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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

Published: February 8, 2022 doi: 10.3791/63088
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,5, 1,2,6, 7
1School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 2Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 3Jiangsu Provincial Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 5Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 6Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 7Glycation and Diabetes Group, Mater Research Institute-The University of Queensland, Translational Research Institute

Summary

Uma concentração ótima de sacarose foi determinada para a extração de glicogênio hepático usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. A adição de uma etapa de ebulição de 10 min para inibir enzimas degradadoras de glicogênio mostrou-se benéfica.

Abstract

O glicogênio hepático é um polímero de glicose hiperramificado que está envolvido na manutenção dos níveis de açúcar no sangue em animais. As propriedades do glicogênio são influenciadas por sua estrutura. Assim, um método de extração adequado que isole amostras representativas de glicogênio é crucial para o estudo dessa macromolécula. Comparado a outros métodos de extração, um método que emprega uma etapa de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose pode minimizar o dano molecular. Com base nesse método, uma publicação recente descreve como a densidade da solução de sacarose utilizada durante a centrifugação foi variada (30%, 50%, 72,5%) para encontrar a concentração mais adequada para extrair partículas de glicogênio de uma ampla variedade de tamanhos, limitando a perda de partículas menores. Uma etapa de ebulição de 10 minutos foi introduzida para testar sua capacidade de desnaturar enzimas degradadoras de glicogênio, preservando assim o glicogênio. A menor concentração de sacarose (30%) e a adição da etapa de ebulição foram mostradas para extrair as amostras mais representativas de glicogênio.

Introduction

O glicogênio é um polímero complexo e hiperramificado de glicose encontrado em animais, fungos e bactérias1. Em mamíferos, o glicogênio hepático funciona como um tampão glicêmico, preservando a homeostase, enquanto o glicogênio muscular atua como um reservatório de glicose de curto prazo para fornecer energia diretamente2. A estrutura do glicogênio é frequentemente descrita por três níveis (mostrados na Figura 1): 1. As cadeias lineares são formadas por monômeros de glicose via ligações glicosídicas (1→4)-α, com pontos de ramificação conectados via ligações glicosídicas (1→6)-α; 2. partículas de β altamente ramificadas (~20 nm de diâmetro) que, especialmente em tecidos como o músculo esquelético, atuam como moléculas independentes de glicogênio 3,4; 3. partículas de glicogênio α maiores (até 300 nm de diâmetro) que consistem em unidades menores de β glicogênio, que são encontradas no fígado5, coração6 e em algumas espécies não mamíferos7. As partículas de α hepáticas de camundongos diabéticos são molecularmente frágeis, com propensão a degradar-se em partículas de β quando dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), enquanto as partículas de α de controles não-diabéticos geralmente permanecem inalteradas. Uma hipótese é que essa fragilidade possa exacerbar o pobre balanço glicêmico observado no diabetes, sendo que as partículas frágeis de α potencialmente resultam em maiores proporções da partícula β mais rapidamente degradada 8,9,10,11.

Os métodos tradicionais de extração de glicogênio utilizam as condições relativamente adversas de exposição do tecido hepático a solução alcalinaquente12 ou soluções ácidas como o ácido tricloroacético (TCA)13 ou o ácido perclórico (PCA)14. Embora eficazes em separar o glicogênio de outros componentes do tecido hepático, esses métodos inevitavelmente degradam a estrutura do glicogênio até certoponto15,16. Embora esses métodos sejam adequados para a mensuração quantitativa do conteúdo de glicogênio, eles não são ideais para estudos focados na obtenção de informações estruturais sobre o glicogênio devido a esse dano estrutural. Desde o desenvolvimento desses métodos, um procedimento de extração mais suave tem sido desenvolvido que utiliza tampão Tris frio (que inibe a degradação de glucosidase) com ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose 17,18,19. Com o pH controlado em ~8, este método não submete o glicogênio à hidrólise ácida ou alcalina observada em procedimentos anteriores.

A ultracentrifugação do gradiente de densidade de sacarose do tecido hepático homogeneizado pode separar as partículas de glicogênio da maioria do material celular. Se necessário, purificação adicional pode ser realizada por cromatografia de exclusão de tamanho preparativo, resultando na coleta de glicogênio purificado com proteínas associadas ao glicogênio anexadas20. Embora esse método, com condições mais brandas, tenha maior probabilidade de preservar a estrutura do glicogênio, é difícil evitar que alguma porção do glicogênio seja perdida no sobrenadante, especialmente partículas menores de glicogênio e menos densas15. Outra causa potencial de perda de glicogênio é que as condições mais brandas permitem alguma degradação enzimática, resultando em rendimentos de glicogênio mais baixos em comparação com métodos de extração mais severos. Pesquisas recentes relataram otimização do método de extração de glicogênio hepático para preservar a estrutura do glicogênio21. Aqui, várias concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%) foram testadas para determinar se concentrações mais baixas de sacarose minimizavam a perda de partículas menores de glicogênio. A justificativa era que a menor densidade permitiria que partículas menores e menos densas penetrassem na camada de sacarose e se agregassem no pellet com o restante do glicogênio.

Neste estudo, os métodos de extração com e sem uma etapa de ebulição de 10 min foram comparados para testar se as enzimas de degradação de glicogênio poderiam ser desnaturadas, resultando na extração de mais glicogênio que também estava livre de degradação parcial. Distribuições de tamanho molecular total e de comprimento da cadeia glicogênica foram usadas para determinar a estrutura do glicogênio extraído, semelhante a uma otimização de extração de amido publicada anteriormente22. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com detecção de índice de refração diferencial (DRI) foi utilizada para obter as distribuições de tamanho do glicogênio, que descrevem o peso molecular total em função do tamanho molecular. A eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforos (FACE) foi utilizada para analisar as distribuições de comprimento de cadeia, que descrevem o número relativo de cadeias glicosídicas de cada tamanho (ou grau de polimerização). Este trabalho descreve a metodologia de extração de glicogênio de tecidos hepáticos baseada em estudo prévio deotimização21. Os dados sugerem que o método mais adequado para preservar a estrutura do glicogênio é uma concentração de sacarose de 30% com uma etapa de ebulição de 10 min.

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Protocol

Fígados de camundongos usados para otimizar este procedimento21 eram de 12 camundongos machos BKS-DB/Nju (7,2 semanas de idade, ver Tabela de Materiais). O uso de animais foi aprovado pelo Renmin Hospital da Universidade de Wuhan Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tecidos animais

  1. Pesar fígado de camundongo (1-1,8 g de fígado inteiro de cada camundongo).
  2. Congelar rapidamente o fígado do rato em azoto líquido e armazená-lo a -80 °C.

2. Preparação do tampão e dos reagentes

  1. Preparar tampão de isolamento de glicogênio contendo 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF e 5 mM pirofosfato de sódio com água deionizada e ajustar o pH para 8.
  2. Preparar solução de sacarose a 30% (p/p) (considerada a mais ideal para o glicogénio hepático21).
  3. Preparar tampão acetato de sódio (1 M, pH 4,5), tampão ácido acético (0,1 M, pH 3,5), solução de hidróxido de sódio (0,1 M) e cianoborohidreto de sódio (1 M).
  4. Preparar a solução de 8-aminopireno-1,3,6-trissulfonato (APTS) adicionando 5 mg de APTS a 50 μL de ácido acético glacial a 15%.
  5. Preparar solução de nitrato de amónio contendo 50 mM de nitrato de amónio com azida sódica a 0,02%.

3. Extração de glicogênio (Figura 2)

  1. Transferir o tecido hepático congelado (~1 g) para um tubo de 15 mL contendo 6 mL de tampão de isolamento de glicogênio.
  2. Mantendo no gelo, homogeneizar o tecido hepático usando um homogeneizador de tecido.
  3. Transferir metade da suspensão (3 mL) para um novo tubo e ferver por 10 min (mostrando-se ideal para estudos estruturais de glicogênio21). Manter a outra metade da suspensão (3 mL) em gelo para extrair glicogênio contendo proteínas associadas que não estejam desnaturadas.
    NOTA: As amostras não fervidas devem ser sempre mantidas em gelo durante as etapas de extração de glicogênio. Se as proteínas de glicogênio não forem importantes para o estudo, toda a amostra pode passar pela etapa de ebulição de 10 min.
  4. Retire uma alíquota de 8 μL de cada tubo, mantenha as alíquotas no gelo e utilize-as para a determinação do teor de glicogénio (ver secção 4).
  5. Centrifugar a suspensão restante a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  6. Transfira os sobrenadantes para tubos de ultracentrífuga e centrifugue-os a 3,6 × 105 g por 90 min a 4 °C.
  7. Eliminar os sobrenadantes restantes e ressuspender os pellets em 1,5 mL de tampão de isolamento de glicogênio.
  8. Colocar as amostras sobre 1,5 ml de solução de sacarose a 30% em tubos de ultracentrífuga de 4 ml e centrifugar a 3,6 × 105 g durante 2 h a 4 °C.
  9. Descarte os sobrenadantes restantes e ressuspenda os pellets em 200 μL de água deionizada.
  10. Adicionar 800 μL de etanol absoluto às suspensões e misturar bem para precipitar glicogênio23,24. Conservar as misturas a -20 °C durante, pelo menos, 1 h para permitir a precipitação.
  11. Centrifugar as amostras a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C. Descarte os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 200 μL de água deionizada.
  12. Repetir este processo de precipitação de etanol 3x e ressuspender a pelota final de glicogênio em 200 μL de água deionizada.
  13. Remova uma alíquota de 8 μL de cada tubo para determinação do teor de glicogénio (ver secção 4).
  14. Congelar os sobrenadantes restantes em nitrogênio líquido e liofilizar (liofilizar) durante a noite. Conservar as amostras de glicogénio seco no congelador a -20 °C.
    NOTA: As amostras de glicogénio seco devem ser estáveis a -20 °C; no entanto, não há dados que indiquem quanto tempo duram sem mudanças estruturais.

4. Determinação do teor de glicogênio (Figura 3)

  1. Adicionar 8 μL dos sobrenadantes de glicogénio (ver secções 3.13 e 3.4), 5 μL de amiloglucosidase (3269 U/ml) e 100 μL de tampão acetato de sódio (1 M, pH 4,5) a um tubo de microcentrífuga e encher o tubo até à marca de 500 μL com água deionizada.
  2. Preparar controles que usem água deionizada em vez de amiloglucosidase.
  3. Incubar as amostras a 50 °C durante 30 minutos, mantendo os controlos no gelo.
  4. Centrifugar a 6.000 × g a 4 °C por 10 min e misturar 300 μL de cada sobrenadante resultante com 1 mL de reagente glucosidase oxidase/peroxidase (GOPOD).
  5. Construa uma curva de calibração misturando 300 μL de água denionizada contendo 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg de D-glicose com 1 mL de reagente GOPOD.
  6. Incubar as misturas a 50 °C durante mais 30 minutos.
  7. Leia a absorbância (510 nm) de cada amostra usando placas de 96 poços (150 μL por poço) usando um espectrofotômetro UV-vis.
  8. Subtrair as absorbâncias das amostras controle (sem amiloglucosidase) das absorbâncias das amostras experimentais e, em seguida, calcular o conteúdo de glicogênio com base na curva padrão D-glicose.

5. Rendimento bruto, rendimento de glicogênio e determinação da pureza

  1. Para o rendimento bruto, pesar a amostra de glicogénio liofilizado e calcular o rendimento em percentagem do tecido hepático húmido.
    NOTA: Este rendimento deve ser ajustado para corrigir as alíquotas tomadas em cada etapa do teor de glicogénio.
  2. Para a pureza do glicogénio, determinar o teor de glicogénio nos pellets finais, tal como descrito na secção 4. Calcular a pureza em percentagem do teor de glicogénio determinado em relação ao rendimento bruto (ver passo 5.1).
  3. Para o rendimento de glicogénio, determinar o teor de glicogénio das amostras homogeneizadas sem fervura e antes de qualquer centrifugação, tal como descrito no ponto 4. Calcular o rendimento de glicogénio em percentagem do teor de glicogénio nos pellets finais (ver passo 5.2) em relação ao teor de glicogénio determinado no homogeneizado inicial.

6. Análise das distribuições de comprimento de cadeia (Figura 4)

  1. Pesar 0,5 mg de glicogénio liofilizado em tubos de 1,5 ml.
  2. Adicionar 90 μL de água deionizada e 1,5 μL de azida sódica (0,04 g/mL) aos tubos.
  3. Adicionar 5 μL de tampão ácido acético (0,1 M, pH 3,5) e 2 μL de solução de isoamilase (180 U/mg) aos tubos para desramificar o glicogênio.
  4. Incubar as amostras a 37 °C durante 3 h.
  5. Adicionar 5 μL de solução de hidróxido de sódio (0,1 M) às amostras para aumentar o pH para 7,0.
  6. Congelar as amostras em nitrogênio líquido e liofilizar (liofilizar) durante a noite.
  7. Adicionar 2 μL de solução de APTS (5 mg de APTS em 50 μL de ácido acético glacial a 15%) e 2 μL de cianoborohidreto de sódio (1 M) ao glicogénio desramificado liofilizado.
  8. Centrifugar as amostras a 4.000 × g por 2 min.
  9. Incubar as amostras a 60 °C durante 3 h no escuro.
    NOTA: O tubo pode ser coberto com papel alumínio para proteger o conteúdo da luz.
  10. Adicionar 200 μL de água deionizada às amostras e agitá-las até que todo o precipitado esteja dissolvido.
  11. Centrifugar as amostras a 4.000 × g por 2 min.
  12. Alíquotas de transferência de 50 μL para microfrascos de eletroforese de carboidratos assistidos por fluoróforo (FACE) para análise.
    NOTA: Os dados são mostrados como a abundância relativa de cadeias (desramificadas) (Nde(X)) para cada grau de polimerização (DP, símbolo X).

7. Análise das distribuições moleculares de tamanho (Figura 5)

  1. Dissolver 0,5 mg de glicogênio liofilizado em nitrato de amônio 50 mM e azida sódica a 0,02% a 1 mg/mL.
  2. Incubar as amostras num termomisturador a 80 °C durante 3 h a 300 rpm.
  3. Injectar as amostras num sistema SEC utilizando uma pré-coluna e colunas de 1000 Å e 10.000 Å a 80 °C com um caudal de 0,3 ml/min (ver Tabela de Materiais). Use um detector de índice de refração para determinar o peso relativo das moléculas em cada volume de eluição.
  4. Usando padrões pullulan (PSS) com massas molares variando de 342 a 1,22 × 106, plote uma curva de calibração universal SEC para converter o tempo de eluição em Rh (raio hidrodinâmico). Expresse os dados do detector de índice de refração diferencial (DRI) como uma distribuição de peso de SEC w (log Rh) em função de Rh.

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Representative Results

Embora o procedimento descrito acima seja o mais ótimo (sacarose a 30% com a adição de uma etapa de ebulição de 10min), aqui são fornecidos dados para o glicogênio extraído através de três concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%), com e sem uma etapa de ebulição, como descrito anteriormente21. Seguindo o protocolo, a pureza, o rendimento bruto e o rendimento de glicogênio do glicogênio seco extraído por diferentes condições são apresentados na Tabela 1, reproduzida a partir de21. Não houve diferenças significativas no rendimento bruto e no rendimento de glicogênio entre os grupos extraídos com as diversas condições. Em contraste, a pureza do glicogênio foi significativamente influenciada tanto pelas concentrações de sacarose (Tabela 1, P < 0,001) quanto pela adição de uma etapa de ebulição (Tabela 1, P < 0,0001). O glicogênio com maior pureza foi extraído usando a concentração de sacarose de 30% juntamente com uma etapa de ebulição de 10 min, razão pela qual foi determinado como sendo o mais ótimo dentre as condições testadas.

Distribuições moleculares de tamanho foram utilizadas para avaliar os efeitos das diversas condições sobre o tamanho das moléculas no extrato final. Estes foram obtidos utilizando-se um sistema aquoso de SEC, conforme descrito anteriormente25. A normalização de cada distribuição para o mesmo valor máximo permitiu comparar a proporção relativa de partículas α para β de cada método, mostrada na Figura 6, reproduzida a partir de21. O Rh em que ocorre o máximo (Rh,max) e o Rh médio (Equation 1) são mostrados na Tabela 2, reproduzidos a partir de21. Moléculas de glicogênio com Rh < 30 nm foram definidas como partículas β11. O conteúdo β de partículas foi calculado como a área sob a curva (AUC) de (R h < 30 nm)/AUC (Rh total). As amostras fervidas apresentaram menores valores médios de Rh e maior teor de partículas β do que as amostras não fervidas (Tabela 2, P < 0,05). Menores concentrações de sacarose resultaram em menores Equation 1 valores e maiores teores β de partículas (Tabela 2, P <0,05). A introdução de uma etapa de ebulição também levou a menores valores de Rh,max (Tabela 2, P<0,05), enquanto a concentração de sacarose não teve efeito significativo.

As distribuições de comprimento de cadeia (CLDs) fornecem o número relativo de cadeias de cada comprimento dado (número de unidades de glicose conectadas, ou grau de polimerização), obtidas usando FACE. Os CLDs são mostrados na Figura 7, reproduzidos com dados de21. O comprimento médio do número de cadeias (ACL) foi calculado como (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (Tabela 2). As LCA das amostras não fervidas foram significativamente menores e mais variadas do que as das amostras fervidas (Tabela 2, P < 0,05). Entretanto, a concentração de sacarose não afetou significativamente as LCAs. Isso apoiou a hipótese de que ferver as amostras por 10 min como uma etapa de pré-extração preservaria a estrutura do glicogênio. O mecanismo proposto é a desnaturação de enzimas degradadoras de glicogênio.

Figure 1
Figura 1: Os três níveis da estrutura do glicogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Processo de extração do glicogênio. Passos para extrair e purificar o glicogênio do fígado de camundongo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinação do teor de glicogênio. Passos para determinar o conteúdo de glicogénio no homogeneizado hepático, glicogénio seco purificado ou solução de glicogénio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise das distribuições de comprimento de cadeia. Etapas para analisar distribuições de comprimento de cadeia por um sistema de eletroforese de carboidratos assistido por fluoróforo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise das distribuições moleculares de tamanho. Etapas para análise das distribuições de tamanho molecular por um sistema aquoso de cromatografia de exclusão de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Distribuição de peso SEC do glicogênio hepático de camundongo inteiro (não ramificado). A extração foi realizada sob diferentes condições, normalizadas para ter o mesmo máximo em w(log Rh). Cada homogeneizado de fígado foi dividido em seis volumes iguais, e o glicogênio foi extraído por 30%, 50% ou 72,5% de sacarose, fervido ou não fervido. As curvas representam a média em um dado Rh com o DP sendo fornecido em ambos os lados da linha principal (n = 4-6 com amostras com sinal insuficiente para ruído sendo removido). (A) Glicogênio extraído por 30% de sacarose, fervido ou não fervido; (B) glicogênio extraído por 50% de sacarose, fervido ou não fervido; (C) glicogênio extraído por 72,5% de sacarose, fervido ou não fervido. Este número foi adaptado de21. Abreviaturas: SEC = cromatografia de exclusão de tamanho; DP = desvio padrão; Rh = raio hidrodinâmico; w(log Rh) = distribuição de peso SEC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Distribuição do comprimento da cadeia, Nde(X), do glicogênio. A análise do comprimento de cadeia foi realizada em seis fígados, tanto fervidos quanto não fervidos, usando concentrações de 30%, 50% e 72,5% de sacarose na etapa de ultracentrifugação. Os valores de cada DP representam a média ± DP (N = 6). (A) Glicogênio extraído por 30% de sacarose, fervido ou não fervido; (B) glicogênio extraído por 50% de sacarose, fervido ou não fervido; (C) glicogênio extraído por 72,5% de sacarose, fervido ou não fervido. Este número foi adaptado de21. Abreviação: Nde(X) = distribuição do comprimento da cadeia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Rendimento bruto (%) Pureza (%) Rendimento de glicogênio (%)
30% Sacarose-c 2.1 ± 1.0a 13,1 ± 12,0b 10,7 ± 9,1a
50% Sacarose-c 1,2 ± 0,7a 23,3 ± 20,1b 10,2 ± 8,1a
72,5% Sacarose-c 1,9 ± 0,8a 9,8 ± 9,0 b 5.3 ± 2.4a
30% Sacarose-b 0,8 ± 0,4a 67,9 ± 16,8a 16,0 ± 5,1a
50% Sacarose-b 1,1 ± 0,6a 48,6 ± 16,9a 14,8 ± 7,6a
72,5% Sacarose-b 2,0 ± 0,9a 14,7 ± 12,6b 6,9 ± 3,7a
ANOVA bidirecional Sacarose: P = 0,053 Sacarose: P < 0,001 Sacarose: P = 0,034
Temperatura: P = 0,108 Temperatura: P < 0.0001 Temperatura: P = 0,116
Interação: P = 0,11 Interação: P = 0,003 Interação: P = 0,801

Tabela 1: Pureza, rendimento bruto, rendimento de glicogênio. Rendimento bruto, pureza e glicogênio para amostras de glicogênio hepático extraídas com 30%, 50% ou 72,5% de sacarose, fervidas ou não fervidas. -c foram amostras extraídas por tampão frio; -b foram amostras extraídas por fervura por 10 min. Os valores são dados como média ± desvio padrão (DP), n = 6. Diferenças nos valores com letras sobrescritas diferentes na mesma coluna são estatisticamente significativas (P < 0,05). Esta tabela foi reproduzida com permissão de21.

Equation 1 Média Rh,max β conteúdo ACL médio
30% Sacarose-c 29,4 ± 1,5b 34,9 ± 0,6a 40,9 ± 6,2%a,b 4,8 ± 0,5C
50% Sacarose-c 32,0 ± 1,1a,b 36,1 ± 0,5a 28,5 ± 3,0%b,c 5.6 ± 1.1b,c
72,5% Sacarose-c 34,3 ± 1,8a 36,2 ± 0,4a 23,7 ± 3,5%C 4,7 ± 0,9C
30% Sacarose-b 29,4 ± 1,2b 33,7 ± 3,1a 43,1 ± 5,1%a 8,6 ± 1,8a
50% Sacarose-b 30,1 ± 1,2b 34,9 ± 0,7a 36,0 ± 7,2%a,b,c 8,8 ± 1,7a
72,5% Sacarose-b 30,9 ± 3,5a,b 33,6 ± 3,5a 34,0 ± 13,1%a,b,c 7,6 ± 1,9a,b
ANOVA bidirecional Sacarose: P = 0,002 Sacarose: P = 0,442 Sacarose: P < 0,001 Sacarose: P = 0,290
Temperatura: P = 0,010 Temperatura: P = 0,032 Temperatura: P = 0,016 Temperatura: P < 0.0001
Interação: P = 0,431 Interação: P = 0,640 Interação: P = 0,441 Interação: P = 0,750

Tabela 2: Equation 1 e Rh em que ocorre o máximo (Rh,max) e o comprimento médio da cadeia (ACL). Equation 1 e Rh em que ocorre o máximo (Rh,max), β teor de partículas e comprimento médio da cadeia (ACL) do glicogênio extraído por 30%, 50% ou 72,5% de sacarose, fervido ou não fervido. -c não fervido; -b envolveu uma etapa de ebulição de 10 min. Diferenças nos valores com letras sobrescritas diferentes na mesma coluna são estatisticamente significativas (P < 0,05). Esta tabela foi reproduzida com permissão de 21. Abreviações: Rh = raio hidrodinâmico; Equation 1 = ; LCA = comprimento médio da cadeia; Rh,max = Rh em que ocorre máximo.

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Discussion

Estudos anteriores mostraram que a estrutura do glicogênio é importante por suas propriedades; Por exemplo, o tamanho molecular afeta a taxa de degradação do glicogênio10, e a distribuição do comprimento da cadeia afeta sua solubilidade26. Para entender adequadamente essas relações, é importante extrair glicogênio com um procedimento que isole, tanto quanto possível, uma amostra representativa e intacta. Os métodos tradicionais de extração utilizavam condições alcalinas quentes ou ácido frio. Embora eficazes na separação do glicogênio de outros componentes teciduais, esses métodos são quimicamente agressivos e demonstraram degradar a estrutura molecular do glicogênio27.

Desde então, foi desenvolvido um método relativamente suave que utiliza centrifugação por gradiente de densidade de sacarose17,18, permitindo a formação de glicogênio no pellet enquanto a maior parte do material celular permanece no sobrenadante. Este método é particularmente útil para o tecido hepático, sendo as partículas de glicogênio α sensíveis à hidrólise ácida28. Esse método mais brando, no entanto, possui pelo menos dois mecanismos potenciais para o isolamento de glicogênio divergindo em estrutura daquele visto in vivo: 1) partículas menores e menos densas de glicogênio são mais suscetíveis a serem deixadas no sobrenadante durante a centrifugação do gradiente de densidade de sacarose17,18, pois podem ser incapazes de alcançar a pelota; 2) As condições mais brandas podem permitir que as enzimas de degradação do glicogênio, que seriam desnaturadas nas condições mais duras de extração alcalina/ácida, continuem a degradar partículas de glicogênio durante a extração.

Uma publicação recente21 buscou ajudar a resolver esses problemas potenciais testando uma série de concentrações de sacarose (e, portanto, densidades), descobrindo que o uso de uma concentração de 30%, em oposição aos 72,5% tradicionalmente usados, ajudou a minimizar a perda de partículas menores de glicogênio. Experimentos futuros poderiam testar concentrações ainda mais baixas para ver se algumas partículas menores ainda são preferencialmente perdidas no sobrenadante durante a centrifugação. Esta publicação também testou a eficácia da introdução de uma etapa de ebulição de 10 minutos diretamente após a homogeneização do tecido para desnaturar as enzimas de degradação do glicogênio, preservando assim a estrutura do glicogênio. Foi demonstrado que esta etapa ajudou a inibir a degradação do glicogênio, com os comprimentos da cadeia de glicogênio sendo significativamente preservados. Experimentos posteriores neste estudo forneceram evidências de que esta etapa de ebulição de 10 minutos provavelmente não causaria danos significativos à estrutura do glicogênio. No entanto, essa etapa de ebulição pode influenciar a estrutura das proteínas associadas ao glicogênio, potencialmente resultando na desnaturação e subsequente dissociação das proteínas do glicogênio. Portanto, se a proteômica é de interesse, usar a baixa concentração de sacarose (30%) sem ferver (amostras mantidas em gelo) pode ser preferível, com a ressalva de que o glicogênio pode ser ligeiramente degradado.

Ao usar centrifugação por gradiente de densidade de sacarose sem experimentos adicionais de otimização, o método mais adequado é utilizar uma concentração relativamente baixa de sacarose (30%) com a introdução de uma etapa de ebulição de 10 min diretamente após a homogeneização do tecido. Existem algumas limitações dessa técnica. Primeiro, isso foi otimizado para glicogênio hepático, e é importante notar que pode não ser tão apropriado para glicogênio de outros tecidos. Em segundo lugar, como mencionado acima, a menor concentração de sacarose testada foi de 30%, e é possível que concentrações menores possam ser preferíveis. Em terceiro lugar, uma técnica otimizada que previna a degradação enzimática do glicogênio preservando o proteoma associado ainda não está disponível.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Os autores são gratos ao Sr. Gaosheng Wu e à Sra. Yunwen Zhu pela assistência técnica com a FACE e ao Sr. Zhenxia Hu e ao Sr. Dengbin pela assistência técnica com a SEC. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu, uma C1304013151101138 de bolsas da Fundação de Ciências Naturais da China e pelo programa de talentos de Inovação e Empreendedorismo de Jiangsu de 2017. As figuras 1 a 5 foram criadas usando o BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) SIGMA Aldrich 9341 0.1 M solution
Acetic acid SIGMA Aldrich 695092 0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system Agilent, Santa Clara, CA, USA Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) Megazyme K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) SIGMA Aldrich 431788
Homogenizer IKA T 25
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system Ab Sciex, US Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate SIGMA Aldrich 241245 1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide SIGMA Aldrich S2002
Sodium chloride SIGMA Aldrich S9888
Sodium cyanoborohydride SIGMA Aldrich 156159 1 M solution
Sodium fluoride SIGMA Aldrich 201154
Sodium hydroxide SIGMA Aldrich 43617 0.1 M solution
Sodium nitrate SIGMA Aldrich NISTRM8569
Sodium pyrophosphate SIGMA Aldrich 221368
Sucrose SIGMA Aldrich V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns Polymer Standards Services, Mainz, Germany Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma SIGMA Aldrich T 1503
Ultracentrifuge tubes Beckman 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm

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References

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A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio
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