Summary
Nous présentons un protocole pour déterminer la chiralité multicellulaire in vitro, en utilisant la technique du micromodèlement. Ce test permet une quantification automatique des biais gauche-droite de divers types de cellules et peut être utilisé à des fins de dépistage.
Abstract
La chiralité est une propriété cellulaire intrinsèque, qui dépeint l’asymétrie en termes de polarisation le long de l’axe gauche-droite de la cellule. Comme cette propriété unique attire de plus en plus l’attention en raison de ses rôles importants dans le développement et la maladie, une méthode de quantification normalisée pour caractériser la chiralité cellulaire ferait progresser la recherche et les applications potentielles. Dans ce protocole, nous décrivons un test de caractérisation de chiralité multicellulaire qui utilise des réseaux de cellules micromotifs. Les micromotifs cellulaires sont fabriqués sur des lames de verre revêtues de titane / or via l’impression par microcontact. Après avoir ensemencé sur les îlots géométriquement définis (par exemple, en forme d’anneau) enrobés de protéines, les cellules migrent directionnellement et forment un alignement biaisé dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, qui peut être automatiquement analysé et quantifié par un programme MATLAB écrit sur mesure. Nous décrivons ici en détail la fabrication de substrats à micromotifs, l’ensemencement cellulaire, la collecte d’images et l’analyse de données et montrons des résultats représentatifs obtenus à l’aide des cellules NIH / 3T3. Ce protocole a déjà été validé dans de multiples études publiées et constitue un outil efficace et fiable pour étudier la chiralité cellulaire in vitro.
Introduction
L’asymétrie gauche-droite (LR) de la cellule, également connue sous le nom de maniabilité cellulaire ou chiralité, décrit la polarité cellulaire dans l’axe LR et est reconnue comme une propriété biophysique fondamentale et conservée 1,2,3,4,5. La chiralité cellulaire a été observée in vivo et in vitro à plusieurs échelles. Des résultats antérieurs ont révélé un tourbillon chiral du cytosquelette d’actine dans des cellules individuelles ensemencées sur des îlots circulaires6, une migration et un alignement biaisés des cellules dans des limites confinées 7,8,9,10,11 et une boucle asymétrique du tube chauffant de poulet 12.
Au niveau multicellulaire, la chiralité cellulaire peut être déterminée à partir de la migration ou de l’alignement directionnel, de la rotation cellulaire, de la dynamique du cytosquelette et du positionnement des organites cellulaires 7,8,9,10,11,12,13. Nous avons établi un test14 basé sur le micromodèlement pour caractériser efficacement le biais chiral des cellules adhérentes 7,8,9,10. Avec les micromotifs en forme d’anneau confinant géométriquement les amas de cellules, les cellules présentent collectivement une migration directionnelle et un alignement biaisé. Un programme MATLAB a été développé pour détecter et mesurer automatiquement l’alignement des cellules dans les images à contraste de phase de l’anneau. La direction de l’alignement local des cellules est quantifiée avec un angle biaisé, en fonction de son écart par rapport à la direction circonférentielle. Après analyse statistique, le motif en anneau des cellules est désigné soit comme des biais dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW), soit comme des biais dans le sens des aiguilles d’une montre (CW).
Ce test a été utilisé pour caractériser la chiralité de phénotypes cellulaires multiples (tableau 1), et l’asymétrie LR des cellules s’est avérée être spécifique au phénotype 7,11,15. De plus, la perturbation de la dynamique et de la morphologie de l’actine peut entraîner une inversion du biais chiral 7,8, et le stress oxydatif peut également altérer la chiralité cellulaire9. En raison de la simplicité de la procédure et de la robustesse de l’approche 7,8,9,10, ce test de chiralité 2D fournit un outil efficace et fiable pour déterminer et étudier la chiralité multicellulaire in vitro.
Le but de ce protocole est de démontrer l’utilisation de cette méthode pour caractériser la chiralité cellulaire. Ce protocole décrit comment fabriquer des réseaux cellulaires à motifs via la technique d’impression par microcontact et effectuer une analyse de chiralité de manière automatisée à l’aide du programme MATLAB.
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Protocol
1. Fabrication de timbres en polydiméthylsiloxane (PDMS)16
- Dessinez un réseau d’anneaux à micro-échelle à l’aide d’un logiciel de CAO, d’un diamètre intérieur de 250 μm et d’un diamètre extérieur de 450 μm. Le modèle utilisé dans ce protocole est un réseau de 10 x 10 avec une distance de 850 μm entre les anneaux.
- Imprimez un masque transparent du motif à la résolution souhaitée à l’aide du service d’impression de masques d’une société de microfabrication (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Les dimensions fournies de l’anneau ont été prouvées pour fonctionner pour de nombreux types de cellules7. - Effectuez une photolithographie ultraviolette (UV) à l’aide du masque contenant les caractéristiques souhaitées pour créer un moule photorésistant négatif (tel que SU-8)8.
- Recouvrir une plaquette de silicium recouverte de résine photosensible par le masque transparent fabriqué aux étapes 1.1-1.2.
- Sur un aligneur de contact UV, polymériser la résine photosensible sous des régions transparentes du masque par la lumière UV.
REMARQUE: Après un lavage et un développement ultérieurs, le moule principal avec les caractéristiques souhaitées est fabriqué8. Les détails opérationnels dépendent de l’équipement spécifique utilisé.
- Préparez les prépolymères élastomères PDMS en mélangeant avec son agent de durcissement à un rapport de 10: 1, puis jetez le mélange sur le moule dans une boîte de Pétri.
- Placer le plat dans une chambre à vide pendant 30 min pour éliminer les bulles d’air dans le PDMS et cuire au four à 60 °C pendant au moins 2 h.
- Une fois le durcissement complet de PDMS, découpez les tableaux de motifs en tampons.
REMARQUE: Des tampons plus épais (environ 1 cm) peuvent être préférés en raison de la facilité de manipulation aux étapes ultérieures de l’impression par microcontact.
2. Revêtement des lames de verre
- Nettoyez les lames de verre. Faire tremper les lames dans un bain à 100% éthanol, soniquer pendant 5 min, puis rincer à l’eau.
- Répétez cette étape d’abord avec de l’acétone, puis avec de l’isopropanol, puis avec un séchage dans un flux d’azote.
- Utilisez un équipement d’évaporation par faisceau d’électrons (faisceau E) pour recouvrir les couches de titane et d’or sur les lames de verre.
REMARQUE: Pour la couche de titane, l’épaisseur souhaitée est de 15 Å (1 Å = 10-10 m). Pour la couche d’or, l’épaisseur souhaitée est de 150 Å. Recouvrez d’abord le titane, puis l’or, car la couche de titane sert d’adhésif entre l’or et la lame de verre. - Placez les glissières nettoyées dans la chambre d’évaporation et insérez des creusets en or et en titane sous les volets.
- Pompez la chambre pour créer un vide inférieur à 10-5 Pa avant de faire fondre les métaux. Concentrez le faisceau d’électrons sur le métal et ajustez la puissance de sorte que le taux de dépôt soit approprié pour contrôler l’épaisseur du dépôt.
- Ouvrez l’obturateur pour commencer le dépôt de métal. Fermez l’obturateur lorsque l’épaisseur souhaitée est atteinte.
- Basculer les creusets entre l’évaporation séquentielle de deux métaux.
- Attendez que les creusets refroidissent comme l’exige l’équipement, évacuez la chambre et retirez les glissières en verre revêtu d’or.
- Pompez à nouveau la chambre pour l’entretien de l’équipement.
REMARQUE: Les détails opérationnels peuvent dépendre d’un évaporateur à faisceau E spécifique. Il est important d’avoir un faible taux de dépôt de titane bien contrôlé. Une épaisse couche de titane entraîne souvent une mauvaise visibilité, en particulier pour l’imagerie par fluorescence des cellules. Après le revêtement, les lames de verre revêtues de titane / or peuvent être stockées dans une chambre à vide sèche à température ambiante pendant au moins 1 mois.
3. Impression par microcontact
- Coupez la glissière revêtue de titane / or en plus petits morceaux, si vous le souhaitez. Une forme carrée de 12 mm x 12 mm est recommandée pour une application typique (Figure 1B).
- Utilisez un coupe-verre pour glisser sur la surface afin de laisser une trace bosselée, puis maintenez la glissière de verre des deux côtés et pliez-la à la bosse pour se briser en petits quartiers. Évitez de toucher la surface recouverte d’or.
REMARQUE: Pour déterminer visuellement quel côté du verre est la surface revêtue en cas de basculement accidentel, comparez la réflexion de la lumière des deux côtés. La surface recouverte d’or montrera une réflexion plus brillante, tandis que le côté non revêtu aura une réflexion plus faible (de la couche de titane de l’autre côté du verre). Une autre façon est d’observer les bords de la glissière, et le côté du revêtement peut être déterminé à partir de la surface de coupe verticale. - Nettoyez les lames en trempant dans de l’éthanol à 100% dans une boîte de Pétri avec le côté or vers le haut sur un agitateur orbital pendant au moins 10 min. Aspirer l’éthanol, puis sécher chaque lame en soufflant avec un flux d’azote.
- Nettoyez les tampons PDMS avec de l’eau savonneuse puis 100% d’éthanol. Séchez les tampons avec de l’azote gazeux.
- Préparer une solution d’octadécanéthiol (C18) de 2 mM en dissolvant 5,74 mg de poudre de C18 dans 10 mL d’éthanol à 100 %.
REMARQUE: Scellez et conservez la solution de C18 à température ambiante. L’impression de motifs avec C18 crée une monocouche auto-assemblée adhésive pour laquelle la fibronectine et les cellules se fixeront préférentiellement. - Faire tremper les tampons PDMS dans une solution en C18 avec la surface à motifs orientée vers le bas pendant 10 s et sécher doucement avec de l’azote gazeux pendant 60 s.
REMARQUE: Lors du séchage, placez d’abord le flux loin du tampon (environ 1 m) jusqu’à ce que la majeure partie du liquide soit évaporée, puis rapprochez lentement le flux pour sécher complètement le tampon. Il s’agit d’éviter que la solution de C18 ne soit soufflée au lieu de sécher sur le tampon. - Posez le tampon face cachée sur les glissières dorées pendant 60 s avant de le retirer.
- Pour assurer un estampage correct, tapotez doucement la pince à épiler sur les tampons pour transférer correctement les motifs. Ne poussez pas trop fort et le poids de la pince à épiler est généralement suffisant.
REMARQUE: L’inspection visuelle du tampon pendant le taraudage permettra de s’assurer que le tampon et la lame de verre sont entrés en contact uniformément. - Préparez des chambres d’humidité.
- Pipette 1 mL d’éthanol à 70 % dans un couvercle de boîte de Petri inversé et déposer un morceau de parafilm pour couvrir la surface (couvert face vers le haut).
- Utilisez une pince à épiler pour soulever, déposez un parafilm pour éviter les bulles d’air et éliminez l’excès d’éthanol si nécessaire.
- Préparer 2 mM de solution HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3) : Diluer 5 μL de solution mère dans 5 mL d’éthanol à 100 %.
REMARQUE: La solution diluée d’EG3 peut être scellée et stockée à 4 °C, et le bouillon d’EG3 non dilué doit être conservé à -20 °C. Le traitement EG3 est utilisé pour rendre la région du verre sans C18 non adhésive pour les cellules. - Micropipette de 40 μL de gouttelettes d’EG3 pour chaque quart de verre glissent sur le parafilm dans la chambre d’humidité, laissant suffisamment d’espace entre les gouttelettes pour tenir compte de l’espacement des lames d’or.
- Utilisez une pince à épiler pour placer des lames dorées imprimées C18 face cachée sur les gouttelettes et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les diapositives. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever pour minimiser l’évaporation.
REMARQUE: Placez un bord des glissières de verre vers le bas près de la gouttelette, puis abaissez lentement l’autre extrémité de la glissière de verre vers le bas. Si une bulle est présente, poussez la glissière d’or sans la soulever jusqu’à ce que la bulle ne soit plus présente. - Scellez hermétiquement la boîte de Petri avec un parafilm et laissez-la à température ambiante pendant au moins 3 h.
REMARQUE: Si une incubation intensive est souhaitée, scellez deux fois la boîte de Petri et laissez-la jusqu’à 24 h. - Dans une armoire de biosécurité, placez des lames d’or face vers le haut dans une boîte de Pétri, trempez et rincez 3 fois dans de l’éthanol à 70% pour éliminer l’EG3, puis laissez dans l’éthanol pendant 10 minutes pour la stérilisation.
- Aspirez l’éthanol et remplacez-le par du PBS stérile.
- Préparer une autre chambre d’humidité comme décrit à l’étape 3.9, avec du PBS au lieu de l’éthanol.
REMARQUE: En raison de la différence de tension superficielle, il est plus facile d’ajouter d’abord 4-5 mL de PBS pour déposer le parafilm et éliminer les bulles, puis d’aspirer l’excès. - Préparer la solution de fibronectine de 50 μg/mL (autres protéines, si désiré) dans du PBS stérile et micropipette de gouttelettes de 50 μL de solution de fibronectine pour chaque quart glissent sur le parafilm, en laissant un peu d’espace entre les gouttelettes.
REMARQUE: Le revêtement de fibronectine facilite l’adhésion des cellules aux surfaces à motifs. - Utilisez une pince à épiler pour placer les glissières face cachée sur les gouttelettes et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les glissières. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever.
REMARQUE: Les pinces à glissière en verre ou les pinces à gaufrettes avec des pointes droites et larges sont recommandées pour manipuler les glissières. - Laissez la boîte de Petri dans l’armoire de biosécurité pendant 30 min.
- Après 30 min, placez les lames d’or face vers le haut dans PBS après avoir rincé 3 fois.
REMARQUE: Les lames à motif de fibronectine peuvent être stockées dans PBS à 4 ° C pendant environ un mois.
4. Ensemencement de cellules sur des lames à micromotifs
- Réchauffez le milieu de culture cellulaire et la trypsine dans un bain-marie à 37 °C.
REMARQUE: La description suivante de la sous-culture concerne les cellules NIH / 3T3. Les conditions de culture peuvent varier selon les types de cellules. - (Facultatif) Tremper les lames à motifs dans les milieux de culture dans une plaque de 12 puits, réchauffer jusqu’à 37 °C dans un incubateur avant la trypsinisation des cellules pour une meilleure fixation cellulaire.
- Trypsiniser les cellules, neutraliser avec des milieux contenant du FBS, centrifuger à 100 x g pendant 3 min, puis remettre en suspension en mélangeant bien avec du milieu frais.
REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées les unes des autres. - Comptez les cellules, diluez à 200 000 cellules/mL et ajoutez 0,5 mL de suspension cellulaire à chaque puits contenant une lame d’or.
- Secouez doucement la plaque du puits plusieurs fois pour un ensemencement cellulaire uniforme et conservez-la dans un incubateur pendant 15 minutes pour permettre la fixation des cellules.
- Après 15 minutes, vérifiez la fixation des cellules au microscope. Prévoyez plus de temps, si nécessaire.
REMARQUE: Les cellules attachées s’étendront sur la surface avec du filopodium visible ou un aplatissement et ne bougeront pas de la surface lorsque la plaque du puits est doucement tapotée ou déplacée. - Aspirer les milieux contenant des cellules non attachées de chaque puits et ajouter 1 mL de milieux de culture. Pour le traitement médicamenteux, complétez des réactifs supplémentaires dans les milieux de culture à cette étape.
- Cultivez les cellules dans l’incubateur pendant 24 h et vérifiez la confluence pour déterminer si la chiralité s’est formée.
REMARQUE: Une confluence supérieure à 75% est recommandée pour la plupart des types de cellules, et une surconfluence peut affecter la caractérisation de la chiralité.
5. Collection d’images
- Fixez les cellules en cas de confluence.
- Retirer le milieu de culture de la plaque du puits et rincer une fois avec du PBS.
- Ajouter la solution de paraformaldéhyde à 4%, incuber à température ambiante pendant 15 min, puis rincer 3 fois avec du PBS.
REMARQUE: Si la fixation modifie de manière significative la morphologie de la cellule, l’imagerie avant la fixation est recommandée
- Utilisez un microscope à contraste de phase avec fonctionnalité de caméra, imagez chaque anneau sur les diapositives à haute résolution (un objectif d’objet 10x est suffisant pour l’analyse).
6. Caractérisation de la chiralité cellulaire (Figure 2)
- Téléchargez les fichiers de code MATLAB pour la caractérisation de la chiralité à partir des fichiers supplémentaires (fichier supplémentaire 1).
REMARQUE : Le code a été testé pour fonctionner avec MATLAB_R2015b et versions ultérieures sur les systèmes Windows et macOS. La boîte à outils de statistiques circulaires est également nécessaire pour exécuter les fichiers, qui se trouvent dans la référence17. - Ajoutez le dossier de code et les sous-dossiers (avec la boîte à outils de statistiques circulaires à l’intérieur) au chemin MATLAB et ouvrez le fichier « ROI_selection.m ». À la ligne 4, remplacez le répertoire par le dossier de données souhaité (pour les utilisateurs de fenêtres, basculez « / » par « \ » aux lignes 4 et 5).
- Modifiez la taille de l’image à la ligne 14, les deux premières figures représentant la taille du cercle intérieur de l’anneau tandis que les deux autres représentant l’extérieur.
REMARQUE : Assurez-vous que les tailles de toutes les images d’un dossier à analyser sont identiques. - Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code MATLAB « ROI_selection.m » afin de déterminer la région d’intérêt (ROI) dans les images à contraste de phase.
- Faites glisser manuellement le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau, puis double-cliquez sur l’image pour confirmer la sélection.
- Répétez cette étape pour chaque image du dossier (l’image suivante apparaîtra automatiquement après avoir confirmé la sélection du retour sur investissement d’une image précédente); un fichier « .mat » sera généré pour stocker les informations de retour sur investissement pour chaque image.
- Ouvrez le fichier « Analysis_batch.m » et modifiez le répertoire du dossier de la même manière que l’étape 6.2. (Pour les utilisateurs de fenêtres, pour la première utilisation, basculez « / » en « \ » dans les lignes 5, 6, 124 et 130)
- Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code « Analysis_batch.m » afin de déterminer la chiralité de plusieurs modèles d’anneaux cellulaires. Un fichier « datatoexcel.txt » sera généré, contenant des statistiques circulaires pour chaque anneau ainsi que le nombre d’anneaux dans le sens des aiguilles d’une montre, non chiraux et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
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Representative Results
Quinze minutes après l’ensemencement des cellules NIH/3T3, l’adhésion des cellules sur le motif de l’anneau a été confirmée visuellement par imagerie à contraste de phase. Après une culture ultérieure de 24 h, les cellules sur les motifs sont devenues confluentes et allongées avec des alignements clairement asymétriques, biaisés dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 2). La migration directionnelle des cellules attachées est enregistrée par imagerie time-lapse, la motilité cellulaire et la morphogenèse peuvent être quantifiées avec d’autres analyses de la vidéo. Pour effectuer l’analyse de chiralité, des images à contraste de phase haute résolution sont prises après fixation (Figure 2A-C) et introduites dans le programme MATLAB. Le programme détecte les gradients d’intensité et calcule les directions d’alignement des cellules correspondantes sur l’anneau. Ensuite, la chiralité cellulaire est déterminée sur la base des statistiques circulaires de l’alignement cellulaire s’écartant de la direction circonférentielle des anneaux. Les cellules peuvent donc être désignées dans le sens des aiguilles d’une montre (CW), dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW) ou non chirales (NC) (Figure 2D). Après traitement, l’analyse a montré que la majorité des anneaux ont un biais CW dominant, ce qui indique que les cellules 3T3 ont une forte chiralité CW. Les statistiques circulaires générées fournissent également des informations supplémentaires sur les angles biaisés pour des analyses plus approfondies si nécessaire (Figure 2E).
La chiralité cellulaire dépend de son phénotype. Il a été vérifié que le test de chiralité en anneau est compatible avec plusieurs types de cellules 7,8,9,10, y compris les lignées cellulaires et les cellules primaires, telles que les fibroblastes, les myoblastes, les cellules endothéliales et les cellules souches (tableau 1). Fait intéressant, parce que la chiralité cellulaire provient des fonctionnalités du cytosquelette d’actine, les altérations de la dynamique de l’actine peuvent avoir un impact sur le biais chiral des cellules. Avec les cellules C2C12 du myoblaste de souris, nous avons constaté qu’en perturbant la polymérisation de l’actine avec un traitement à la latrunculine A de 50 nM, les cellules présentaient une altération du biais chiral de la CCW en CW (Figure 3A). De plus, les cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines (hUVEC) traitées avec un médicament à petites molécules, le 12-o-tétradecanoylphorbol-13-acétate (TPA), pour activer la protéine kinase c ont montré un déplacement dose-dépendant de la chiralité cellulaire de CW à CCW (Figure 3B). Ces résultats démontrent expérimentalement l’utilité du test de chiralité en anneau développé ainsi que la sensibilité de ce test aux altérations du cytosquelette.
Graphique 1. Schéma du micromodèlement cellulaire. (A) Procédé de microfabrication et d’impression par microcontact pour le modelage de cellules. Un moule de résine photosensible négative a été fabriqué par réticulation ultraviolette (UV) de la résine photosensible via un masque contenant des caractéristiques de micromotif (1-2). Des prépolymères élastomères de polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été coulés sur le moule pour créer des tampons (3-4). Ensuite, une monocouche auto-assemblée adhésive (SAM), l’octa-décanethiol (C18), a été enduite sur le tampon et transférée sur des lames de verre revêtues d’or par impression par microcontact (5-7), suivie d’un revêtement de SAM non adhésif à terminaison éthylène glycol, HS-(CH2)11-EG3 (EG3) (8) et fibronectine (9). Les cellules ont ensuite été ensemencées pour s’attacher aux motifs (10). (B) Les photos montrent les étapes clés du micromodèlement cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Flux de travail des analyses d’imagerie. (A) Collection d’images. Acquérir des images à contraste de phase de chaque bague. (B) Entrez des données dans le programme MATLAB en exécutant le répertoire de configuration de fichier « ROI_Selection.m » et la taille de l’image. (C) Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) en faisant glisser le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau cellulaire et double-cliquez pour confirmer. (D) Déterminez l’alignement des cellules et les biais chiraux en exécutant le fichier « Analysis_Batch.m ». (E) Exemples de résultats avec un résumé des nombres d’anneaux biaisés et des statistiques circulaires pour chaque anneau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Résultats représentatifs de la chiralité des cellules sous traitement médicamenteux. (A) Images à contraste de phase et résultats de caractérisation de la chiralité des cellules C2C12 du myoblaste de souris : Groupes témoins (à gauche) et groupes traités à la latrunculine A de 50 nM (à droite). La police rouge en gras indique la chiralité dominante à p < 0,05 par test de rang. Barres d’échelle : 100 μm. (B) Images de contraste de phase et résultats de caractérisation de la chiralité des cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines (UVCEH) sur des anneaux à micro-motifs : Groupes témoins (à gauche) et 30 nM traités par TPA (à droite). La police rouge en gras indique la chiralité dominante à p < 0,05 par test de rang. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| CW Biaisé | Partialité de la CCAC |
| · Cellules NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · Cellules MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593) | · Cellules musculaires squelettiques humaines (Lonza CC-2661) |
| · Fibroblastes cardiaques de rat | · Une lignée de fibroblastes de cancer de la peau humaine (ATCC CRL-7762) |
| · Fibroblastes cutanés primaires humains (ATCC PCS-201-012) | · Cellules épithéliales rénales canines de Madin-Darby (ATCC CCL-34) |
| · Cellules souches adipeuses humaines | |
| · Cellules souches mésenchymateuses humaines | |
| · Cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines (Lonza CC-2935) | |
| · Cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (Systèmes cellulaires ACBRI-376) |
Tableau 1. Biais chiraux de différents types de cellules caractérisés par le test de micromotifs. CW : dans le sens des aiguilles d’une montre ; CCW : dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
Fichier supplémentaire 1 : Fichiers de code MATLAB pour la caractérisation de la chiralité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichiers de codage supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le test de motif en forme d’anneau décrit ici fournit un outil facile à utiliser pour la caractérisation quantitative de la chiralité multicellulaire, capable de produire des résultats très fiables et reproductibles. La génération rapide de microenvironnements définis identiques et l’analyse impartiale permettent un traitement automatisé à haut débit d’échantillons de grande taille. Ce protocole traite de la fabrication des micromotifs annulaires, de la structure cellulaire et de l’analyse automatique de l’alignement cellulaire biaisé et du mouvement directionnel. Cette méthode est compatible avec les techniques d’imagerie en direct pour étudier la motilité cellulaire et la morphogenèse chirale et peut être potentiellement intégrée à d’autres formes de plan pour la détection de toxicité9 ou des applications de dépistage de drogues.
Il y a quelques conseils supplémentaires à partager. Tout d’abord, dans l’étape d’impression par microcontact, le tampon doit être fait sur le côté or du verre (il peut être difficile de distinguer après que le substrat est coupé en morceaux), et la double impression doit être évitée. Deuxièmement, pour les cellules qui ont besoin d’autres protéines pour une bonne fixation, les protéines préférées peuvent être utilisées à l’étape 3.17. Troisièmement, pour la culture cellulaire, la densité cellulaire ne doit pas être trop élevée et les cellules ne doivent pas être cultivées en confluence excessive sur les motifs. Sinon, les cellules pourraient franchir la frontière interne et remplir l’anneau dans un cercle solide. Quatrièmement, si les motifs cellulaires sont brisés ou incomplets après l’ensemencement, cela peut être dû à un transfert incomplet du motif de C18 lors de l’impression par contact (étapes 3.7-3.8). Les tampons PDMS doivent être examinés pour détecter les défauts. L’application d’une force légèrement plus élevée lors de l’estampage sur des diapositives peut également être utile. Enfin, si les cellules se fixent à toute la surface de la lame de verre sans motifs visibles, la force appliquée à l’étape 3.8 peut être trop élevée, ce qui entraîne l’estampage de C18 sur toute la surface. Il est également possible que les glissières soient défectueuses ou qu’elles aient été stockées dans PBS pendant trop longtemps. Les modèles de monocouches auto-assemblées (c.-à-d. C18 et EG3) doivent être utilisés dans le mois suivant l’impression.
Bien que le dosage proposé fournisse un outil pratique pour une caractérisation robuste de la chiralité, il existe certaines limites. Tout d’abord, le test de motif n’est compatible qu’avec les cellules adhérentes. La chiralité des cellules non adhérentes, telles que les cellules tumorales circulantes, les adipocytes ou les cellules non mammifères, pourrait éventuellement être analysée à l’aide de la méthode 3D Matrigel bicouche18,19. Deuxièmement, pour les types de cellules qui ont une forme de pavé naturel et ne présentent pas d’allongement significatif, la précision de l’analyse peut être réduite. Cependant, la chiralité de ces types de cellules peut être caractérisée par l’imagerie en direct et le suivi du biais de migration7. Enfin, le test de micromodélisme est une méthode d’analyse des paramètres, non destinée à la culture cellulaire à long terme. Les expériences telles que le traitement médicamenteux ne doivent pas dépasser 72 h après l’ensemencement sur des motifs. Pour les applications qui nécessitent un temps de traitement prolongé, envisagez de prétraiter les cellules avant l’ensemencement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 et NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan est un boursier Pew en sciences biomédicales (PEW 00026185), soutenu par les Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang est soutenu par l’American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
