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Biology

Aislamiento de células epiteliales del folículo dental humano

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63104
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Conservative Dentistry, Kyung Hee University Dental Hospital at Gangdong, 2Department of Conservative Dentistry, School of Dentistry, Kyung Hee University

Summary

El folículo dental contiene una población epitelial y células mesenquimales. La población epitelial se seleccionó de la población heterogénea de células del folículo dental proporcionando un medio de cultivo distinto. Las células epiteliales sobrevivieron y formaron colonias en un medio libre de suero.

Abstract

El folículo dental (DF) fue cosechado durante la extracción de un tercer molar impactado por un cirujano maxilofacial oral. El aislamiento epitelial de células se realizó el día de la cosecha de DF. El DF se lavó tres veces con DPBS y luego se diseccionó con tijeras de tejido hasta que el tejido tuvo una consistencia pulposa o blanda. Las poblaciones unicelulares se granularon por centrifugación y se lavaron con medio libre de suero de queratinocitos. Las poblaciones celulares heterogéneas se distribuyeron en un plato de cultivo. Se utilizó un medio libre de suero de queratinocitos para seleccionar las células epiteliales. El medio de cultivo se cambiaba diariamente hasta que no se observaban restos flotantes ni células muertas. Las células epiteliales aparecieron dentro de los 7-10 días posteriores a la distribución de la población celular. Las células epiteliales sobrevivieron en medio libre de suero, mientras que el medio esencial mínimo de modificación α suplementado con un 10% de suero bovino fetal permitió la proliferación de células de tipo mesenquimal. El DF es una fuente de tejido para el aislamiento de las células epiteliales dentales.

El propósito de este estudio fue establecer un método para el aislamiento de células epiteliales de DF humana. El ligamento periodontal (PDL) se utilizó para el aislamiento de las células epiteliales dentales humanas. La obtención de células epiteliales de PDL humano no siempre es exitosa debido al pequeño volumen de tejido, lo que lleva a un bajo número de células epiteliales. DF tiene un volumen mayor que PDL y contiene más células. La DF puede ser una fuente de tejido para el cultivo primario de células epiteliales dentales humanas. Este protocolo es más fácil y eficiente que el método de aislamiento que utiliza PDL. La obtención de células epiteliales dentales humanas puede facilitar estudios adicionales de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales.

Introduction

La formación de los dientes comienza con la invaginación del epitelio oral1. De acuerdo con la etapa de desarrollo dental, el epitelio oral tiene diferentes nombres, incluido el epitelio del esmalte interno y externo, el asa cervical y la vaina de la raíz epitelial de Hertwig (HERS). Los compartimentos epiteliales se comunican con las células mesenquimales circundantes. Las interacciones epitelial-mesenquimal regulan la formación de dientes y la regeneración de tejidos. La obtención de células epiteliales dentales, como los queratinocitos orales y las células de la vaina de la raíz epitelial de Hertwig (HERSC), es crucial para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales2.

Las células epiteliales dentales derivadas de roedores se aíslan de la estructura epitelial, como el HERS. Li y sus colegas aislaron e inmortalizaron HERSC derivadas de molares de rata después de cosechar la porción apical de los gérmenes dentales en desarrollo de ratas de 8 días de edad3. El HERS se separó del tejido apical bajo aumento. Teniendo en cuenta la etapa de desarrollo del diente y la edad, la recolección del HERS de los humanos es casi imposible debido a cuestiones éticas: un germen dental en desarrollo debe eliminarse de un niño pequeño para cosechar el HERS humano. Los gérmenes dentales inmaduros rara vez se extraen. Las células epiteliales dentales humanas se pueden aislar de la encía y el ligamento periodontal (PDL). Las células derivadas de la estructura epitelial participan en la formación de dientes junto con los componentes mesenquimales y podrían ser más adecuadas para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales que los queratinocitos orales. Los restos de células epiteliales de Malassez (ERM) son restos epiteliales derivados de HERS y residen en pequeñas cantidades en el PDL4. Los estudios informan el aislamiento de herscs humanos de PDL5. Sin embargo, la recolección de HERSC humanos a partir de tejido PDL no siempre es exitosa debido a la escasez de la población epitelial en esta ubicación5,6.

Aunque las HERSC derivadas de roedores se mantienen en medios que contienen suero3,7, las células epiteliales humanas derivadas de DF se cultivan con medios libres de suero similares a otras células epiteliales humanas, como los queratinocitos epidérmicos humanos normales y los queratinocitos orales humanos normales8,9. Esto implica diferencias fisiológicas o funcionales entre las células epiteliales dentales de roedores y las células epiteliales dentales humanas. Comprender el mecanismo con respecto a las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales podría contribuir al desarrollo de aplicaciones clínicas, incluida la reinserción periodontal durante la replantación, la regeneración periodontal en la enfermedad periodontal, la regeneración del complejo pulpar-dentina y la generación de biontina. Teniendo en cuenta las características de la investigación traslacional, las células epiteliales dentales humanas pueden ser más apropiadas que las células epiteliales dentales de roedores para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales.

El DF humano es un tejido conectivo suelto y a menudo reside en un diente impactado. El DF contiene precursores mesenquimales10. Sin embargo, hasta donde sabemos, ningún estudio ha informado del aislamiento de las células epiteliales de los folículos dentales antes de 2021. Oh y Yi informaron el aislamiento de células epiteliales de DF humana en 20218. El fenotipo epitelial fue confirmado por western blotting y análisis morfológico. El análisis del origen de las células epiteliales derivadas de DF demostró resultados similares con otros estudios. Las células epiteliales derivadas de DF no eran ni endoteliales ni hematopoyéticas5,11, y Oh y Yi sugirieron nombrar a estas células como DF-HERSC. El DF tiene un volumen mayor que el PDL, y se pueden aislar más células epiteliales del DF. Esto mejora la aparición de colonias epiteliales y da como resultado una alta tasa de éxito en la recolección de células epiteliales de DF. Este estudio sugiere utilizar el DF como fuente de tejido para el aislamiento de las células epiteliales dentales.

En el presente estudio, se aislaron células individuales del DF según procedimientos previamente descritos10,12. El DF contiene poblaciones celulares heterogéneas, y varios tipos de células podrían estar presentes en la etapa temprana del procedimiento. Morsczek y sus colegas aislaron células madre mesenquimales derivadas de DF10. Planteamos la hipótesis de que el DF contiene células epiteliales y que solo las células epiteliales pueden sobrevivir en condiciones libres de suero. Este estudio difiere del de Morsczek et al. en cuanto a la selección de la población epitelial y la inhibición de las células mesenquimales. La selección se realizó utilizando medios libres de suero de queratinocitos (SFM), que permiten la proliferación de células epiteliales e inhiben la proliferación de células mesenquimales. Este estudio se originó a partir de un informe de Oh y Yi8. El objetivo de este estudio fue describir los detalles del método utilizado en ese informe para el aislamiento de células epiteliales de la DF humana.

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Protocol

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario Kyung Hee en Gangdong (aprobación IRB no. KHNMC 009-06-2017).

1. Recoger DF

NOTA: Los pacientes dieron su consentimiento informado antes de la cirugía para la extirpación de un tercer molar impactado maduro o inmaduro. Se excluyeron los pacientes con la siguiente enfermedad: diabetes, hipertensión, tuberculosis, hepatitis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida. También se excluyeron las mujeres embarazadas.

  1. Cosecha DF durante la extracción quirúrgica de terceros molares impactados (Figura 1A).
    NOTA: La cirugía fue realizada por un cirujano maxilofacial oral. Se requiere la cooperación con un dentista para la recolección de tejidos.
  2. Guarde DF en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco con penicilina-estreptomicina al 3% a 4 °C antes de su uso. Realizar procedimientos de aislamiento el día de la cosecha de DF (Figura 1B).

2. Aislar poblaciones unicelulares de DF

  1. Preparar soluciones madre de colagenasa tipo I y proteasa en DPBS para que las concentraciones finales de colagenasa tipo I y proteasa sean de 1 mg/ml y 2,4 mg/ml, respectivamente.
  2. Preparar tres tubos de lavado de 50 ml con 20 ml de DPBS por tubo. Etiquete los tubos como 1, 2 y 3.
  3. Lave el DF en los tubos de lavado secuencialmente. Sostenga el DF con pinzas y coloque el DF en el tubo 1. Saque el DF del tubo 1 y colóquelo en el tubo 2. Saque el DF del tubo 2 y colóquelo en el tubo 3. Agite suavemente DF 10-15 veces en cada tubo. Después de lavar tres veces, coloque el DF en un plato de cultivo de 60 mm (Figura 2A).
  4. Picar el DF con tijeras de tejido (Figura 2B). Transfiera solo una pequeña porción a la placa de cultivo para minimizar la pérdida de tejido. Repita el corte hasta que el DF tenga un aspecto pulposo o blando (Figura 2C).
  5. Mezclar 1 mL de colagenasa tipo I y 1 mL de solución de proteasa en un tubo cónico de 15 mL para obtener concentraciones finales de 1 mg/mL y 2,4 mg/mL, respectivamente.
  6. Transfiera el DF picado al tubo cónico de 15 ml desde el paso 2.5. Agitar suavemente e incubar el tubo durante 1 h a 37 °C.
  7. Agregue 5 ml de tripsina-EDTA al 0,05% al tubo, agite e incube el tubo durante 15 minutos a 37 °C.
  8. Preparar el medio de queratinocitos que contenga queratinocitos SFM 10% fetal bovino (FBS). Agregue 3 ml de medio de queratinocitos en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Coloque un colador de 40 μm en la parte superior de este tubo y use una pipeta serológica de 10 ml para aspirar el sobrenadante del paso 2.6 y pasarlo a través del colador.
    NOTA: Minimice la incorporación de restos de tejido digerido mientras toma el sobrenadante. Retire los restos de tejido con un colador de 40 μm para minimizar la falla. Los restos de tejido pueden pasar a través de coladores de 70 μm y dificultar la formación de colonias. FBS en el medio de queratinocitos inactivará las enzimas.
  9. Repita los pasos 2.7 y 2.8.
  10. Transfiera la suspensión recogida a un tubo cónico de 15 ml.
  11. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml a 288 × g durante 3 min a 4 °C. Retire el sobrenadante.
    NOTA: Tenga cuidado de evitar cualquier eliminación accidental de células peletizadas, que en su mayoría son invisibles.
  12. Añadir 3 ml de SFM de queratinocitos y lavar las células dos veces con una pipeta de 1 ml con centrifugación como en el paso 2.11.
  13. Coloque la población unicelular en una placa de cultivo de 60 mm utilizando SFM de queratinocitos. Mantener el plato de cultivo con un volumen final de 5 mL en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C. Cambie el medio de cultivo diariamente hasta que no se observen restos de tejido o células.
    NOTA: Elimine los desechos flotantes en el medio de cultivo cambiando el medio. La eliminación tardía de restos de tejido o células muertas tiene un efecto desfavorable en el cultivo primario.
  14. Examine la placa del paso 2.13 para comprobar el crecimiento de las células epiteliales (Figura 3A).
    NOTA: Las células epiteliales crecen dentro de los 7-10 días posteriores al recubrimiento de las poblaciones unicelulares.
  15. Expandir las colonias epiteliales y subcultivar las células.
    1. Aspire el medio y lave el fondo de la placa de cultivo una vez con 3 ml de queratinocitos SFM.
    2. Añadir 2 ml de proteasa de disociación celular e incubar en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C durante 3 min.
      NOTA: Repita el paso 2.15.2 si el desprendimiento celular no es efectivo.
    3. Agregue 2 ml de medio de queratinocitos a la placa de cultivo y transfiera el contenido en un tubo cónico de 15 ml.
      NOTA: No es necesario agregar más medio de queratinocitos si se repite el paso 2.15.2.
    4. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml a 288 × g durante 3 min a 4 °C.
    5. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular dos veces con 3 ml de queratinocitos SFM.
    6. Placa las células en una placa de cultivo de 100 mm utilizando SFM de queratinocitos (volumen final de 10 ml por plato de 100 mm).
  16. Prepare y almacene las existencias de células en un tanque de nitrógeno líquido.
    1. Recolectar células como se describe en los pasos 2.15.1-2.15.5.
    2. Distribuya las células en crioviales en 1 ml de medio de congelación (80% de queratinocitos SFM, 10% dimetilsulfóxido, 10% de FBS).
    3. Coloque los viales en un recipiente de congelación y guárdelos a -80 °C durante 24 h.
    4. Transfiera los viales del congelador a un tanque de nitrógeno líquido.

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Representative Results

Cosecha DF
La cirugía fue realizada por un cirujano maxilofacial oral. Los materiales derivados del ser humano, incluido el fragmento de diente, el tejido gingival y el DF, fueron recolectados por un cirujano (Figura 1A). El DF puede estar unido al fragmento de diente. Un cirujano maxilofacial oral podrá identificar el DF. La cooperación y la comunicación con el cirujano son necesarias para la recolección de tejidos. El DF es un tejido similar a una membrana de forma irregular. El tejido gingival tiene una superficie queratinizada y se puede distinguir del DF. El tejido pulpar reside en la cámara pulpar y rara vez se separa de los dientes durante la cirugía. El DF se almacenó en DPBS con penicilina-estreptomicina al 3% a 4 °C antes de su uso (Figura 1B).

Tratamiento mecánico de la DF
Los restos de tejido y la sangre se eliminaron lavando el DF con DPBS. Se prepararon tres tubos cónicos con solución de lavado. Después del lavado, el DF se transfirió a un plato de cultivo de 60 mm o 100 mm (Figura 2A). El DF debe picarse con tijeras hasta que el tejido tenga una apariencia pulposa o blanda (Figura 2B, C).

Aparición de población epitelial
Después de emplatar poblaciones celulares heterogéneas, muchas células y pequeños desechos flotaron en el medio de cultivo. El número de células flotantes disminuyó gradualmente con sucesivos cambios de medio. El retraso en el cambio de medio puede causar un ambiente de cultivo turbio. En la etapa inicial, diferentes tipos de células aparecen en la parte inferior de la placa de cultivo, pero desaparecen cuando se mantienen en la FSM de queratinocitos. Las células con morfología epitelial aparecen dentro de los 7-10 días posteriores al recubrimiento de poblaciones unicelulares (Figura 3A). El número de células en forma de adoquín varía de 1 a 10 en el momento de la aparición de las células epiteliales, que se expanden en colonias con el tiempo (Figura 3B).

El procedimiento de picado se repitió para aumentar el área de contacto de DF con tripsina-EDTA al 0,05% para promover la disociación celular. Se cosecharon más células individuales de pulpa DF que DF intacta. La pegajosidad de la pulpa DF indicó la probabilidad de éxito del aislamiento de las células epiteliales. Los cambios diarios en el medio evitaron que la SFM del queratinocitos se volviera turbia, lo cual es importante para la supervivencia de las células epiteliales.

Figure 1
Figura 1: Materiales derivados del hombre. (A) Los materiales derivados de humanos fueron recolectados por un cirujano maxilofacial oral. La flecha amarilla indica el DF. Las flechas negras indican el fragmento de diente y el tejido blando adherido al diente. (B) El DF se almacenó en PBS suplementado con penicilina-estreptomicina al 3% a 4 °C. Los procedimientos de aislamiento se realizaron dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. Abreviaturas: DF = folículo dental; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Tratamiento de los folículos dentales. (A) El DF se transfirió a un plato de cultivo de 60 mm después de lavarlo con DPBS tres veces. (B) El DF fue picado con tijeras de tejido. (C) El DF picado tenía una apariencia pulposa o blanda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aparición de células epiteliales. (A) Las células con morfología epitelial aparecen dentro de los 7-10 días posteriores al recubrimiento de poblaciones unicelulares. (B) Expansión ex vivo de células epiteliales derivadas de DF por subcultivo. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: DF = folículo dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo incluye pasos críticos. La recolección de poblaciones unicelulares es esencial para el aislamiento exitoso de las células epiteliales de la DF. Buscamos aislar las células epiteliales del DF basándonos en nuestra hipótesis de que hay más células epiteliales en el DF. El procedimiento de picado mejora el desprendimiento y la liberación de células del DF. Se mejoró el procedimiento de picado y se repitió el picado hasta que el DF apareció pulposo para facilitar la liberación de células individuales. La obtención del número máximo de células individuales aumenta la probabilidad de la aparición de la población epitelial. La contaminación ocurre con frecuencia durante el aislamiento de las células epiteliales del DF. El uso de coladores de 40 μm minimiza la inclusión de restos de tejido en poblaciones unicelulares, ya que los restos de tejido pueden pasar a través de filtros de 70 μm e inhibir la colonización de células epiteliales.

Las células epiteliales parecen ser más vulnerables a ciertos ambientes que las células mesenquimales, y el cambio diario del medio de cultivo también proporcionó un ambiente limpio para la aparición de la población epitelial. La pérdida de células debido al cambio frecuente de medio puede ser una limitación de este protocolo. Sin embargo, el cambio diario del medio se realizó después de la solución de problemas para este protocolo y, en consecuencia, aparecieron y se expandieron las células epiteliales. Retrasar el cambio de medio puede afectar a las culturas. Como el pellet celular después de la centrifugación es casi invisible, la punta estrecha de un tubo cónico de 15 ml aumenta la facilidad de eliminación del sobrenadante sin perder el gránulo celular. Por lo tanto, este protocolo sugiere transferir el contenido del tubo cónico de 50 ml a un tubo cónico de 15 ml.

El DF proporciona un mayor volumen de tejido y más células individuales que el PDL. Por lo tanto, el DF se puede utilizar en lugar del PDL como fuente de tejido para el aislamiento de células epiteliales dentales humanas. La selección e inhibición de los tipos de células en el DF se puede hacer simplemente a través de un medio de cultivo selectivo. La SFM induce el crecimiento epitelial, mientras que el medio que contiene suero selecciona las células mesenquimales. Esta metodología permite una fácil accesibilidad a las células epiteliales dentales humanas. Morsczek y sus colegas aislaron previamente precursores mesenquimales derivados de DF. Este estudio se diferencia del suyo por la selección de poblaciones epiteliales y la inhibición de las células mesenquimales.

El papel regulador de las células epiteliales dentales durante la formación de los dientes es de gran interés en la investigación dental. El estudio de las interacciones epitelial-mesenquimal durante el desarrollo dental puede sugerir pistas para la resolución de problemas clínicos13. Se ha intentado la regeneración tisular mediante la combinación de componentes epiteliales y mesenquimales14. Los factores derivados de células epiteliales dentales, como un derivado de la matriz del esmalte, se han evaluado como dianas terapéuticas dirigidas a la regeneración periodontal, la regeneración del complejo pulpar-dentina y la reinserción periodontal2,15. La combinación de factores de regeneración, incluyendo células madre, láminas celulares epiteliales-mesenquimales, factores derivados de células y biomateriales, puede generar bionúcleos en caso de pérdida o agenesia dental16. Los genes asociados a la agenesia dental, como los genes PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR y WNT10A, son genes reguladores clave candidatos potenciales para las interacciones epitelial-mesenquimal17. Además, los datos derivados del método de secuenciación de próxima generación de estudios asociados a la agenesia dental pueden proponer de manera similar nuevos genes diana putativos que regulan el control molecular durante las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiadas por el gobierno coreano (NRF-2017R1C1B2008406 y NRF-2021R1F1A1064350). El Dr. Hee-Yeon Bae amablemente proporcionó el DF para el cultivo primario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol EMD millipore Co., MA, USA 1096341011 1 L
0.05% trypsin-EDTA Gibco, Grand island, NY, USA 25300054 100 mL
40 μm cell strainer Falcon, NC, USA 352340
Cell culture dish (100 x 20 mm) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 172958 Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 150326
Collagenase type 1 Gibco, Grand island, NY, USA 17100017 1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea CB-514R
Conical tube SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea 50015
50050		 15 mL
50 mL
Cryogenic vial Corning Inc., NY, US 430488 2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Missouri, US D2650-100ml 100 mL
Dispase Gibco, Grand island, NY, USA 17105041 1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea  LB 001-02 500 mL
Fetal bovine serum Gibco, Grand island, NY, USA 16000044 500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 51023121
Keratinocyte serum-free medium Gibco, Grand island, NY, USA 10724-011 500 mL
MVE CryoSystem 2000 MVE Biological Solutions Co., GA, USA CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 5100-0001 for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope Olympus Life Science,
Waltham, Massachusetts		 22-00723-01 Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep Gibco, Grand island, NY, USA 15140122 100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP Drummond scientific Co., PA, USA HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000 Gilson, Villiers le Bel, France F123602 100-1000 µL
Refrigerant Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan CLN 540U ~-80 °C / Discontinued
Serological pipet SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea 91010 10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA 12605010 cell dissociation protease

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References

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