Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Trådløs optogenetisk kontroll av dyktig motorisk oppførsel

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Den nåværende protokollen beskriver hvordan du bruker trådløs optogenetikk kombinert med høyhastighets videografi i en enkelt pellets rekkevidde-til-grep-oppgave for å karakterisere nevrale kretser som er involvert i ytelsen til dyktig motorisk oppførsel hos fritt bevegelige mus.

Abstract

Finmotoriske ferdigheter er avgjørende i hverdagen og kan bli kompromittert i flere nervesystemforstyrrelser. Oppkjøpet og ytelsen til disse oppgavene krever sensorisk motorisk integrasjon og innebærer presis kontroll av bilaterale hjernekretser. Implementering av enspråklige atferdsparadigmer i dyremodeller vil forbedre forståelsen av bidraget av hjernestrukturer, som striatum, til kompleks motorisk oppførsel, da det tillater manipulering og registrering av nevral aktivitet av spesifikke kjerner i kontrollforhold og sykdom under utførelsen av oppgaven.

Siden opprettelsen har optogenetikk vært et dominerende verktøy for å forhøre hjernen ved å muliggjøre selektiv og målrettet aktivering eller hemming av nevronale populasjoner. Kombinasjonen av optogenetikk med atferdsanalyser kaster lys over de underliggende mekanismene for spesifikke hjernefunksjoner. Trådløse hodemonterte systemer med miniatyriserte lysdioder (lysdioder) tillater ekstern optogenetisk kontroll i et helt frittgående dyr. Dette unngår at begrensningene i et kablet system er mindre restriktive for dyrs oppførsel uten at det går på bekostning av lysutslippseffektiviteten. Den nåværende protokollen kombinerer en trådløs optogenetikk tilnærming med høyhastighets videografi i en enmanuell fingerferdighet oppgave å dissekere bidraget fra spesifikke nevronale populasjoner til fin motorisk oppførsel.

Introduction

Motorisk dyktig oppførsel er til stede under de fleste bevegelser utført av oss, og det er kjent for å bli påvirket i flere hjernesykdommer 1,2,3,4,5,6. Implementering av oppgaver som gjør det mulig å studere utvikling, læring og ytelse av dyktige bevegelser er avgjørende for å forstå motorfunksjonens nevrobiologiske underlag, spesielt i modeller av hjerneskade, nevrodegenerative og nevrodevelopmentale lidelser 2,7,8,9,10,11,12,13 . Å strekke seg etter og hente gjenstander gjøres rutinemessig i hverdagens handlinger, og det er en av de første motoriske ferdighetene som er oppnådd under tidlig utvikling og deretter raffinert gjennom årene 5,6. Den består av en kompleks oppførsel som krever sensoriske motoriske prosesser som oppfatningen av objektets egenskaper, bevegelsesplanlegging, handlingsvalg, bevegelsesutførelse, kroppskoordinering og hastighetsmodulering 7,14,15,16. Dermed krever enspråklige oppgaver med høy fingerferdighet deltakelse av mange hjernestrukturer på begge halvkule 16,17,18,19,20,21,22. Hos mus er den enkle pellets rekkevidde-til-grep-oppgaven preget for flere faser som kan kontrolleres og analyseres separat 7,13,23. Denne funksjonen gjør det mulig å studere bidraget fra spesifikke nevronale subpopulations på ulike stadier av oppkjøp og atferd ytelse og gir en plattform for detaljerte studier av motorsystemer 13,23,24. Bevegelsen skjer om et par sekunder; Dermed bør høyhastighets videografi brukes til kinematisk analyse i forskjellige stadier av den dyktige motorbanen 7,25. Flere parametere kan trekkes ut fra videoene, inkludert kroppsstilling, bane, hastighet og type feil25. Kinematisk analyse kan brukes til å oppdage subtile endringer under trådløs optogenetisk manipulasjon 7,23.

Ved hjelp av miniatyriserte lysdioder (lysdioder) for å levere lys via et trådløst hodemontert system gjør det mulig å ha ekstern optogenetisk kontroll mens dyret utfører oppgaven. Den trådløse optogenetiske kontrolleren godtar enkeltpuls- eller kontinuerlige utløserkommandoer fra en stimulator og sender infrarøde (IR) signaler til en mottaker som er koblet til den miniatyriserte LED23,26. Den nåværende protokollen kombinerer denne trådløse optogenetikk tilnærmingen med høyhastighets videografi av en fingerferdighet oppgave å dissekere rollen som spesifikke nevronale populasjoner under utførelsen av finmotorisk oppførsel23. Siden det er en enspråklig oppgave, tillater det å vurdere deltakelse av strukturer på begge halvkule. Tradisjonelt kontrollerer hjernen kroppsbevegelsen på en svært asymmetrisk måte; Imidlertid krever høye fingerferdighetsoppgaver nøye koordinering og kontroll fra mange hjernestrukturer, inkludert ipsilaterale kjerner og differensialbidrag av nevronale subpopulasjoner innen kjerner 10,20,21,22,23. Denne protokollen viser at subkortiske strukturer fra begge halvkule kontrollerer banen til forbenet23. Dette paradigmet kan være egnet til å studere andre hjerneregioner og modeller av hjernesykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene for dyrebruk ble utført etter lokale og nasjonale retningslinjer og godkjent av den tilsvarende institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (Institutt for cellulær fysiologi IACUC-protokollen VLH151-19). Drd1-Cre transgene hannmus27, 35-40 dager postnatal med C57BL / 6 bakgrunn ble brukt i den nåværende protokollen. Mus ble holdt under følgende forhold: temperatur 22±1 °C; fuktighet 55%; lysplan 12/12 t med lys av kl 19:00 og ble avventet på barseldag 21. Avvennede valper ble plassert i likekjønnede grupper på 2-5. Dyr ble plassert i statiske boliger med mikrobarrieretopper. Sengetøy besto av sterile aspenspon. Gnagerpellets og RO-renset vann ble gitt ad libitum, unntatt når det er notert.

1. Kirurgiske prosedyrer

  1. Forbered en LED-kanyle i ønsket lengde i henhold til dorsoventralkoordinatene til interessestrukturen (ideelt 0,5 mm lengre for å ta hensyn til tykkelsen på skallen, for det dorsolaterale striatum 3,5 mm) (figur 1).
    1. Klipp glassfiberen til en lengde lenger enn den endelige ønskede størrelsen, slip fiberspissen til mållengden med grovt sandpapir, og til slutt polere fiberspissen med fint sandpapir.
      MERK: LED-kanylen er en optisk glassfiber med en diameter på 250 μm festet til en infrarød mottaker (se Materialbord).
  2. Trekk glasspipetter (1,14 mm ytre diameter, 0,53 mm indre diameter og 3,5 tommer) for nanoinjektoren med en horisontal trekker (se Materialbord) og oppbevar dem til senere. Programmertrekkeren i en løkke for å få en 15-20 μm spissdiameter med en lang gradvis hellingskone (4-5 mm).
  3. Forbered operasjonsområdet ved å desinfisere stereotoksisk apparat, hette, mikroinjektor (se Materialbord) og omkringliggende overflater med 70% etanol grundig.
    MERK: Et stereotaxisk museapparat er avgjørende for å injisere Adeno Associated Virus (AAVs) nøyaktig og plassere LED-kanylen i interesseområdet.
  4. Bruk riktig personlig verneutstyr til prosedyren, inkludert en ren labfrakk eller engangs kirurgisk kjole, sterile hansker, ansiktsmaske og engangshodehette.
  5. Plasser nødvendig utstyr nær operasjonsområdet, for eksempel sterile kirurgiske verktøy, bomullsspisser, løsninger, mikropipette, pipettespisser, kapillærer, mikrofyll med mineralolje og markør.
  6. Fyll en pipette for mikroinjeksjoner med mineralolje og legg den i mikroinjektoren. Kontroller at mikroinjektoren fungerer som den skal ved å kaste ut mineralolje.
    MERK: Alle instrumenter som brukes under operasjonen skal autoklaveres og sterile. Aseptisk teknikk bør brukes.
  7. Bedøv dyr med gassformige isofluran 4-5% for å indusere anestesi og 1,2% gjennom hele operasjonen med 0,5-1 l / min rent oksygen. Operasjonen begynner først etter at dyret har nådd et punkt av dyp anestesi, vurdert ved fravær av poteuttak etter en liten klype.
    1. Overvåk kontinuerlig dyrets pustehastighet og temperatur. Opprettholde kroppstemperaturen med en varmepute satt til 34 °C.
  8. Påfør en oftalmisk salve. Fjern hår fra hodebunnen med en trimer og hårfjerningskrem. Tørk hodebunnen med bomullspinne som har 8% povidon-jod (se Materialtabell) og 70% etanol vekslet tre ganger hver.
  9. Plasser musen i det stereotaktiske apparatet og fest hodet, og sørg for at skallen er nivellert i middelmådige og fremre bakre akser.
  10. Lag et 1 cm snitt med en skalpell gjennom hodebunnen på øynene langs sagittalaksen. Trekk tilbake huden for å eksponere skallen og rengjør periosteum med bomullspinne.
  11. Rengjør kraniumoverflaten med saltløsning og sterile bomullspinne. Løs eventuelle blødninger på overflaten ved hjelp av sterile absorberende øyespyd (se Materialfortegnelse) eller lignende sterilt absorberende materiale.
  12. Påfør en dråpe 2,5% hydrogenperoksid med en bomullspinne og la den virke i noen sekunder for å gjøre skalle suturene synlige og ha en bedre referanse. Etter noen sekunder, rengjør grundig med en ren bomullspinne.
  13. Med glasspipetten (15 μm endelig spissdiameter), finn bregma og lambda for å kontrollere at skallen er nivellert i den fremre bakre aksen.
    MERK: Det anbefales å ha et stereoskopisk mikroskop eller USB-mikroskop for å se spissen av glasspipetten. I tilfelle det er nødvendig, juster høyden på munnholderen for å jevne skallen.
  14. Beveg kapillæren mot de valgte koordinatene for fremre posterior (AP) og medial-lateral (ML) (dorsolateral striatum AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Mal et referansepunkt i hodebunnen over de valgte koordinatene med en steril markør.
  15. I referansepunktet utfører du en kraniotomi med diameter på ~1 mm som gir skånsomt trykk på skallen med et sterilt roterende verktøy eller tannbor med lav til middels hastighet med en liten rund tannbor (se Materialtabellen).
  16. Last kapillæren med 300-400 nL Cre-avhengig adeno-assosiert virus (AAV) som AAV1-dflox-hChR-2-mCherry for å uttrykke Channelrhodopsin eller en AAV for å uttrykke bare reporterproteinet (f.eks. mCherry) som en kontroll i interesseområdet (se Tabell over materialer). Kontroller at spissen ikke er tilstoppet, og introduser deretter glasspipetten i hjernen ved de ønskede dorso-ventrale (DV) koordinatene (dorsolateral striatum DV -3,35 mm).
    1. Injiser 200 nL ved hjelp av en automatisk injektor med en hastighet på 23 nL/s. Vent i 10 minutter etter at injeksjonen er fullført, trekk glasspipetten sakte ut for å unngå søl.
      MERK: Det er mulig å bruke en 30 G kanyle til å injisere med riktig mikroinjektor.
  17. Rengjør og tørk eventuelle rester med bomullspinne.
  18. Fest den sterile LED-kanylen i glass til den stereotaktiske armen og kalibrer koordinatene ved hjelp av bregma som referanse. Sett kanylen svært sakte (300 μm/min) for å unngå vevsskade og plasser den 100 μm over injeksjonsstedet.
  19. Når LED-kanylen er på plass, legg til en dråpe (100 μL) vevslim på kanten av kraniotomien.
  20. Forbered tannsementblanding (se Materialfortegnelse) ved å følge produsentens instruksjoner for å feste fiberen til skallen.
    MERK: Bruk kort en avkjølt porselensfat for å få mer arbeidstid før sementsettene. Tilsett 2 skjeer harpiks klart pulver til porselensfatet, tilsett 4 dråper hurtigbase og 1 dråpe katalysator, og bland deretter godt. Pulver-/væskeforholdet kan justeres hvis det er behov for en tynnere eller tykkere viskositet.
  21. Bruk en steril børste, påfør tannsementblandingen rundt kanylekontakten litt etter litt, bygg lag til skallen er dekket og kontakten er sikkert festet til skallen, slik at pinnene er helt frie. Unngå å få tannsement på musens hud.
  22. La tørkingen tørke helt.
  23. Lukk huden rundt implantatet ved hjelp av vevslim (se Materialfortegnelser).
  24. Plasser musen i et gjenopprettingsbur over en varmepute ved 33 ° C. Skjerm for tilstedeværelse av ett eller flere av følgende tegn på smerte / ubehag: 1) Hunched opp, mangel eller reduksjon av motoraktivitet, 2) Unnlatelse av å stelle reflektert i en ubelagt skitten frakk, 3) Overdreven slikking eller riper, rødhet på snittstedet, 4) aggressiv oppførsel, 5) anoreksi eller dehydrering, og 6) Mangel på reirdannelse.
    MERK: Hold musen individuelt innestengt under alle prosedyrene for å unngå at implantatet løsner. Ved løsrivelse av kanylen, utfør eutanasi ved å injisere 150 mg / kg natrium pentobarbital etterfulgt av halshugging etter at dyp anestesi er nådd.
  25. Injiser subkutant (SC) meloksikam 1 mg/kg én gang daglig i tre dager etter operasjonen for å gi smertestillende midler.
  26. Vent minst 7 dager på fullstendig gjenoppretting og 14 dager for opsin uttrykk før ytterligere prosedyrer.
    MERK: Utfør en postoperativ oppfølging hver 12. time i tre dager, og sjekk deretter dyr hver dag til dagen for eutanasi på slutten av eksperimentet.

2. Rekkevidde-for-å-forstå-trening

  1. På dag 7 etter operasjonen, start matmangelprotokollen28. Vei mus i tre påfølgende dager for å bestemme gjennomsnittlig ad libitum kroppsvekt. Planlegg deretter matrestriksjoner slik at dyrene får nok næringsstoffer til å opprettholde ca. 90% og ikke mindre enn 85% kroppsvekt.
    MERK: Dette oppnås ved å gi 2,5-3 g mat daglig. Overvåk dyrs vekt daglig og score for generelt velvære observere dyrs oppførsel og utseende, for eksempel frakk og øyne utseende. Bruk systemet for poengregning for tilstandstilstand fra referanse29.
  2. Under fortrenings-, trenings- og testperiodene, gi hver mus 20 pellets (20 mg støvfrie sjokolade-smaksatte pellets) daglig (se Materialbord) (spist under oppgaven eller etter) i tillegg til standard matpellets.
  3. Tre dager før habituation sprer du 0,4 g/dyr/dag 20 mg støvfrie sjokolade-smaksatte pellets i sine hjemmebur, slik at mus blir kjent med pelletsene som tjener som belønning under rekkevidde-til-grip-oppgaven.
  4. Habituate mus ved å plassere dem 10 min i testkammeret en dag før fortrening med pellets spredt på kammergulvet (figur 1A).
  5. Tillat mat daglig etter trening og testing. Ha en lignende tidsplan hver dag.
  6. På den første dagen av pre-trening, plasser musene i rekkevidde-til-grip-kammeret og observere fra forsiden. Plasser pelletsene foran kammeret nær åpningen slik at de begynner å konsumere pelletsene. På dette stadiet har mus lov til å ta tak i pellets i noen form.
  7. På dag to av pre-trening, plasser pelletsene lenger og lenger fra åpningen til du får dem til innrykket (1 cm fra åpningen) slik at mus kan forme sin rekkevidde-til-gripe bevegelse (figur 1C).
  8. Tren mus til å løpe til baksiden av buret og gå tilbake til buråpningen for å motta neste matpellet som en strategi for å individualisere forsøk.
    MERK: Dette kan oppnås ved å vente til musen er på baksiden av buret før du plasserer en pellets i innrykket for hver prøve.
  9. Plasser pellets som skal gripes av enten høyre eller venstre pote.
    MERK: Mus begynner å bruke fortrinnsvis en pote for å forstå, som vil bli brukt de følgende dagene med trening og testing.
  10. Tren dyr i 6 dager i daglige økter som varer 20 forsøk eller til maksimalt 10 minutter går. Fra dag 2 av treningen, sett mock receiveren (dimensjoner 12 x 18 x 7 mm, 1 g, se Materialtabell), slik at mus blir vant til vekten mens de utfører oppgaven (figur 1B). Hver dag scorer antall treff og tapte forsøk.
  11. Ta opp atferd med et vanlig kamera og ta 30-60 bilder / s fra forsiden av kammeret. I tillegg kan man plassere et speil under treningskammeret i en 45° vinkel for å overvåke dyrenes holdning (figur 1D,E).
  12. For post-hoc kinematisk analyse (figur 2) monteres et høyhastighetskamera (se Materialfortegnelse) i en vinkel på 45° for å ta opp fra siden av buret. Hvis en 3D-analyse kreves, plasserer du et annet høyhastighetskamera for å ta opp i en 35° vinkel fra forsiden av kammeret; begge kameraene skal plasseres på høyre eller venstre side av buret avhengig av dyrenes sidestilthet og skal fanges opp med samme bildefrekvens og synkroniseres7 (figur 3D,E).
  13. Sett høyhastighetskameraene til 100 bilder/s med en oppløsning på 376 x 252 piksler eller mer hvis mulig. Plasser hvite Styrofoam-vegger bak sidene og baksiden av kammeret for å redusere bakgrunnen og øke kontrasten (figur 1E).
  14. På testdagen må mock-enheten skiftes ut med en infrarød mottaker for trådløs optogenetisk stimulering (figur 1B, C).
  15. Når musene begynner å nå, dreier du LED-kanylen manuelt med fjernkontrollen for å få en kontinuerlig stimulering for tiden atferden utføres og ikke lenger enn 2 s. Programmering av et automatisk stimuleringsparadigme er å foretrekke. Stimuleringsenheten utløser en LED på 470 nm (blått lys) med intensitet på spissen av 1,0 mW/mm2.
  16. Samle videoene for videre undersøkelse, inkludert scoring og kinematisk analyse.

3. Post-hoc histologisk bekreftelse

  1. Når et eksperiment er fullført, må du bekrefte viralt uttrykk og LED-kanyleplassering. Bedøv dyret med en cocktail av ketamin 100 mg/kg og xylazin 10 mg/kg. Når musen presenterer tegn på dyp anestesi (trinn 1.7), parfyme med iskald fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av 4% PFA.
  2. Fjern implantert kanyle forsiktig ved å ta tak i kontakten med tang og trekke forsiktig opp.
  3. Trekk ut og etterfiks hjernen i 24 timer i 4% PFA23.
  4. Utfør 3-10 min vasker med PBS.
  5. Klipp hjernen i 50 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotom (se Materialtabell).
  6. Monter seksjonene i lysbilder med hardt innstilte monteringsmedier med DAPI for å flekke kjerner og deksellysbilder.
  7. Etter tørking, følg seksjonene under det konfektmikroskopet og kontroller den implanterte kanyleplasseringen og uttrykket av Ch2R smeltet sammen med fluorescerende protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reach-to-grasp-oppgaven er et paradigme som er mye brukt til å studere forming, læring, ytelse og kinematikk av fin ferdighetsbevegelse under forskjellige eksperimentelle manipulasjoner. Mus lærer å utføre oppgaven om et par dager og oppnår mer enn 55% nøyaktighet når et platå etter 5 dagers trening (figur 2A, B). I likhet med det som tidligere er rapportert, utfører ikke en prosentandel av dyrene oppgaven på riktig måte (29,62%), og de bør utelukkes fra videre analyse30. Disse inkluderer en undergruppe av ikke-elevmus (6/54 mus, 11,1%) som fra begynnelsen av treningen savner målet som sikter for langt fra pelletsen eller utfører gripebevegelsen før de er i riktig posisjon over pelletsen. I løpet av de første treningsdagene utførte en annen gruppe oppgaven med høy nøyaktighet, men begynte å prestere dårlig ved å sikte for langt fra pelletsen etter dag 3-4 (10/54 mus, 18,51%). Innenfor denne gruppen begynner noen mus å trene ved hjelp av en foretrukket pote, men endrer preferanse etter noen dager; Dette har tidligere blitt diskutert av Chen et al., 201430.

Rekkevidde-til-gripe-bevegelsen er svært stereotypisk fra studie til prøve og hos dyr (figur 2). Bruken av høyhastighets videografi gjør det mulig å spore bevegelsesforløpet slik at det er mulig å analysere kinematikk i ulike faser i kontrolltilstanden og under optogenetisk stimulering (figur 1E og figur 2C). Denne tilnærmingen resulterer i en kvantifiserbar vurdering av parametere som tilbakelagt distanse, hastighet, akselerasjon, sluttpunkt og bane (figur 2 C-E). Det er mulig å analysere begge multi-reach forsøk, hvor musen når flere ganger før du henter pellet, og single-trial hendelser, hvor musen henter pellet i en enkelt nå bevegelse. Rettssaken er ferdig når dyr skyver pellet bort eller reinitiate rettssaken ved å gå til baksiden av buret. En kvantitativ sammenligning av baner under ulike eksperimentelle forhold oppnås med hovedkomponentanalyse (PCA) etterfulgt av k-midler klynger (Figur 3J-K)23,25.

Under de fleste treningsøkter klarer mus noen ganger ikke å forstå pellets (tapte forsøk). Noen manipulasjoner endrer antall tapte forsøk og dermed nøyaktigheten av oppgaven. Deretter er det viktig å analysere forskjeller mellom treff og tapte forsøk. I våre hender skyldes tapte forsøk endringer i tre forskjellige faser av bevegelsen: (1) poten endrer sin bane før den krysser kammeråpningen (innledende feil), (2) poten endrer sin bane etter at poten krysser åpningen (endelig feil), og (3) unnlatelse av å samle pellet (gripefeil) (figur 2 I,J)13 . En generell egenskap ved tapte forsøk er at mus starter gripebevegelsen lenger unna pellets (sluttpunkt) sammenlignet med treffforsøk (figur 2G). I tillegg måles bommer forbundet med musestillingen som signifikante forskjeller i kroppsvinkel mellom treff og tapte forsøk (figur 2H).

Avhengig av strukturen eller nevronpopulasjonen rettet mot optogenetikk, kan man forvente differensialeffekter over atferd 7,19,23,31,32,33. Den nåværende protokollen beskriver virkningen av å aktivere spiny projeksjonsnevroner (SPNer) i striatum i kontralaterale eller ipsilaterale halvkule om den foretrukne poten som brukes av musen under den oppnående bevegelsen (figur 3). Kontralateral aktivering av D1-dopamin som uttrykker SPNer, som gir opphav til basal ganglia direkte vei, reduserte gripesuksessen til 64,9±8,8% sammenlignet med kontrollforholdene (figur 3B). Kinematisk analyse viser at under optogenetisk stimulering beskrev potebanen et oscillatorisk mønster, vist ved en økning i den reiste avstanden til 218,4±19,2% av kontrollen, noe som førte til manglende evne til å målrette pelletsen og en økning i innledende feiltype I (figur 3F). PCA-analyse viser at alle forsøksbaner under kontralateral D1 SPN-aktivering separert i en klynge med nesten ingen overlapping med en kontrollklynge, noe som indikerer en lav likhet (figur 3J-K).

På den annen side fører aktivering av dSPNer på den ipsilaterale siden til en økning i banespredning vist ved PCA-analyse (figur 3K) uten å påvirke suksessen (120,7±23,6%, n = 4), total tilbakelagt distanse (136,3±35,5 %), eller maksimal hastighet i nåfasen (117,3±10,3 %) (figur 3C), noe som indikerer at ipsilateral D1 SPN-aktivering endret i noen grad rekkevidden til banen uten å endre atferdsresultatet (figur 3G-I ). Kinematisk analyse indikerer subtile endringer i bevegelseskontroll ved ipsilateral manipulering. Til slutt viser kroppsstillingsanalyse et skifte i kroppsvinkel under kontralateral D1SPNs aktivering (figur 3L). Det fremheves at selv denne enkle oppgaven har mange komponenter som tillater riktig bevegelsesutførelse for å oppnå et mål.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt oppsett. (A) Skjema for virkekammeret. Et kammer laget med akrylplate med følgende dimensjoner i cm: 18,5 (h) x 8,5 (w) x 20 (d) med frontvindu 1 (w) x 5 (h) og en liten hylle 8,5 (w) x 4 (d). (B) Fotografi av LED-kanyle (venstre) og trådløs mottaker (høyre). (C) Sidevisning av en mus med den implanterte LED-kanylen koblet til mottakeren mens du utfører reach-to-grasp-oppgaven (den hvite pilspissen viser mottakeren, stjernen viser tannsementen som holder kanylen, og den tomme pilspissen viser pellet). (D) Skisse av det eksperimentelle oppsettet. To høyhastighetskameraer registrerer rekkevidden i to dimensjoner, mens en tredjedel samlet en panoramautsikt over oppgaven, inkludert musens plassering fra speilet under kammeret. Dyr var frie til å velge sin foretrukne pote, og stimuleringssider refererer alltid til siden av den foretrukne poten. (E) Den nøyaktige posisjonen til kameraene og det representative bildet av hvert kamera under en prøveperiode. Dette tallet er tilpasset fra referanse23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kinematisk analyse av å nå atferd. (A) Tidslinje for eksperimentet fra dag-0 (d0) til dag-25 (d25). (B) Ytelse under rekkevidde-til-grip-oppgaven over tid målt som pelletsgjenvinningsnøyaktighet (totalt antall vellykkede grep / totalt antall forsøk x 100). (C) Eksempel på banesporing fra en høyhastighetsvideo. (D) Individuelle baner av poten under treffet og savnet forsøk. (E) Total avstand reist av poten under treffet og savnet forsøk. (F) Akselerasjon av poten gjennom banen i treffet og tapte forsøk plottet som avstand vs. hastighet. (G) Oppsummering av sluttpunktavstand i treff = 3,16 mm, bommer 6,08 mm (Mann-Whitney-Wilcoxon-testsavnet vs. hit U = 4184, s<0.0001, n = 28 mus). (H) Forskjeller i kroppsvinkel i de to typer forsøk, bommer = 8,4±5,3°, treffer 6,7±4° (Mann-Whitney-Wilcoxon test U = 6437, P = 0,0243, n = 28 mus). (I) Skjema for de tre feiltypene. (J) Proporsjoner av de tre typene feil som musene har gjort under kontrollforhold. Dette tallet er tilpasset fra referanse23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Optogenetisk aktivering av kontralaterale og ipsilaterale D1 SPNer under rekkevidde-til-grep-oppførsel. (A) Skjemaer av stimuleringsparadigmet. (B) Suksessrate sammenlignet med ikke-stimuleringsforsøk. (C) Endring i tilbakelagt avstand sammenlignet med kontrollforhold. (D), (G) Todimensjonale tomter av stier laget av poten med og uten optogenetisk stimulering. (E) , (H) Total avstand reist av poten under å nå bevegelser. (F) , (I) Sammendrag av distribusjonene av de ulike feiltypene. D1 kontralateral: Innledende feil eller type I (kontroll = 18,2±11,6 %, stimulering = 79,9±8,2 % Fishers eksakte test, p<0,0001). (J) Eksempel på PCA-analyse av banene i kontrollforhold sammenlignet med kontralateral aktivering av D1SPNer. Det skyggelagte området representerer klyngen av hver betingelse, og stjernen er klynge centroid. (K) Oppsummering av overlappingen mellom klynger av de ulike eksperimentelle forholdene. (L) Endringer i kroppsvinkel. Dette tallet er endret fra referanse23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruken av optogenetisk manipulering av nevronale populasjoner i veldefinerte atferdsparadigmer fremmer vår kunnskap om mekanismene som ligger til grunn for motorstyring 7,23. Trådløse metoder er spesielt egnet for oppgaver som krever tester på flere dyr eller fri bevegelse 34,35. Likevel, som teknikker og enheter er raffinert, bør det være go-to alternativet for enhver atferdsoppgave kombinert med optogenetikk34,36.

Den nåværende metoden har mange fordeler fordi miniatyriserte lysdioder gir en pålitelig lyskilde med høy intensitet, og implantater kan brukes i studier som krever stimulering over flere dager. Likevel kan innsetting av en optisk fiber for opsinstimulering mekanisk skade hjernevev, forårsake infeksjoner og av og til betennelse på plasseringen av kanula37. Langvarig høyfrekvent optogenetisk stimulering har vist seg å produsere varme og kan forårsake fototoksitet37. Det er mulig å redusere fototoksisitet ved å bruke rødforskyvningseffektor opsiner som aktiveres med rødt eller til og med nær infrarødt lys, noe som reduserer genereringen av varme38.

Også siden pinnene for å koble mottakeren forblir utenfor skallen, kan noen ganger mus forårsake forskyvning eller løsrivelse av kanylen hvis tannsement ikke påføres riktig; Dette fører ofte til skade på hjernevev og reduserer antall personer som skal tas i betraktning for videre analyse. Nylige utviklinger har introdusert fiberløs optogenetikk, som bruker partikler som kan avgi synlig lys gjennom opp-konvertering luminescens som svar på nær-infrarødt lys som trer dypt inn i hjernevevet36. Fiberløse enheter gir muligheten til å stimulere optogenetisk over lengre tidsrammer i fritt oppføre dyr med ubemerket implantater35. Dette gjør det mulig for uhemmet bevegelse selv i vann labyrinter, å ha flere dyr plassert sammen (for å unngå virkningen av sosial isolasjon), og å studere dyr i mer naturalistiske omgivelser35,36.

Selv med alle fordelene som fiberløs optogenetikk tilbyr, står den fortsatt overfor biokompatibilitet og varmegenereringsutfordringer. Effektiviteten av fotonkonvertering begrenser det også. Til slutt kreves ytterligere forbedring for høy utslippseffektivitet 34,36.

Kombinasjonen av dette paradigmet med høyhastighets videografi muliggjør kinematisk analyse under forskjellige eksperimentelle forhold. Dette gir sensitiv påvisning av selv subtile effekter over distinkte komponenter av atferd og motorstyring. Etter hvert som flere analytiske verktøy utvikler seg, er det mulig å ha online kinematisk analyse og en grundig karakterisering av motorisk oppførsel i forskjellige sammenhenger. En grundig kvantifisering av musen som når bevegelseskimatikere har nylig blitt publisert av Becker et al.25.

Muligheten for selektiv manipulering av nevronpopulasjoner hos fritt bevegelige dyr med minimalt invasive teknikker gjør det mulig å dissekere bidraget fra spesifikke nevrontyper i presise atferdsoppgaver23. Reach-to-grasp-oppgaven er et overførbart paradigme for motorisk oppførsel13,19. Det er kjent at konserverte hjernestrukturer deltar i de forskjellige fasene av oppkjøp, læring og ytelse av oppgaven 7,12,23. Å avsløre nevrale kretser som ligger til grunn for denne oppførselen, vil øke forståelsen av motorisk kontroll. Flere studier fremhever viktigheten av to-halvkuleferdig kontroll over enspråklige oppgaver, spesielt når høy fingerferdighet er nødvendig 20,21,22. Den kinematiske analysen kombinert med optogenetiske manipulasjoner gjør det mulig å undersøke de forskjellige mekanismene for denne komplekse oppførselen. Det kan bidra til å analysere bidraget fra sensorisk-motorisk tilbakemelding under normale forhold og sykdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen avsløringer.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av UNAM-PAPIIT-prosjektet IA203520. Vi takker IFC-dyreavdelingen for deres hjelp med vedlikehold av musekolonier og beregningsenheten for IT-støtte, spesielt til Francisco Perez-Eugenio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
  2. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
  3. MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
  4. Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
  5. Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
  6. Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
  7. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  8. Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
  9. Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
  10. Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
  11. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  12. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  13. Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
  14. Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
  15. Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
  16. Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
  17. Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
  18. d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
  19. Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
  20. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
  21. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
  22. Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
  23. Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
  24. Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
  25. Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
  26. Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
  27. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  28. Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
  29. Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  30. Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
  31. Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
  32. Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
  33. Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
  34. Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
  35. Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
  36. Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
  37. Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
  38. Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).

Tags

Nevrovitenskap utgave 177
<em>In Vivo</em> Trådløs optogenetisk kontroll av dyktig motorisk oppførsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O.,… More

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter