuren deelnemen aan de verschillende fasen van verwerving, leren en uitvoering van de taak 7,12,23. Het onthullen van de neurale circuits die aan dit gedrag ten grondslag liggen, zal het begrip van motorische controle vergroten. Verschillende studies benadrukken het belang van bi-hemisferische controle over unimanuele taken, vooral wanneer een hoge behendigheid nodig is 20,21,22. De kinematische analyse in combinatie met optogenetische manipulaties maakt het mogelijk om de verschillende mechanismen van dit complexe gedrag te onderzoeken. Het zou kunnen helpen om de bijdrage van sensorisch-motorische feedback in normale omstandigheden en ziektemodellen te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen onthullingen te hebben gedaan.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het UNAM-PAPIIT-project IA203520. We bedanken de IFC-dierenfaciliteit voor hun hulp bij het onderhoud van muizenkolonies en de rekeneenheid voor IT-ondersteuning, in het bijzonder aan Francisco Perez-Eugenio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
References
- Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
- MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
- Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
- Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
- Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
- Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
- Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G.
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
- Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
- Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
- Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
- Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
- d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
- Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
- Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
- Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
- Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
- Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
- Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
- Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
- Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
- Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
- Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
- Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
- Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
- Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
- Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
- Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
- Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).
