Summary
दंत कूप में एक उपकला आबादी और मेसेनकाइमल कोशिकाएं होती हैं। उपकला आबादी को एक अलग संस्कृति माध्यम प्रदान करके विषम दंत कूप सेल आबादी से चुना गया था। उपकला कोशिकाएं बच गईं और सीरम-मुक्त माध्यम में उपनिवेशों का गठन किया।
Abstract
दंत कूप (डीएफ) को एक मौखिक मैक्सिलोफेशियल सर्जन द्वारा एक प्रभावित तीसरे दाढ़ को हटाने के दौरान काटा गया था। उपकला सेल अलगाव डीएफ फसल के दिन किया गया था। डीएफ को डीपीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था और फिर ऊतक कैंची के साथ विच्छेदित किया गया था जब तक कि ऊतक में लुगदी या स्क्विशी स्थिरता नहीं थी। एकल-कोशिका आबादी को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पैलेट किया गया था और केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम से धोया गया था। विषम सेल आबादी को एक संस्कृति पकवान में वितरित किया गया था। उपकला कोशिकाओं का चयन करने के लिए केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम का उपयोग किया गया था। संस्कृति माध्यम को दैनिक रूप से बदल दिया गया था जब तक कि कोई फ्लोटिंग मलबे या मृत कोशिकाओं को नहीं देखा गया था। उपकला कोशिकाएं सेल जनसंख्या वितरण के बाद 7-10 दिनों के भीतर दिखाई दीं। उपकला कोशिकाएं सीरम-मुक्त माध्यम में बच गईं, जबकि α-संशोधन न्यूनतम आवश्यक माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ने मेसेनकाइमल-प्रकार की कोशिकाओं के प्रसार की अनुमति दी। डीएफ दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक ऊतक स्रोत है।
इस अध्ययन का उद्देश्य मानव डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि स्थापित करना था। Periodontal स्नायुबंधन (पीडीएल) का उपयोग मानव दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए किया गया था। मानव पीडीएल से उपकला कोशिकाओं की खरीद हमेशा छोटे ऊतक की मात्रा के कारण सफल नहीं होती है, जिससे उपकला कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है। DF में PDL की तुलना में एक बड़ी मात्रा होती है और इसमें अधिक कक्ष होते हैं. डीएफ मानव दंत उपकला कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति के लिए एक ऊतक स्रोत हो सकता है। यह प्रोटोकॉल पीडीएल का उपयोग करके अलगाव विधि की तुलना में आसान और अधिक कुशल है। मानव दंत उपकला कोशिकाओं की खरीद दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के आगे के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकती है।
Introduction
दाँत गठन मौखिक उपकला 1 के invagination के साथ शुरू होता है। दांत विकास के चरण के अनुसार, मौखिक उपकला के अलग-अलग नाम हैं, जिनमें आंतरिक और बाहरी तामचीनी उपकला, ग्रीवा लूप और हर्टविग के उपकला जड़ म्यान (एचईआरएस) शामिल हैं। उपकला डिब्बे आसपास के मेसेनकाइमल कोशिकाओं के साथ संवाद करते हैं। उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन दांतों के गठन और ऊतक पुनर्जनन को विनियमित करते हैं। दंत उपकला कोशिकाओं, जैसे कि मौखिक केराटिनोसाइट्स और हर्टविग के उपकला जड़ म्यान कोशिकाओं (एचईआरएससी) की खरीद, दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन 2 के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है।
कृंतक-व्युत्पन्न दंत उपकला कोशिकाओं को उपकला संरचना से अलग किया जाता है, जैसे कि एचईआरएस। ली और उनके सहयोगियों ने 8-दिन पुराने चूहों से विकासशील दांत रोगाणुओं के एपिकल भाग की कटाई के बाद चूहे दाढ़-व्युत्पन्न HERSCs को अलग और अमर कर दिया। एचईआरएस को आवर्धन के तहत एपिकल ऊतक से अलग किया गया था। दांत विकास के चरण और उम्र को ध्यान में रखते हुए, नैतिक मुद्दों के कारण मनुष्यों से एचईआरएस की कटाई लगभग असंभव है: मानव एचईआरएस की कटाई के लिए एक छोटे बच्चे से एक विकासशील दांत रोगाणु को हटाने की आवश्यकता होती है। अपरिपक्व दांत रोगाणुओं को शायद ही कभी निकाला जाता है। मानव दंत उपकला कोशिकाओं को मसूड़े और periodontal स्नायुबंधन (पीडीएल) से अलग किया जा सकता है। उपकला संरचना-व्युत्पन्न कोशिकाएं मेसेनकाइमल घटकों के साथ दांत गठन में भाग लेती हैं और मौखिक केराटिनोसाइट्स की तुलना में दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकती हैं। उपकला सेल Malassez (ERM) के आराम HERS-व्युत्पन्न उपकला अवशेष हैं और PDL4 में कम संख्या में रहते हैं। अध्ययन PDL5 से मानव HERSCs के अलगाव की रिपोर्ट करते हैं। हालांकि, पीडीएल ऊतक से मानव एचईआरएससी की कटाई हमेशा सफल नहीं होती है क्योंकि इस स्थान में उपकला आबादी की कमी 5,6।
यद्यपि कृंतक-व्युत्पन्न HERSCs को सीरम-युक्त मीडिया 3,7 में बनाए रखा जाता है, मानव डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को सीरम-मुक्त मीडिया के साथ अन्य मानव उपकला कोशिकाओं के समान सुसंस्कृत किया जाता है, जैसे कि सामान्य मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स और सामान्य मानव मौखिक केराटिनोसाइट्स 8,9। इसका तात्पर्य कृंतक दंत उपकला कोशिकाओं और मानव दंत उपकला कोशिकाओं के बीच शारीरिक या कार्यात्मक अंतर से है। दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के बारे में तंत्र को समझना नैदानिक अनुप्रयोगों के विकास में योगदान कर सकता है, जिसमें पुनर्रोपण के दौरान periodontal reattachment, periodontal रोग में periodontal पुनर्जनन, लुगदी-डेंटिन जटिल पुनर्जनन और जैव-दांत पीढ़ी शामिल हैं। ट्रांसलेशनल अनुसंधान की विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, मानव दंत उपकला कोशिकाएं उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए कृंतक दंत उपकला कोशिकाओं की तुलना में अधिक उपयुक्त हो सकती हैं।
मानव डीएफ एक ढीला संयोजी ऊतक है और अक्सर एक प्रभावित दांत में रहता है। DF में मेसेनकाइमल अग्रदूत 10 शामिल हैं। हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, किसी भी अध्ययन ने 2021 से पहले दंत रोम से उपकला कोशिकाओं के अलगाव की सूचना नहीं दी है। ओह और यी ने 20218 में मानव डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव की सूचना दी। उपकला फेनोटाइप की पुष्टि पश्चिमी ब्लोटिंग और आकारिकी विश्लेषण द्वारा की गई थी। डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं की उत्पत्ति के विश्लेषण ने अन्य अध्ययनों के साथ समान परिणामों का प्रदर्शन किया। डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाएं न तो एंडोथेलियल थीं और न ही हेमटोपोइएटिक 5,11, और ओह और यी ने इन कोशिकाओं को डीएफ-एचईआरएससी के रूप में नामित करने का सुझाव दिया। डीएफ में पीडीएल की तुलना में एक बड़ी मात्रा होती है, और अधिक उपकला कोशिकाओं को डीएफ से अलग किया जा सकता है। यह उपकला उपनिवेशों के उद्भव को बढ़ाता है और डीएफ से उपकला कोशिकाओं की कटाई में एक उच्च सफलता दर में परिणाम देता है। यह अध्ययन दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए ऊतक स्रोत के रूप में डीएफ का उपयोग करने का सुझाव देता है।
वर्तमान अध्ययन में, एकल कोशिकाओं को पहले से वर्णित प्रक्रियाओं 10,12 के अनुसार डीएफ से अलग किया गया था। डीएफ में विषम सेल आबादी होती है, और प्रक्रिया के शुरुआती चरण में कई सेल प्रकार मौजूद हो सकते हैं। Morsczek और सहयोगियों ने DF-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को अलग किया। हमने परिकल्पना की है कि डीएफ में उपकला कोशिकाएं होती हैं और केवल उपकला कोशिकाएं सीरम-मुक्त स्थितियों के तहत जीवित रह सकती हैं। यह अध्ययन उपकला आबादी के चयन और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के निषेध के संदर्भ में मोर्सज़ेक एट अल से अलग है। चयन केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त मीडिया (एसएफएम) का उपयोग करके किया गया था, जो उपकला कोशिका प्रसार की अनुमति देता है और मेसेनकाइमल सेल प्रसार को रोकता है। यह अध्ययन Oh और Yi8 की एक रिपोर्ट से उत्पन्न हुआ। इस अध्ययन का उद्देश्य मानव डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए उस रिपोर्ट में उपयोग की जाने वाली विधि के विवरण का वर्णन करना था।
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Protocol
इस अध्ययन को गंगडोंग में क्यूंग ही विश्वविद्यालय अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था (आईआरबी अनुमोदन सं। KHNMC 2017-06-009)।
1. DF ले लीजिए
नोट: रोगियों ने एक परिपक्व या अपरिपक्व प्रभावित तीसरे दाढ़ को हटाने के लिए सर्जरी से पहले सूचित सहमति दी। निम्नलिखित रोग वाले रोगियों को बाहर रखा गया था: मधुमेह, उच्च रक्तचाप, तपेदिक, हेपेटाइटिस, अधिग्रहित इम्यूनोडेफिशिएंसी सिंड्रोम। गर्भवती महिलाओं को भी बाहर रखा गया था।
- प्रभावित तीसरे दाढ़ (चित्रा 1 ए) के सर्जिकल निष्कर्षण के दौरान फसल डीएफ।
नोट: सर्जरी एक मौखिक मैक्सिलोफेशियल सर्जन द्वारा की गई थी। ऊतक संग्रह के लिए एक दंत चिकित्सक के साथ सहयोग की आवश्यकता होती है। - उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 3% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ ड्यूलबेको के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) में DF स्टोर करें। DF फसल के दिन अलगाव प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें (चित्रा 1B)।
2. DF से एकल सेल आबादी को अलग करें
- DPBS में कोलेजनेस प्रकार I और प्रोटीज के स्टॉक समाधान तैयार करें ताकि कोलेजेनेस प्रकार I और प्रोटीज की अंतिम सांद्रता क्रमशः 1 mg/mL और 2.4 mg/mL हो।
- प्रति ट्यूब DPBS के 20 mL के साथ तीन 50 mL वॉशिंग ट्यूब तैयार करें। ट्यूबों को 1, 2, और 3 के रूप में लेबल करें।
- वॉशिंग ट्यूबों में डीएफ को क्रमिक रूप से धोएं। चिमटी के साथ डीएफ पकड़ो और ट्यूब 1 में डीएफ जगह. ट्यूब 1 से डीएफ निकालें और इसे ट्यूब 2 में रखें। ट्यूब 2 से डीएफ को बाहर निकालें और इसे ट्यूब 3 में रखें। धीरे से प्रत्येक ट्यूब में डीएफ 10-15 बार हिला. तीन बार धोने के बाद, डीएफ को 60 मिमी संस्कृति पकवान (चित्रा 2 ए) में रखें।
- ऊतक कैंची के साथ डीएफ कीमा (चित्रा 2 बी)। ऊतक हानि को कम करने के लिए संस्कृति पकवान में केवल एक छोटा सा हिस्सा स्थानांतरित करें। काटने को तब तक दोहराएं जब तक कि डीएफ में लुगदी या स्क्वीशी उपस्थिति न हो (चित्रा 2 सी)।
- क्रमशः 1 मिलीग्राम / एमएल और 2.4 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोलेजेनेस प्रकार I और 1 एमएल प्रोटीज समाधान के 1 एमएल को मिलाएं।
- कीमा बनाया हुआ DF को चरण 2.5 से 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। धीरे से हिलाओ और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए ट्यूब incubate.
- ट्यूब में 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें, हिलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
- केराटिनोसाइट मध्यम तैयार करें जिसमें केराटिनोसाइट एसएफएम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) होता है। एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में केराटिनोसाइट माध्यम के 3 एमएल जोड़ें। इस ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 μm छलनी जगह और एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करने के लिए कदम 2.6 से supernatant aspirate और यह छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए।
नोट: supernatant लेने के दौरान पचे हुए ऊतक अवशेषों के निगमन को कम से कम करें। विफलता को कम करने के लिए एक 40 μm छलनी के साथ ऊतक अवशेष निकालें। ऊतक अवशेष 70 μm उपभेदों के माध्यम से पारित हो सकते हैं और कॉलोनी के गठन में बाधा डाल सकते हैं। केराटिनोसाइट माध्यम में FBS एंजाइमों को निष्क्रिय कर देगा। - चरण 2.7 और 2.8 को दोहराएँ।
- एकत्रित निलंबन को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 288 × ग्राम पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें.
नोट: छर्रेदार कोशिकाओं के किसी भी आकस्मिक निष्कासन से बचने के लिए सावधान रहें, जो ज्यादातर अदृश्य हैं। - केराटिनोसाइट एसएफएम के 3 एमएल जोड़ें और चरण 2.11 के रूप में सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ 1 एमएल पिपेट के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
- केराटिनोसाइट एसएफएम का उपयोग करके एकल-सेल आबादी को 60 मिमी संस्कृति पकवान में प्लेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के एक humidified वातावरण में 5 mL की अंतिम मात्रा के साथ संस्कृति पकवान बनाए रखें। संस्कृति माध्यम को दैनिक रूप से बदलें जब तक कि कोई ऊतक या सेल मलबे का पालन नहीं किया जाता है।
नोट:: माध्यम को बदलकर संस्कृति माध्यम में फ़्लोटिंग मलबे निकालें। ऊतक मलबे या मृत कोशिकाओं को हटाने में देरी से प्राथमिक संस्कृति पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। - उपकला कोशिकाओं के विकास की जांच करने के लिए चरण 2.13 से प्लेट की जांच करें (चित्र 3 ए)।
नोट: उपकला कोशिकाएं एकल-सेल आबादी को चढ़ाना के बाद 7-10 दिनों के भीतर बढ़ती हैं। - उपकला उपनिवेशों का विस्तार करें और कोशिकाओं को उपसंस्कृति दें।
- माध्यम aspirate और केराटिनोसाइट SFM के 3 mL के साथ एक बार संस्कृति प्लेट के नीचे धोना।
- सेल पृथक्करण प्रोटीज के 2 एमएल जोड़ें और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के ह्यूमिडिफाइड वातावरण में इनक्यूबेट करें।
नोट:: कक्ष टुकड़ी प्रभावी नहीं है, तो चरण 2.15.2 को दोहराएँ। - संस्कृति प्लेट में केराटिनोसाइट माध्यम के 2 एमएल जोड़ें और सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट:: अधिक केराटिनोसाइट माध्यम जोड़ना आवश्यक नहीं है यदि चरण 2.15.2 दोहराया जाता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 288 × जी पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
- supernatant निकालें और केराटिनोसाइट SFM के 3 mL के साथ दो बार सेल गोली धोएं।
- केराटिनोसाइट एसएफएम (10 मिलीलीटर प्रति 100 मिमी डिश की अंतिम मात्रा) का उपयोग करके 100 मिमी संस्कृति डिश में कोशिकाओं को प्लेट करें।
- एक तरल नाइट्रोजन टैंक में सेल स्टॉक तैयार करें और स्टोर करें।
- 2.15.1-2.15.5 चरणों में वर्णित के रूप में हार्वेस्ट कक्षों।
- ठंड माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को क्रायोवियल्स में वितरित करें (80% केराटिनोसाइट एसएफएम, 10% डाइमिथाइलसल्फोक्साइड, 10% एफबीएस)।
- शीशियों को एक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और उन्हें 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- शीशियों को डीप फ्रीजर से तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
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Representative Results
DF कटाई
सर्जरी एक मौखिक मैक्सिलोफेशियल सर्जन द्वारा की गई थी। मानव-व्युत्पन्न सामग्री, जिसमें दांत का टुकड़ा, मसूड़े के ऊतक और डीएफ शामिल हैं, एक सर्जन (चित्रा 1 ए) द्वारा एकत्र किए गए थे। DF दांत के टुकड़े से जुड़ा हो सकता है। एक मौखिक मैक्सिलोफेशियल सर्जन डीएफ की पहचान करने में सक्षम होगा। ऊतक संग्रह के लिए सर्जन के साथ सहयोग और संचार की आवश्यकता होती है। डीएफ एक अनियमित आकार का झिल्ली जैसा ऊतक है। मसूड़े के ऊतक में एक केराटिनाइज्ड सतह होती है और इसे डीएफ से अलग किया जा सकता है। लुगदी ऊतक लुगदी कक्ष में रहता है और सर्जरी के दौरान शायद ही कभी दांतों से अलग होता है। डीएफ को उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 3% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीपीबीएस में संग्रहीत किया गया था (चित्रा 1 बी)।
DF के यांत्रिक उपचार
डीपीबीएस के साथ डीएफ को धोकर ऊतक के मलबे और रक्त को हटा दिया गया था। धोने के समाधान के साथ तीन शंक्वाकार ट्यूब तैयार किए गए थे। धोने के बाद, डीएफ को 60 मिमी या 100 मिमी संस्कृति पकवान (चित्रा 2 ए) पर स्थानांतरित कर दिया गया था। डीएफ को कैंची के साथ कीमा बनाया जाना चाहिए जब तक कि ऊतक में लुगदी या मशकी उपस्थिति न हो (चित्रा 2 बी, सी)।
उपकला जनसंख्या का उद्भव
विषम सेल आबादी चढ़ाना के बाद, कई कोशिकाएं और छोटे मलबे संस्कृति माध्यम में तैरते हैं। क्रमिक मध्यम परिवर्तनों के साथ फ्लोटिंग कोशिकाओं की संख्या धीरे-धीरे कम हो गई। विलंबित मध्यम परिवर्तन एक टर्बिड संस्कृति वातावरण का कारण बन सकता है। प्रारंभिक चरण में, विभिन्न सेल प्रकार संस्कृति पकवान के तल पर दिखाई देते हैं, लेकिन केराटिनोसाइट एसएफएम में बनाए रखने पर गायब हो जाते हैं। उपकला आकृति विज्ञान वाली कोशिकाएं एकल-कोशिका आबादी को चढ़ाने के बाद 7-10 दिनों के भीतर दिखाई देती हैं (चित्रा 3 ए)। उपकला कोशिकाओं के उद्भव के समय कोबलस्टोन के आकार की कोशिकाओं की संख्या 1 से 10 तक होती है, जो समय के साथ उपनिवेशों में फैलती है (चित्रा 3 बी)।
सेल पृथक्करण को बढ़ावा देने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ डीएफ संपर्क क्षेत्र को बढ़ाने के लिए मिंसिंग प्रक्रिया को दोहराया गया था। बरकरार डीएफ की तुलना में डीएफ लुगदी से अधिक एकल कोशिकाओं को काटा गया था। डीएफ लुगदी की चिपचिपाहट ने उपकला कोशिकाओं के अलगाव की सफलता की संभावना का संकेत दिया। दैनिक मध्यम परिवर्तनों ने केराटिनोसाइट एसएफएम को टर्बिड बनने से रोक दिया, जो उपकला कोशिका अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है।
चित्रा 1: मानव व्युत्पन्न सामग्री। (ए) मानव-व्युत्पन्न सामग्री को एक मौखिक मैक्सिलोफेशियल सर्जन द्वारा एकत्र किया गया था। पीला तीर DF को इंगित करता है। काले तीर दांत के टुकड़े और दांत से जुड़े नरम ऊतक को इंगित करते हैं। (बी) डीएफ को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में संग्रहीत किया गया था। अलगाव प्रक्रियाओं को संग्रह के 24 घंटे के भीतर किया गया था। संक्षेप: DF = दंत कूप; PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: दंत रोम का उपचार। (ए) डीएफ को तीन बार डीपीबीएस के साथ धोने के बाद 60 मिमी संस्कृति डिश में स्थानांतरित कर दिया गया था। (बी) डीएफ को ऊतक कैंची के साथ कीमा बनाया गया था। (सी) कीमा बनाया हुआ डीएफ एक लुगदी या mushy उपस्थिति थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: उपकला कोशिकाओं का उद्भव(ए) उपकला आकृति विज्ञान वाली कोशिकाएं एकल-कोशिका आबादी को चढ़ाने के बाद 7-10 दिनों के भीतर दिखाई देती हैं। (बी) उपसंस्कृति द्वारा डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं का पूर्व विवो विस्तार। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: DF = दंत कूप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं. एकल-कोशिका आबादी की कटाई डीएफ से उपकला कोशिकाओं के सफल अलगाव के लिए आवश्यक है। हमने अपनी परिकल्पना के आधार पर डीएफ से उपकला कोशिकाओं को अलग करने की मांग की कि डीएफ में अधिक उपकला कोशिकाएं हैं। mincing प्रक्रिया टुकड़ी और DF से कोशिकाओं की रिहाई को बढ़ाता है. मिंसिंग प्रक्रिया में सुधार किया गया था, और जब तक कि डीएफ एकल कोशिकाओं की रिहाई की सुविधा के लिए लुगदी दिखाई नहीं देता, तब तक मिंसिंग को दोहराया गया था। एकल कोशिकाओं की अधिकतम संख्या प्राप्त करने से उपकला आबादी के उद्भव की संभावना बढ़ जाती है। संदूषण अक्सर डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के दौरान होता है। 40 μm strainers का उपयोग एकल-सेल आबादी में ऊतक मलबे के समावेश को कम करता है, क्योंकि ऊतक अवशेष 70 μm उपभेदों से गुजर सकते हैं और उपकला सेल उपनिवेशीकरण को रोक सकते हैं।
उपकला कोशिकाएं मेसेनकाइमल कोशिकाओं की तुलना में कुछ वातावरणों के लिए अधिक संवेदनशील लगती हैं, और संस्कृति माध्यम के दैनिक परिवर्तन ने उपकला आबादी के उद्भव के लिए एक स्वच्छ वातावरण भी प्रदान किया। लगातार मध्यम परिवर्तन के कारण कोशिकाओं को खोना इस प्रोटोकॉल की एक सीमा हो सकती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए समस्या निवारण के बाद माध्यम का दैनिक परिवर्तन किया गया था, और परिणामस्वरूप, उपकला कोशिकाएं दिखाई दीं और विस्तारित हुईं। मध्यम परिवर्तन में देरी संस्कृतियों को प्रभावित कर सकती है। जैसा कि सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सेल पैलेट लगभग अदृश्य है, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की संकीर्ण नोक सेल पैलेट को खोए बिना supernatant हटाने की आसानी को बढ़ाती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने का सुझाव देता है।
डीएफ पीडीएल की तुलना में ऊतक की एक बड़ी मात्रा और अधिक एकल कोशिकाएं प्रदान करता है। इसलिए, मानव दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए ऊतक स्रोत के रूप में पीडीएल के बजाय डीएफ का उपयोग किया जा सकता है। डीएफ में सेल प्रकारों का चयन और निषेध केवल एक चयनात्मक संस्कृति माध्यम के माध्यम से किया जा सकता है। एसएफएम उपकला विकास को प्रेरित करता है, जबकि सीरम युक्त माध्यम मेसेनकाइमल कोशिकाओं के लिए चयन करता है। यह पद्धति मानव दंत उपकला कोशिकाओं तक आसान पहुंच की अनुमति देती है। Morsczek और सहयोगियों ने पहले DF-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल अग्रदूतों को अलग कर दिया था। यह अध्ययन उपकला आबादी के चयन और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के निषेध से उनके से अलग है।
दांतों के गठन के दौरान दंत उपकला कोशिकाओं की नियामक भूमिका दंत चिकित्सा अनुसंधान में बहुत रुचि रखती है। दांतों के विकास के दौरान उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन का अध्ययन नैदानिक समस्याओं के समाधान के लिए सुराग का सुझाव दे सकता है13। उपकला और मेसेनकाइमल घटकों के संयोजन से ऊतक पुनर्जनन का प्रयास किया गया है14. दंत उपकला सेल-व्युत्पन्न कारक, जैसे कि एक तामचीनी मैट्रिक्स व्युत्पन्न, का मूल्यांकन चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में किया गया है, जो पीरियडोंटल पुनर्जनन, लुगदी-डेंटिन जटिल पुनर्जनन, और पीरियडोंटल रीअटैचमेंट 2,15 के उद्देश्य से लक्षित है। स्टेम कोशिकाओं, उपकला-मेसेनकाइमल सेल शीट, सेल-व्युत्पन्न कारकों और बायोमैटेरियल्स सहित पुनर्जनन कारकों का संयोजन, दांतों के नुकसान या एजेनेसिस 16 के मामले में जैव-दांत उत्पन्न कर सकता है। दांत एजेनेसिस से जुड़े जीन, जैसे कि PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR, और WNT10A जीन, उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन 17 के लिए संभावित उम्मीदवार प्रमुख नियामक जीन हैं। इसके अलावा, दांत एजेनेसिस से जुड़े अध्ययनों से अगली पीढ़ी की अनुक्रमण विधि-व्युत्पन्न डेटा इसी तरह दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के दौरान आणविक नियंत्रण को विनियमित करने वाले उपन्यास लक्ष्य जीन का प्रस्ताव कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को कोरियाई सरकार (NRF-2017R1C1B2008406 और NRF-2021R1F1A1064350) द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (NRF) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। डॉ ही-येओन बे ने कृपया प्राथमिक संस्कृति के लिए डीएफ प्रदान किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
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