Summary
Voor de extractie van leverglycogeen werd een optimale sucroseconcentratie bepaald met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. De toevoeging van een kookstap van 10 minuten om glycogeenafbrekende enzymen te remmen, bleek gunstig.
Abstract
Leverglycogeen is een hypervertakt glucosepolymeer dat betrokken is bij het op peil houden van de bloedsuikerspiegel bij dieren. De eigenschappen van glycogeen worden beïnvloed door de structuur. Daarom is een geschikte extractiemethode die representatieve glycogeenmonsters isoleert, cruciaal voor de studie van dit macromolecuul. In vergelijking met andere extractiemethoden kan een methode die gebruik maakt van een centrifugatiestap met sucrosedichtheidsgradiënt moleculaire schade minimaliseren. Op basis van deze methode wordt in een recente publicatie beschreven hoe de dichtheid van de sucrose-oplossing die tijdens het centrifugeren werd gebruikt, werd gevarieerd (30%, 50%, 72,5%) om de meest geschikte concentratie te vinden om glycogeendeeltjes van een grote verscheidenheid aan groottes te extraheren, waardoor het verlies van kleinere deeltjes werd beperkt. Er werd een kookstap van 10 minuten geïntroduceerd om het vermogen te testen om glycogeenafbrekende enzymen te denatureren, waardoor glycogeen behouden blijft. De laagste sucroseconcentratie (30%) en de toevoeging van de kookstap bleken de meest representatieve glycogeenmonsters te extraheren.
Introduction
Glycogeen is een complex, hypervertakt polymeer van glucose dat voorkomt in dieren, schimmels enbacteriën1. Bij zoogdieren functioneert leverglycogeen als een bloedglucosebuffer, waardoor de homeostase behouden blijft, terwijl spierglycogeen fungeert als een kortetermijnglucosereservoir om direct energie te leveren2. De structuur van glycogeen wordt vaak beschreven door drie niveaus (weergegeven in figuur 1): 1. Lineaire ketens worden gevormd door glucosemonomeren via (1→4)-α glycosidische bindingen, waarbij vertakkingspunten zijn verbonden via (1→6)-α glycosidische bindingen; 2. sterk vertakte β deeltjes (~20 nm in diameter) die, vooral in weefsels zoals skeletspieren, fungeren als onafhankelijke glycogeenmoleculen 3,4; 3. grotere α glycogeendeeltjes (tot 300 nm in diameter) die bestaan uit kleinere β glycogeeneenheden, die worden aangetroffen in de lever5, hart6 en in sommige niet-zoogdiersoorten7. Lever- α deeltjes van diabetische muizen zijn moleculair kwetsbaar, met de neiging om af te breken tot β-deeltjes wanneer ze worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO), terwijl α deeltjes van niet-diabetische controles over het algemeen onveranderd blijven. Een hypothese is dat deze kwetsbaarheid de slechte bloedglucosebalans bij diabetes kan verergeren, waarbij de fragiele α deeltjes mogelijk resulteren in hogere proporties van het sneller afgebroken β deeltje 8,9,10,11.
Traditionele glycogeenextractiemethoden maken gebruik van de relatief zware omstandigheden waarbij het leverweefsel wordt blootgesteld aan hete alkalische oplossing12 of zure oplossingen zoals trichloorazijnzuur (TCA)13 of perchloorzuur (PCA)14. Hoewel deze methoden effectief zijn in het scheiden van het glycogeen van andere componenten van het leverweefsel, degraderen ze onvermijdelijk de glycogeenstructuur tot op zekere hoogte15,16. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor het kwantitatief meten van het glycogeengehalte, zijn ze vanwege deze structurele schade niet ideaal voor studies die gericht zijn op het verkrijgen van structurele informatie over het glycogeen. Sinds de ontwikkeling van deze methoden is een mildere extractieprocedure ontwikkeld die gebruik maakt van koude Tris-buffer (waarvan is aangetoond dat het de afbraak van glucosidase remt) met ultracentrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt 17,18,19. Met een pH-waarde van ~8 wordt het glycogeen bij deze methode niet onderworpen aan de zure of alkalische hydrolyse die in eerdere procedures werd gezien.
Sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van gehomogeniseerd leverweefsel kan glycogeendeeltjes scheiden van het grootste deel van het celmateriaal. Indien nodig kan aanvullende zuivering worden uitgevoerd door middel van preparatieve grootte-uitsluitingschromatografie, wat resulteert in het verzamelen van gezuiverd glycogeen met aangehechte glycogeen-associërende eiwitten20. Hoewel deze methode, met mildere omstandigheden, meer kans heeft om de structuur van glycogeen te behouden, is het moeilijk om te voorkomen dat een deel van het glycogeen verloren gaat in het supernatant, vooral kleinere glycogeendeeltjes die minder dichtzijn15. Een andere mogelijke oorzaak van glycogeenverlies is dat de mildere omstandigheden enige enzymatische afbraak mogelijk maken, wat resulteert in lagere glycogeenopbrengsten in vergelijking met zwaardere extractiemethoden. Recent onderzoek meldde optimalisatie van de lever-glycogeenextractiemethode om de structuur van glycogeen te behouden21. Hier werden verschillende sucroseconcentraties (30%, 50%, 72,5%) getest om te bepalen of lagere sucroseconcentraties het verlies van kleinere glycogeendeeltjes minimaliseerden. De grondgedachte was dat de lagere dichtheid het mogelijk zou maken dat kleinere, minder dichte deeltjes de sucroselaag zouden binnendringen en zich in de pellet zouden verzamelen met de rest van het glycogeen.
In deze studie werden de extractiemethoden met en zonder een kookstap van 10 minuten vergeleken om te testen of glycogeenafbraakenzymen konden worden gedenatureerd, wat resulteerde in de extractie van meer glycogeen dat ook vrij was van gedeeltelijke afbraak. Verdelingen van de hele moleculaire grootte en de lengteverdelingen van de glycogeenketen werden gebruikt om de structuur van het geëxtraheerde glycogeen te bepalen, vergelijkbaar met een eerder gepubliceerde optimalisatie van zetmeelextractie22. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met differentiële brekingsindex (DRI)-detectie werd gebruikt om de grootteverdelingen van glycogeen te verkrijgen, die het totale molecuulgewicht beschrijven als functie van de molecuulgrootte. Fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) werd gebruikt om de ketenlengteverdelingen te analyseren, die het relatieve aantal glucosideketens van elke gegeven grootte (of mate van polymerisatie) beschrijven. Dit artikel beschrijft de methodologie voor het extraheren van glycogeen uit leverweefsels op basis van de vorige optimalisatiestudie21. De gegevens suggereren dat de methode die het meest geschikt is om de glycogeenstructuur te behouden, een sucroseconcentratie van 30% is met een kookstap van 10 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizenlevers die werden gebruikt om deze procedure te optimaliseren21 waren afkomstig van 12 mannelijke BKS-DB/Nju achtergrondmuizen (7,2 weken oud, zie de tabel met materialen). Het gebruik van dieren is goedgekeurd door het Renmin Hospital van de Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC-nummer nr. WDRM 20181113.
1 Dierlijke weefsels
- Weeg de lever van de muis af (1-1,8 g hele lever van elke muis).
- Vries de muizenlever snel in vloeibare stikstof in en bewaar deze bij -80 °C.
2. Bereiding van buffer en reagentia
- Bereid glycogeenisolatiebuffer met 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF en 5 mM natriumpyrofosfaat met gedeïoniseerd water en stel de pH in op 8.
- Bereid 30% (m/m) sucrose-oplossing (die het meest optimaal blijkt te zijn voor leverglycogeen21).
- Bereid natriumacetaatbuffer (1 M, pH 4,5), azijnzuurbuffer (0,1 M, pH 3,5), natriumhydroxideoplossing (0,1 M) en natriumcyanoborohydride (1 M).
- Bereid 8-aminopyreen-1,3,6-trisulfonaat (APTS)-oplossing door 5 mg APTS toe te voegen aan 50 μl 15% ijsazijn.
- Bereid een ammoniumnitraatoplossing met 50 mM ammoniumnitraat met 0,02% natriumazide.
3. Glycogeenextractie (figuur 2)
- Breng het ingevroren leverweefsel (~1 g) over in een buisje van 15 ml met 6 ml glycogeenisolatiebuffer.
- Houd het op ijs en homogeniseer het leverweefsel met behulp van een weefselhomogenisator.
- Breng de helft van de suspensie (3 ml) over in een nieuwe buis en kook gedurende 10 minuten (aangetoond dat dit optimaal is voor glycogeenstructuurstudies21). Bewaar de andere helft van de suspensie (3 ml) op ijs om glycogeen te extraheren dat geassocieerde eiwitten bevat die niet gedenatureerd zijn.
OPMERKING: Ongekookte monsters moeten altijd op ijs worden bewaard tijdens glycogeenextractiestappen. Als glycogeeneiwitten niet belangrijk zijn voor onderzoek, kan het hele monster de kookstap van 10 minuten ondergaan. - Verwijder een aliquot van 8 μl uit elk buisje, bewaar de aliquots op ijs en gebruik ze voor de bepaling van het glycogeengehalte (zie rubriek 4).
- Centrifugeer de resterende suspensie bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Breng de supernatanten over in ultracentrifugebuisjes en centrifugeer ze bij 3,6 × 10,5g gedurende 90 minuten bij 4 °C.
- Gooi de resterende supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 1,5 ml glycogeenisolatiebuffer.
- Breng de monsters in lagen over 1,5 ml 30% sacharoseoplossing in ultracentrifugebuisjes van 4 ml en centrifugeer ze gedurende 2 uur bij 4 °C bij 3,6 ×10,5 g .
- Gooi de resterende supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 200 μL gedeïoniseerd water.
- Voeg 800 μL absolute ethanol toe aan de suspensies en meng goed om glycogeen23,24 neer te slaan. Bewaar de mengsels gedurende ten minste 1 uur bij -20 °C om neerslag mogelijk te maken.
- Centrifugeer de monsters bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 200 μL gedeïoniseerd water.
- Herhaal dit ethanolprecipitatieproces 3x en resuspendeer de uiteindelijke glycogeenpellet in 200 μL gedeïoniseerd water.
- Verwijder een aliquot van 8 μl uit elk buisje voor de bepaling van het glycogeengehalte (zie rubriek 4).
- Vries de resterende supernatanten in vloeibare stikstof in en vriesdroog (vriesdroog) een nacht. Bewaar de droge glycogeenmonsters in de vriezer bij -20 °C.
OPMERKING: De droge glycogeenmonsters moeten stabiel zijn bij -20 °C; Er zijn echter geen gegevens om aan te geven hoe lang ze meegaan zonder structurele veranderingen.
4. Bepaling van het glycogeengehalte (figuur 3)
- Voeg 8 μl van de glycogeensupernatanten (zie rubrieken 3.13 en 3.4), 5 μl amyloglucosidase (3269 E/ml) en 100 μl natriumacetaatbuffer (1 M, pH 4,5) toe aan een microcentrifugebuisje en vul het buisje tot de 500 μl-markering met gedeïoniseerd water.
- Bereid controles voor die gedeïoniseerd water gebruiken in plaats van amyloglucosidase.
- Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 50 °C, terwijl de controles op ijs blijven.
- Centrifugeer bij 6.000 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten en meng 300 μl van elk resulterend supernatans met 1 ml glucosidaseoxidase/peroxidase (GOPOD)-reagens.
- Construeer een kalibratiecurve door 300 μL gedeïoniseerd water met 0, 10, 20, 30, 40 en 50 μg D-glucose te mengen met 1 ml GOPOD-reagens.
- Incubeer de mengsels nog eens 30 minuten bij 50 °C.
- Lees de absorptie (510 nm) van elk monster af met behulp van platen met 96 putjes (150 μL per putje) met behulp van een UV-vis-spectrofotometer.
- Trek de absorptie van controlemonsters (zonder amyloglucosidase) af van de absorptie van experimentele monsters en bereken vervolgens het glycogeengehalte op basis van de D-glucosestandaardcurve.
5. Bepaling van de ruwe opbrengst, de glycogeenopbrengst en de zuiverheid
- Weeg voor de ruwe opbrengst het gevriesdroogde glycogeenmonster en bereken de opbrengst als percentage van het natte leverweefsel.
OPMERKING: Deze opbrengst moet worden aangepast om te corrigeren voor de aliquots die in elke stap van het glycogeengehalte worden genomen. - Bepaal voor de zuiverheid van glycogeen het glycogeengehalte in de uiteindelijke pellets, zoals beschreven in rubriek 4. Bereken de zuiverheid als een percentage van het bepaalde glycogeengehalte ten opzichte van de ruwe opbrengst (zie stap 5.1).
- Bepaal voor de glycogeenopbrengst het glycogeengehalte van de gehomogeniseerde monsters zonder te koken en vóór elke centrifugatie, zoals beschreven in rubriek 4. Bereken de glycogeenopbrengst als percentage van het glycogeengehalte in de uiteindelijke pellets (zie stap 5.2) ten opzichte van het glycogeengehalte dat in het oorspronkelijke homogenaat is bepaald.
6. Analyse van ketenlengteverdelingen (figuur 4)
- Weeg 0,5 mg gevriesdroogd glycogeen af in buisjes van 1,5 ml.
- Voeg 90 μL gedeïoniseerd water en 1,5 μL natriumazide (0,04 g/ml) toe aan de buisjes.
- Voeg 5 μL azijnzuurbuffer (0,1 M, pH 3,5) en 2 μL isoamylase-oplossing (180 E/mg) toe aan de buisjes om het glycogeen te onttakken.
- Incubeer de monsters gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Voeg 5 μL natriumhydroxideoplossing (0,1 M) toe aan de monsters om de pH te verhogen tot 7,0.
- Vries de monsters in vloeibare stikstof in en vriesdroog (vriesdroog) een nacht.
- Voeg 2 μl APTS-oplossing (5 mg APTS in 50 μl 15% ijsazijn) en 2 μl natriumcyanoborohydride (1 M) toe aan het gevriesdroogde vertakte glycogeen.
- Centrifugeer de monsters bij 4.000 × g gedurende 2 minuten.
- Incubeer de monsters bij 60 °C gedurende 3 uur in het donker.
NOTITIE: De buis kan worden afgedekt met aluminiumfolie om de inhoud tegen licht te beschermen. - Voeg 200 μL gedeïoniseerd water toe aan de monsters en draai ze totdat al het neerslag is opgelost.
- Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 4.000 × g .
- Breng aliquots van 50 μl over naar fluorofoorgeassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) microflacons voor analyse.
OPMERKING: De gegevens worden weergegeven als de relatieve abundantie van (onttakte) ketens (Nde(X)) voor elke graad van polymerisatie (DP, symbool X).
7. Analyse van de verdeling van de moleculaire grootte (figuur 5)
- Los 0,5 mg gevriesdroogd glycogeen op in 50 mM ammoniumnitraat en 0,02% natriumazide bij 1 mg/ml.
- Incubeer de monsters in een thermomixer bij 80 °C gedurende 3 uur bij 300 rpm.
- Injecteer de monsters in een SEC-systeem met behulp van een voorkolom en 1000 Å en 10.000 Å kolommen bij 80 °C met een debiet van 0,3 ml/min (zie de tabel met materialen). Gebruik een brekingsindexdetector om het relatieve gewicht van moleculen bij elk elutievolume te bepalen.
- Met behulp van pullulan standaarden (PSS) met molaire massa's variërend van 342 tot 1,22 × 106, zet u een SEC universele kalibratiecurve uit om de elutietijd om te rekenen naar Rh (hydrodynamische straal). Druk de gegevens van de differentiële brekingsindex (DRI)-detector uit als een SEC-gewichtsverdeling w (log Rh) als functie van Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoewel de hierboven beschreven procedure voor de meest optimale methode is (30% sucrose met toevoeging van een kookstap van 10 minuten), worden hier gegevens verstrekt voor glycogeen dat wordt geëxtraheerd via drie sucroseconcentraties (30%, 50%, 72,5%), met en zonder kookstap, zoals eerder beschreven21. Volgens het protocol worden de zuiverheid, de ruwe opbrengst en de glycogeenopbrengst van droog glycogeen dat onder verschillende omstandigheden wordt geëxtraheerd, gegeven in tabel 1, gereproduceerd uit21. Er waren geen significante verschillen in ruwe opbrengst en glycogeenopbrengst tussen de groepen die onder de verschillende omstandigheden werden geëxtraheerd. De zuiverheid van glycogeen werd daarentegen significant beïnvloed door zowel de sacharoseconcentraties (tabel 1, P < 0,001) als door de toevoeging van een kookstap (tabel 1, P < 0,0001). Glycogeen met de hoogste zuiverheid werd geëxtraheerd met behulp van de sucroseconcentratie van 30% samen met een kookstap van 10 minuten, en daarom werd vastgesteld dat het het meest optimaal was van de geteste omstandigheden.
Moleculaire grootteverdelingen werden gebruikt om de effecten van de verschillende omstandigheden op de grootte van moleculen in het uiteindelijke extract te beoordelen. Deze werden verkregen met behulp van een waterig SEC-systeem, zoals eerder beschreven25. Door elke verdeling tot dezelfde maximumwaarde te normaliseren, kon de relatieve verhouding tussen α en β deeltjes worden vergeleken met elke methode, weergegeven in figuur 6, gereproduceerd van21. De Rh waarbij de maxima voorkomen (Rh,max) en de gemiddelde Rh (
) zijn weergegeven in tabel 2, gereproduceerd van21. Glycogeenmoleculen met Rh < 30 nm werden gedefinieerd als β deeltjes11. Het β deeltjesgehalte werd berekend als de oppervlakte onder de curve (AUC) van (R h < 30 nm)/AUC (totaal Rh). De gekookte monsters hadden lagere gemiddelde Rh-waarden en een hoger β deeltjesgehalte dan de ongekookte monsters (tabel 2, P < 0,05). Lagere sacharoseconcentraties resulteerden in lagere waarden en hogere β deeltjesgehalten (tabel 2, P <0,05). De invoering van een kookstap leidde ook tot lagere Rh,max-waarden (tabel 2, P<0,05), terwijl de sacharoseconcentratie geen significant effect had.
Ketenlengteverdelingen (CLD's) geven het relatieve aantal ketens van elke gegeven lengte (aantal verbonden glucose-eenheden of mate van polymerisatie), verkregen met behulp van FACE. De CLD's zijn weergegeven in figuur 7, gereproduceerd met gegevens van21. De getalgemiddelde ketenlengte (ACL) werd berekend als (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (Tabel 2). De ACL's van ongekookte monsters waren significant kleiner en gevarieerder dan die van de gekookte monsters (tabel 2, P < 0,05). De sucroseconcentratie had echter geen significante invloed op de ACL's. Dit ondersteunde de hypothese dat het koken van de monsters gedurende 10 minuten als een pre-extractiestap de glycogeenstructuur zou behouden. Het voorgestelde mechanisme is de denaturering van glycogeenafbrekende enzymen.
Figuur 1: De drie niveaus van glycogeenstructuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Glycogeenextractieproces. Stappen om het glycogeen uit muizenlever te extraheren en te zuiveren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bepaling van het glycogeengehalte. Stappen om het glycogeengehalte in leverhomogenaat, gezuiverd droog glycogeen of glycogeenoplossing te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van ketenlengteverdelingen. Stappen om ketenlengteverdelingen te analyseren door een fluorofoor-ondersteund koolhydraatelektroforesesysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van de verdeling van de moleculaire grootte. Stappen om de moleculaire grootteverdelingen te analyseren door een waterig grootte-uitsluitingschromatografiesysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: SEC-gewichtsverdelingen van hele (niet vervormde) muizenleverglycogeen. De extractie werd uitgevoerd onder verschillende omstandigheden, genormaliseerd om hetzelfde maximum in w(log Rh) te hebben. Elk leverhomogenaat werd verdeeld in zes gelijke volumes en glycogeen werd geëxtraheerd door 30%, 50% of 72,5% sucrose, gekookt of ongekookt. Curven geven het gemiddelde weer bij een gegeven Rh met de SD aan weerszijden van de hoofdlijn (n = 4-6 met monsters met onvoldoende signaal-ruisverhouding die worden verwijderd). (A) Glycogeen geëxtraheerd uit 30% sacharose, gekookt of ongekookt; B) glycogeen geëxtraheerd uit 50% sacharose, gekookt of ongekookt; (C) glycogeen geëxtraheerd door 72,5% sacharose, gekookt of ongekookt. Dit cijfer is aangepast van21. Afkortingen: SEC = size exclusion chromatography; SD = standaarddeviatie; Rh = hydrodynamische straal; w(log Rh) = SEC gewichtsverdeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Ketenlengteverdelingen, Nde(X), van glycogeen. Ketenlengteanalyse werd uitgevoerd op zes levers voor zowel gekookt als ongekookt met behulp van 30%, 50% en 72,5% sucroseconcentraties in de ultracentrifugatiestap. De waarden voor elke DP vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD (N = 6). (A) Glycogeen geëxtraheerd uit 30% sacharose, gekookt of ongekookt; B) glycogeen geëxtraheerd uit 50% sacharose, gekookt of ongekookt; (C) glycogeen geëxtraheerd door 72,5% sacharose, gekookt of ongekookt. Dit cijfer is aangepast van21. Afkorting: Nde(X) = kettinglengteverdeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Ruwe opbrengst (%) | Zuiverheid (%) | Glycogeenopbrengst (%) | |
| 30% Sucrose-c | 2.1 ± 1.0A | 13,1 ± 12,0b | 10.7 ± 9.1a |
| 50% Sucrose-c | 1,2 ± 0,7A | 23,3 ± 20,1ter | 10.2 ± 8.1A |
| 72,5% Sucrose-c | 1,9 ± 0,8A | 9,8 ± 9,0 b | 5.3 ± 2.4A |
| 30% Sucrose-b | 0,8 ± 0,4A | 67,9 ± 16,8A | 16,0 ± 5,1A |
| 50% Sucrose-b | 1,1 ± 0,6A | 48,6 ± 16,9A | 14,8 ± 7,6A |
| 72,5% Sucrose-b | 2,0 ± 0,9A | 14,7 ± 12,6ter | 6,9 ± 3,7A |
| Tweezijdige ANOVA | Sucrose: P = 0,053 | Sucrose: P < 0,001 | Sucrose: P = 0,034 |
| Temperatuur: P = 0,108 | Temperatuur: P < 0.0001 | Temperatuur: P = 0,116 | |
| Interactie: P = 0,11 | Interactie: P = 0,003 | Interactie: P = 0,801 |
Tabel 1: Zuiverheid, ruwe opbrengst, glycogeenopbrengst. Ruwe opbrengst, zuiverheid en glycogeenopbrengst voor leverglycogeenmonsters geëxtraheerd met 30%, 50% of 72,5% sucrose, gekookt of ongekookt. -c werden monsters genomen door middel van koude buffer; -b werden monsters genomen door 10 minuten te koken. De waarden worden gegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 6. Verschillen in waarden met verschillende superscriptletters in dezelfde kolom zijn statistisch significant (P < 0,05). Deze tabel is gereproduceerd met toestemming van21.
|
Gemiddelde Rh, max | β inhoud | Gemiddelde ACL | |
| 30% Sucrose-c | 29,4 ± 1,5miljard | 34,9 ± 0,6A | 40,9 ± 6,2%a,b | 4,8 ± 0,5c |
| 50% Sucrose-c | 32,0 ± 1,1a,b | 36,1 ± 0,5A | 28,5 ± 3,0%b,c | 5.6 ± 1.1b,c |
| 72,5% Sucrose-c | 34,3 ± 1,8A | 36,2 ± 0,4A | 23,7 ± 3,5%c | 4,7 ± 0,9c |
| 30% Sucrose-b | 29,4 ± 1,2ter | 33.7 ± 3.1a | 43,1 ± 5,1%a | 8,6 ± 1,8A |
| 50% Sucrose-b | 30,1 ± 1,2ter | 34,9 ± 0,7A | 36,0 ± 7,2%a,b,c | 8,8 ± 1,7A |
| 72,5% Sucrose-b | 30,9 ± 3,5a,b | 33,6 ± 3,5A | 34,0 ± 13,1%a,b,c | 7.6 ± 1.9a,b |
| Tweezijdige ANOVA | Sucrose: P = 0,002 | Sucrose: P = 0,442 | Sucrose: P < 0,001 | Sucrose: P = 0,290 |
| Temperatuur: P = 0,010 | Temperatuur: P = 0,032 | Temperatuur: P = 0,016 | Temperatuur: P < 0.0001 | |
| Interactie: P = 0,431 | Interactie: P = 0,640 | Interactie: P = 0,441 | Interactie: P = 0,750 |
Tabel 2: en Rh waarbij de maxima voorkomen (Rh,max) en gemiddelde kettinglengte (ACL). en Rh waarbij de maxima optreedt (Rh, max), β deeltjesgehalte en gemiddelde ketenlengte (ACL) van glycogeen geëxtraheerd door 30%, 50% of 72,5% sucrose, gekookt of ongekookt. -c ongekookt; -b betrof een kookstap van 10 minuten. Verschillen in waarden met verschillende superscriptletters in dezelfde kolom zijn statistisch significant (P < 0,05). Deze tabel is gereproduceerd met toestemming van 21. Afkortingen: Rh = hydrodynamische straal; = ; ACL = gemiddelde kettinglengte; Rh,max = Rh waarbij maxima optreedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies hebben aangetoond dat de structuur van glycogeen belangrijk is voor zijn eigenschappen; De molecuulgrootte beïnvloedt bijvoorbeeld de afbraaksnelheid van glycogeen10 en de ketenlengteverdeling beïnvloedt de oplosbaarheid26. Om deze relaties goed te begrijpen, is het belangrijk om glycogeen te extraheren met een procedure die zoveel mogelijk een representatief en onbeschadigd monster isoleert. Traditionele extractiemethoden maakten gebruik van hete alkalische omstandigheden of koud zuur. Hoewel ze effectief zijn in het scheiden van het glycogeen van andere weefselcomponenten, zijn deze methoden chemisch agressief en is aangetoond dat ze de moleculaire structuur van glycogeen aantasten27.
Sindsdien is er een relatief zachte methode ontwikkeld die gebruik maakt van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie17,18, waardoor glycogeen zich in de pellet kan vormen terwijl het grootste deel van het celmateriaal in de supernatant blijft. Deze methode is vooral nuttig voor leverweefsel, waarbij de glycogeendeeltjes α gevoelig zijn voor zure hydrolyse28. Deze mildere methode heeft echter ten minste twee mogelijke mechanismen voor de isolatie van glycogeen dat qua structuur afwijkt van wat in vivo wordt gezien: 1) kleinere, minder dichte glycogeendeeltjes zijn vatbaarder om in het supernatans achter te blijven tijdens het centrifugeren van de sucrosedichtheidsgradiënt17,18, omdat ze de pellet mogelijk niet kunnen bereiken; 2) De mildere omstandigheden kunnen ervoor zorgen dat glycogeenafbraakenzymen, die in de zwaardere alkalische/zure extractieomstandigheden zouden worden gedenatureerd, glycogeendeeltjes tijdens de extractie blijven afbreken.
Een recente publicatie21 was bedoeld om deze potentiële problemen op te lossen door een reeks sucroseconcentraties (en dus dichtheden) te testen, waarbij werd vastgesteld dat het gebruik van een concentratie van 30%, in tegenstelling tot de traditioneel gebruikte 72,5%, het verlies van kleinere glycogeendeeltjes hielp minimaliseren. Toekomstige experimenten zouden nog lagere concentraties kunnen testen om te zien of sommige kleinere deeltjes nog steeds bij voorkeur verloren gaan in het supernatans tijdens het centrifugeren. Deze publicatie testte ook de werkzaamheid van het introduceren van een kookstap van 10 minuten direct na weefselhomogenisatie om de glycogeenafbraakenzymen te denatureren, waardoor de structuur van glycogeen behouden blijft. Er werd aangetoond dat deze stap hielp de afbraak van glycogeen te remmen, waarbij de lengte van de glycogeenketen aanzienlijk behouden bleef. Verdere experimenten in deze studie leverden bewijs dat het onwaarschijnlijk was dat deze kookstap van 10 minuten significante schade aan de glycogeenstructuur zou veroorzaken. Deze kookstap kan echter de structuur van glycogeen-geassocieerde eiwitten beïnvloeden, wat mogelijk kan leiden tot denaturatie en daaropvolgende dissociatie van eiwitten van het glycogeen. Daarom, als proteomics van belang is, kan het gebruik van de lage sucroseconcentratie (30%) zonder koken (monsters die op ijs worden bewaard) de voorkeur hebben, met het voorbehoud dat het glycogeen enigszins kan worden afgebroken.
Bij het gebruik van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie zonder verdere optimalisatie-experimenten, is de meest geschikte methode het gebruik van een relatief lage concentratie sucrose (30%) met de introductie van een kookstap van 10 minuten direct na weefselhomogenisatie. Er zijn enkele beperkingen aan deze techniek. Ten eerste werd dit geoptimaliseerd voor leverglycogeen, en het is belangrijk op te merken dat het mogelijk niet zo geschikt is voor glycogeen uit andere weefsels. Ten tweede, zoals hierboven vermeld, was de laagste geteste sacharoseconcentratie 30%, en het is mogelijk dat lagere concentraties de voorkeur hebben. Ten derde is er nog geen geoptimaliseerde techniek beschikbaar die de enzymatische afbraak van glycogeen voorkomt met behoud van het bijbehorende proteoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs zijn de heer Gaosheng Wu en mevrouw Yunwen Zhu dankbaar voor technische assistentie bij FACE en de heer Zhenxia Hu en de heer Dengbin voor technische assistentie bij SEC. MAS wordt ondersteund door een Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees en de LG McCallam Est en George Weaber Trusts. Dit werk werd ondersteund door het Priority Academic Program van Jiangsu Higher Education Institutions, een beurs van de Natural Science Foundation of China C1304013151101138 en het Jiangsu Innovation and Entrepreneurship talentenprogramma 2017. Figuur 1-5 zijn gemaakt met behulp van BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
