Summary
Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Гистология, анализ разрушения барьера сетчатки крови и флуоресцентная ангиография являются ценными методами для понимания патофизиологии сетчатки, что может еще больше повысить эффективность скрининга лекарств против диабетической ретинопатии.
Abstract
Заболевание заднего сегмента глаз, такое как диабетическая ретинопатия, изменяет физиологию сетчатки. Диабетическая ретинопатия характеризуется отслоением сетчатки, нарушением гемато-ретинального барьера (BRB) и ангиогенезом сетчатки. Модель крысы in vivo является ценным экспериментальным инструментом для изучения изменений в структуре и функции сетчатки. Мы предлагаем три различных экспериментальных метода в модели крыс для выявления морфологических изменений клеток сетчатки, сосудистой системы сетчатки и скомпрометированного BRB. Гистология сетчатки используется для изучения морфологии различных клеток сетчатки. Кроме того, количественное измерение выполняется путем подсчета клеток сетчатки и измерения толщины различных слоев сетчатки. Анализ распада BRB используется для определения утечки экстраокулярных белков из плазмы в стекловидное тело из-за распада BRB. Флуоресцентная ангиография используется для изучения ангиогенеза и утечки кровеносных сосудов путем визуализации сосудистой системы сетчатки с использованием красителя FITC-декстран.
Introduction
Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из самых сложных вторичных осложнений сахарного диабета. Это также является основной причиной предотвратимой слепоты среди населения трудоспособного возраста во всем мире. В недавнем мета-анализе 32,4 миллиона слепых людей 830 000 (2,6%) человек были слепыми из-за DR1. Доля потери зрения, связанной с диабетом, заняла седьмое место в 2015 году с 1,06% (0,15-2,38) во всем мире2,3.
Диабетическая ретинопатия диагностируется сосудистыми аномалиями в задних глазных тканях. Клинически он делится на две стадии – непролиферативный ДР (NPDR) и пролиферативный DR (PDR), основанный на васкуляризации в сетчатке. Гипергликемия считается мощным регулятором ДР, поскольку она включает в себя несколько путей, участвующих в нейродегенерации4,5, воспалении6,7 и микроциркуляторном русле8 в сетчатке. Множественные метаболические осложнения, вызванные гипергликемией, включают накопление конечных продуктов гликирования (AGE), полиольного пути, гексозаминового пути и пути протеинкиназы-С. Эти пути отвечают за пролиферацию клеток (эндотелиальные клетки), миграцию (перициты) и апоптоз (нервные клетки сетчатки, перициты и эндотелиальные клетки) на основе различных стадий диабетической ретинопатии. Эти метаболические изменения могут привести к физиологическим изменениям, таким как отслоение сетчатки, потеря клеток сетчатки, разрушение гематоэнцефалического барьера (BRB), аневризмы и ангиогенез9.
Стрептозотоцин (СТЗ), индуцированный диабетом 1 типа, является хорошо зарекомендовавшей себя и общепринятой практикой у крыс для оценки патогенеза диабета и его осложнений. Диабетогенные эффекты СТЗ обусловлены селективным разрушением островков поджелудочной железы β-клеток10. В результате животные будут подвергаться дефициту инсулина, гипергликемии, полидипсии и полиурии, все из которых характерны для сахарного диабета 1 типа 11. При тяжелой индукции диабета СТЗ вводят при 40-65 мг/кг массы тела внутривенно или внутрибрюшинно во взрослом возрасте. Примерно через 72 ч у этих животных уровень глюкозы в крови превышает 250 мг/дл10,12.
Чтобы понять физиологические изменения сетчатки из-за нейродегенерации, воспаления и ангиогенеза, различные методы должны быть оптимизированы на экспериментальных моделях животных. Структурные и функциональные изменения в клетках сетчатки и сосудах сетчатки могут быть изучены различными методами, такими как гистология, анализ распада BRB и флуоресцентная ангиография.
Гистология предполагает изучение анатомии клеток, тканей и органов на микроскопическом уровне. Устанавливает корреляцию между структурой и функцией клеток/тканей. Выполняется несколько этапов для визуализации и идентификации микроскопических изменений в структуре тканей, тем самым сравнивая здоровых и больных аналогов13. Следовательно, важно тщательно стандартизировать каждый шаг гистологии. Различные этапы, связанные с гистологией сетчатки, включают фиксацию образца, обрезку образца, обезвоживание, очистку, пропитку парафином, встраивание парафина, сечение и окрашивание (окрашивание гематоксилином и эозином)13,14.
В здоровой сетчатке транспорт молекул через сетчатку контролируется BRB, состоящим из эндотелиальных клеток и перицитов на внутренней стороне и пигментных эпителиальных клеток сетчатки на внешней стороне. Тем не менее, внутренние эндотелиальные клетки BRB и перициты начинают дегенерировать во время болезненного состояния, и BRB также скомпрометирован15. Из-за этого распада BRB многие низкомолекулярные молекулы просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки16. По мере прогрессирования заболевания многие другие белковые молекулы (с низкой и высокой молекулярной массой) также просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки из-за нарушения гомеостаза17. Это приводит к различным другим осложнениям и, в конечном счете, к макулярному отеку и слепоте. Следовательно, количественная оценка уровня белка в стекловидном теле и сравнение здоровых и диабетических состояний измеряет скомпрометированный BRB.
Флуоресцентная ангиография – это методика, используемая для изучения кровообращения сетчатки и сосудистой оболочки с использованием флуоресцентного красителя. Он используется для визуализации сосудистой системы сетчатки и сосудистой оболочки путем введения флуоресцеинового красителя внутривенным путем или сердечной инъекцией18. Как только краситель вводится, он сначала достигает артерий сетчатки, а затем вен сетчатки. Эта циркуляция красителя обычно завершается в течение 5-10 мин после инъекции красителя19. Это важный метод диагностики различных заболеваний заднего сегмента глаз, включая диабетическую ретинопатию и хориоидальную неоваскуляризацию20. Он помогает обнаружить большие и незначительные изменения сосудистой системы в нормальных и больных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует всем руководящим принципам ухода за животными, предоставленным Институциональным комитетом по этике животных, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада.
1. Гистология сетчатки
- Энуклеация и фиксация глаза
- Усыплите самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель), используя высокую дозу пентобарбитала (150 мг / кг), введенную через внутрибрюшинный путь. Отсутствие обнаруживаемого сердцебиения подтверждает смерть в течение 2-5 мин.
- Энуклеат глаза, делая разрезы с помощью лезвия скальпеля на носовой и височной областях глаза. Затем разрезайте по краям с помощью щипцов и микроножек, чтобы удалить глаз из орбитальной лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем жертвовать крысами, держите фиксирующие растворы наготове.
ВНИМАНИЕ: Формальдегид раздражает кожу, глаза, нос и дыхательные пути. Он также может вызвать рак, поскольку является мощным сенсибилизатором кожи. Наденьте перчатки и держите их под капотом21. - Тщательно промойте глаза 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в чашке Петри для удаления крови. Удалите лишний жир, окружающий глаз, для легкого проникновения фиксирующего раствора.
- Сразу поместите глаз в 5 мл фиксирующего раствора с помощью щипцов, и убедитесь, что он не приклеен к стенкам стеклянных флаконов. Осторожно перемешайте в течение нескольких секунд и замените колпачок правильной маркировкой. Инкубировать глаз в фиксаторном растворе в течение 24 - 48 ч в темных условиях при комнатной температуре.
- Обрезка тканей
- После фиксации удалить глаз из фиксирующего раствора, промыть 10 мл PBS и поместить его в чашку Петри, содержащую 10 мл PBS, охлажденного при 4 °C.
- Используя микрощипцы, удерживайте глаз зрительным нервом и сделайте кольцу на pars plana с помощью микроножек. Прорежьте весь край роговицы, чтобы отделить переднюю чашечку глаза. Используя щипцы, аккуратно подберите хрусталик, выбросьте его и перережьте зрительный нерв.
- С помощью изогнутых микроножек сделайте продольный участок задней глазницы, пройдя через оптический диск, разделив его на две половины. Поместите его в основание кассеты и плотно закройте крышку должным образом без какого-либо нарушения ткани. Пометьте кассеты именем и датой образца ткани.
- Обезвоживание, очистка и парафиновая пропитка тканей
- Обезвоживают обрезанную ткань путем постепенного переноса в 80 мл 50%, 70%, 90% и 100% этанола. При переносе кассет из одной концентрации в другую обязательно нанесите их на чистую папиросную бумагу, чтобы свести к минимуму загрязнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте салфетке постоять в каждом переносе в течение 30 минут (дважды). Общее время, затрачиваемое на этот этап, составляет примерно 4 часа. - При обезвоживании переложите кассеты в 80 мл ксилола в течение 30 мин (дважды), чтобы заменить этанол ксилолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации с ксилолом ткань становится полупрозрачной.
ВНИМАНИЕ: Ксилол представляет собой ароматическое соединение с бензольным кольцом. Он раздражает глаза и слизистую оболочку, а также может вызывать депрессии. - Наконец, пропитайте ткань предварительно нагретым парафином при 60 °C, чтобы заменить ксилол в ткани. Нанесите кассеты несколько раз на папиросную бумагу, чтобы свести к минимуму содержание ксилола, и поместите в 200 мл парафина (жидкости при 60 °C) в течение 2 ч (1 ч х 2).
ВНИМАНИЕ: Избегайте вдыхания расплавленного парафина, так как он производит крошечные липидные капли, которые могут вызвать респираторный дискомфорт.
- Обезвоживают обрезанную ткань путем постепенного переноса в 80 мл 50%, 70%, 90% и 100% этанола. При переносе кассет из одной концентрации в другую обязательно нанесите их на чистую папиросную бумагу, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- Встраивание парафина
- Включите машину для встраивания парафина не менее чем за 1 ч до использования, чтобы расплавить парафин и чтобы станции достигли желаемых температур. Заполните стальную форму расплавленным парафиновым воском, поместив его на горячую поверхность, затем извлеките по одной кассете за раз из контейнера с парафином.
- Переместите стальную форму с горячей на холодную поверхность (4 °C). В этот момент воск в форме начнет затвердевать. Прежде чем он полностью затвердеет, поместите ткань в воск с помощью щипцов и сориентируйте ткань так, чтобы часть диска зрительного нерва задней чашки была обращена к основанию формы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань не двигается и сохраняет желаемую ориентацию. Если нет, поместите форму обратно на теплую рабочую поверхность до тех пор, пока весь парафин не разжижится, затем начните снова с шага 1.4.2. - Как только воск в форме начнет затвердевать, немедленно поместите основание кассеты поверх формы. Аккуратно заполните форму парафином над верхним краем кассеты и медленно перенесите ее на холодную поверхность (около -20 °C) для быстрого затвердевания. Пока он не затвердеет, повторите процесс с другими кассетами из шага 1.4.2.
- Как только все формы затвердеют, отделите стальную форму от кассеты. Если это трудно, подождите немного дольше и повторите попытку (не удаляйте его с силой). Сепарация становится легче после полного затвердевания. Теперь кассета становится основанием парафинового блока, который будет удерживаться во время секционирования микротомом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот блок можно хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования. На этом этапе процесс может быть остановлен и продолжен позже (при необходимости).
- Секционирование
- Установите одноразовое микротомовое лезвие в держатель лезвия. Удалите лишний парафиновый воск вокруг кассет, чтобы верхняя и нижняя части блоков оставались параллельны ножу. Установите блок на держатель кассеты.
- Разблокируйте ручное колесо, чтобы продвинуть его до тех пор, пока поверхность блока не соприкоснется с лезвием ножа. Обрежьте избыток парафинового воска на блоке до тех пор, пока ткань не будет визуализирована на поверхности блока. Установите толщину сечения на 5 мкм и перережьте ленту из пяти-шести секций.
- С помощью щипцов аккуратно перенесите ленту на поверхность предварительно нагретой водяной бани (около 50 °C), чтобы развернуть ленту. Соберите секции на стеклянной горке, покрытой альбумином Майера, удерживая слайд под секцией. Осторожно поднимите секции и дайте горкам высохнуть горизонтально в течение ночи при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно хранить при комнатной температуре в сухих ящиках в течение нескольких месяцев. На этом этапе процесс может быть остановлен и продолжен позже.
- Окрашивание
- Нагрейте предметные стекла для окрашивания в горячей воздушной печи при 60 °C в течение 1 часа перед использованием, чтобы парафин расплавился, и выполните действия, указанные в таблице 1.
ВНИМАНИЕ: Пятна гематоксилина и эозина токсичны при вдыхании или приеме внутрь. Сообщалось, что они являются канцерогенными.
- Нагрейте предметные стекла для окрашивания в горячей воздушной печи при 60 °C в течение 1 часа перед использованием, чтобы парафин расплавился, и выполните действия, указанные в таблице 1.
| Реагент | Стоячее время | Повторение (количество раз) |
| Ксилол | 5 мин | 2 |
| 100% этанол | 5 мин | 2 |
| 90% этанол | 5 мин | 2 |
| 70% этанола | 5 мин | 2 |
| 50% этанол | 5 мин | 2 |
| Вода | 5 мин | 2 |
| Гематоксилин | 4 мин | 1 |
| Промывка водой | ||
| 1% кислый спирт в 70% этаноле | 30 с | 1 |
| Промывка водой | ||
| Вода Скотта | 1 мин | 1 |
| Промывка водой | ||
| 50% этанол | 1 мин | 1 |
| 95% этанол | 1 мин | 1 |
| 0,25% Эозин | 5 с | 1 |
| Промывка водой | ||
| Вода | 2 мин | 1 |
| 95% этанол | 1 мин | 1 |
| 100% этанол | 1 мин | 1 |
| Ксилол | 5 мин | 2 |
| Крепление и крышка | ||
Таблица 1. Процедура окрашивания гематоксилина и эозина
2. Анализ разрушения гематоэнцефалического барьера
- Забор крови и стекловидного тела
- Обезболить самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель) с использованием кетамина (80 мг / кг) и ксилазина (8 мг / кг). Подтвердите состояние анестетика с помощью рефлекса снятия педали (защемление пальца ноги). Немедленно соберите 1 мл крови путем пункции сердца в трубку, покрытую этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), чтобы отделить плазму от цельной крови.
- Усыпляют крысу, используя высокую дозу пентобарбитала (150 мг/кг), вводимую через внутрибрюшинный путь. Отсутствие обнаруживаемого сердцебиения подтверждает смерть в течение 2-5 мин. Энуклеарьте глаз и сразу же поместите его на сухой лед.
- Поместите глаз в чистую чашку Петри над сухим льдом (рекомендуется) и начните рассекать глаз, как указано в шаге 1.2.2.
- Снимите хрусталик, осторожно вытяните стекловидное тело из задней чашки с помощью микрощипцов и поместите его в гомогенизационную трубку, содержащую три-четыре стеклянных шарика (2-4 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение на сухом льду рекомендуется, так как удаление хрусталика и стекловидного тела легче в условиях замерзания.
- Подготовка образцов
- Гомогенизировать стекловидное тело в гомогенизаторе бисера на средней скорости в течение 10 с.
- Перенесите образцы крови (1 мл) и стекловидного тела (10-20 мкл) в микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте оба образца при 5200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае успешной гомогенизации стекловидное тело имеет равномерную консистенцию после центрифугирования. Однако в случае неравномерной консистенции стекловидного тела повторить с этапа 2.2.1 с увеличенным временем гомогенизации. - Соберите супернатант из обоих образцов и разбавьте стекловидное тело и образцы плазмы в соотношении 1:10 и 1:20 соответственно с помощью PBS.
- Количественная оценка белка и соотношение белка стекловидного тела и плазмы
- Чтобы количественно оценить концентрацию белка в образцах стекловидного тела и плазмы, добавьте 5 мкл разбавленных образцов к 250 мкл реагента Брэдфорда, хорошо перемешайте и прочитайте абсорбцию при 590 нм в течение 40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если величина абсорбции образцов превышает 1,0, дополнительно разбавьте образцы и повторите процедуру, описанную на этапе 2.2.3. - Нормализуйте уровень белка стекловидного тела до уровня белка плазмы у той же крысы и измерьте разницу в складках между здоровыми и диабетическими крысами.
- Чтобы количественно оценить концентрацию белка в образцах стекловидного тела и плазмы, добавьте 5 мкл разбавленных образцов к 250 мкл реагента Брэдфорда, хорошо перемешайте и прочитайте абсорбцию при 590 нм в течение 40 мин.
3. Флуоресцентная ангиография
- FITC-декстран70000 краситель для инъекций
- Обезболить самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель) с использованием 3% изофлурана и подтвердить рефлекс снятия педали (защемление пальца ноги). Окуните хвост в стакан, содержащий теплую воду (37-40 °C). Очистите хвост 70% этанолом перед инъекцией красителя. Найдите боковую вену хвоста и отметьте положение инъекции в нижней части хвоста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если введение иглы не удается, попробуйте вставить в другое место выше текущего положения (кончик к основанию хвоста). Тем не менее, рекомендуется вводить один раз, так как повторное покалывание может привести к развитию стресса у крысы, что может вызвать сужение сосудов. - Вводят 1 мл 50 мг/мл раствора красителя FITC-dextran70000 через хвостовую вену и дают красителю циркулировать в течение 5 мин. Усыпляют крысу высокой дозой пентобарбитала (150 мг/кг), вводимой внутрибрюшинным путем. Отсутствие обнаруживаемого сердцебиения подтверждает смерть в течение 2-5 мин. Энуклеат глаза, как указано в шаге 1.1.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости глаз можно зафиксировать в 4% растворе формальдегида, не более чем на 30 мин.
- Обезболить самца крысы Wistar в возрасте от 2 до 3 месяцев вместе с соответствующим возрасту контролем (от 14 до 15 недель) с использованием 3% изофлурана и подтвердить рефлекс снятия педали (защемление пальца ноги). Окуните хвост в стакан, содержащий теплую воду (37-40 °C). Очистите хвост 70% этанолом перед инъекцией красителя. Найдите боковую вену хвоста и отметьте положение инъекции в нижней части хвоста.
- Подготовка плоского крепления
- Для подготовки плоских креплений держите инструменты для рассечения наготове вместе с направляющими и крышками. Поместите глаз в чашку Петри, наполненную охлажденным PBS, и начните рассекать глаз, как описано в шаге 1.2.2.
- Теперь поместите кончик заостренного щипца между склерой и сетчаткой. Осторожно переместите его по всему краю чашки, убедившись, что сетчатка не прикреплена к склере в любой точке. Если есть какие-либо препятствия, медленно отрежьте эту часть вдоль обода с помощью изогнутых микроножек.
- Как только подтвердится, что сетчатка не прикреплена к склере с какой-либо стороны, разрезают возле диска зрительного нерва, сделав небольшое отверстие таким, что сетчатка полностью отделяется от склеры. Медленно протолкните сетчатку в раствор PBS и поместите ее на чистый плоский слайд с помощью шпателя или щипцов.
- С помощью микроножек или лезвий скальпеля сделайте незначительные надрезы в ткани сетчатки, разделив ее на четыре квадранта. Убедитесь, что разрезы находятся на расстоянии не менее 2 мм от отверстия, оставленного оптическим диском в центре, как показано на рисунке 1.
- Удалите излишки PBS с боков ткани с помощью наконечников 0,2 мл, не нарушая плоское крепление.
- Поместите каплю антивядающей монтажной среды (от 50 мкл до 100 мкл) на плоское крепление, накройте крышкой и визуализируйте сразу под конфокальным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте минимальный свет в течение всей процедуры.
- Визуализация плоского крепления
- Визуализируйте плоское крепление под 10-кратным объективом конфокального микроскопа. Выполните сканирование плиток, чтобы захватить все плоское крепление в виде одного образа. Количество плиток зависит от размера плоского крепления сетчатки. Также выполняют Z-укладку для визуализации вен и артерий в разных очагах (предпочтительный размер для Z-стека составляет 5 мкм, в зависимости от которого, количество шагов Z-стека варьируется).
- Используйте детекторы PMT и HyD при % выигрыша в 700-900 и 100-150 соответственно. Выберите диапазон излучения от 510 до 530 нм для красителя FITC-dextran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гистология сетчатки
В диабетической сетчатке клетки сетчатки подвергаются дегенерации. Кроме того, толщина слоев сетчатки увеличивается из-за отеков22. Изображения, полученные после окрашивания гематоксилином и эозином, могут быть использованы для подсчета клеток и измерения толщины различных слоев, как показано на рисунке 2 с использованием ImageJ.
Анализ разрушения барьера сетчатки крови
Поскольку BRB скомпрометирован у крыс с диабетом, утечка становится заметной, что приводит к накоплению биомолекул из плазмы в сетчатку и стекловидное тело. У крыс с диабетом утечка белка из плазмы в стекловидное тело примерно в три раза выше по сравнению со здоровыми крысами (рисунок 3). Белок может быть оценен с использованием любого метода набора, такого как метод Лоури, метод бицинхониновой кислоты (BCA) или метод Брэдфорда (упомянутый в этой статье, раздел 2.3). Рекомендуется свежее рассечение глаза, так как задержка в обработке может привести к сильной спайке стекловидного тела со сетчаткой, что затруднит отделение. Неправильное отделение стекловидного тела от сетчатки может привести к ложноположительным результатам.
Флуоресцентная ангиография
Этот метод используется для визуализации утечки сетчатки и сосудистой системы, включая микро- и макро-сосудистую систему. Подбор размера FITC-декстрана основывается на его применении для различных исследований. Низкомолекулярный FITC-декстран, в пределах 4-6 кДа, используется для визуализации утечки в сосудистой системе. Напротив, высокомолекулярные молекулы FITC-декстрана, в диапазоне от 70 кДа до 2 миллионов Da, используются для визуализации ангиогенеза. Успешная инъекция красителя приводит к визуализации всей сосудистой системы плоского крепления сетчатки, как показано на рисунке 4. Полученные изображения после конфокальной микроскопии могут быть использованы для определения площади сосудистой системы, занятой во всей сетчатке, с помощью программного обеспечения ImageJ для сравнения здоровых и больных групп.
Рисунок 1. Подготовка к плоскому креплению сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Гистологические изображения здоровой и диабетической сетчатки. (A) и (B) представляют собой окрашенные H&E изображения сетчатки контрольной (A) и диабетической крысы (B) под 40x. Общая толщина сетчатки и каждого слоя увеличивается при диабетических состояниях (С). Сокращения: PRL = слой фоторецептора, ONL = внешний ядерный слой, OPL = внешний плексиформный слой, INL = внутренний ядерный слой, IPL = внутренний плексиформный слой и GCL = слой ганглиозных клеток. Данные представлены в виде среднего ± SD. * представляет собой существенное отличие от контрольной группы (P < 0,0001), тогда как # представляет собой существенное отличие от контрольной группы при P < 0,05, полученное тестом ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Разрушение гемато-ретинального барьера у здоровых и диабетических крыс. График представляет соотношение белка стекловидной плазмы здоровых и диабетических крыс. Данные представлены в виде среднего ± SEM. * представляет собой существенное отличие от контрольной группы (P < 0,01), полученное методом непарного t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Флуоресцентная ангиография сосудистой системы сетчатки. (A) и (B) представляют собой плоское крепление сетчатки, визуализированное сканированием плитки и сшиванием изображений под 10x. (A) представляет контрольную сетчатку, (B) представляет диабетическую сетчатку. Белая стрелка указывает на утечку. Все изображения были получены с помощью Z-стека (толщина 5 мкм). Шкалы в (A) и (B) составляют 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гистология
Гистология сетчатки проводится для визуализации морфологических изменений клеток и слоев сетчатки. Необходимо оптимизировать различные этапы, включая выбор фиксирующего раствора, продолжительность фиксации, обезвоживание и пропитку парафином. Размер ткани не должен превышать 3 мм, так как фиксирующее проникновение становится медленным. Обычно используемый 4% параформальдегид приводит к отслоению сетчатки даже в здоровом глазу из-за относительно высокой осмолярности раствора по сравнению с водной и стекловидной влагой, что приводит к ложноположительным результатам23. Высокая осмолярность раствора приводит к сокращению объема и приводит к усадке тканей. Фиксирующий раствор, используемый в этом протоколе, представляет собой 1% формальдегид с 1,25% глутаровым альдегидом, который имеет относительно меньшую осмолярность, уменьшает искажение тканей, минимизирует отслоение сетчатки от пигментного эпителиального слоя сетчатки, а также сохраняет структуру в ее родном состоянии. Другим выбором фиксирующего раствора является уксусная кислота и этанол с формальдегидом. Кислотное состояние фиксирующего раствора может помочь в быстрой фиксации тканей, в то время как этанол улучшает проникновение фиксирующего раствора. Однако оптимизация соотношения этанола и уксусной кислоты имеет важное значение, поскольку избыточная концентрация может привести к усадке или отеку ткани, соответственно24. Параметры оценки для успешной фиксации тканей включают отслоение сетчатки, неповрежденные слои сетчатки и усадку тканей. Другим критическим фактором при выполнении фиксации является объем фиксирующего раствора, который должен быть как минимум в 20-25 раз больше размера глаза для правильной фиксации25. Кроме того, важно закручивать глазное яблоко или ткань при переносе из одного раствора в другой, чтобы оно не прилипало к дну или стенкам контейнера.
Неполная обработка тканей, включая обезвоживание и пропитку парафином, может сжиматься и сушить ткань, что можно визуализировать, когда депрессия возникает на поверхности блока. Кроме того, плохая обработка тканей также приведет к окрашиванию участков в белый цвет при воздействии воды25. Если ткань не обработана правильно, ее можно взять обратно через ксилол для удаления парафина с последующей регидратацией в понижении этанола (то есть 100% этанола, 90% этанола и 70% этанола). Повторите шаги от 1,3 до 1,4, чтобы успешно подготовить парафиновые блоки.
При приготовлении парафиновых блоков важно убедиться, что ткань со всех сторон окружена парафином и не видно пузырьков воздуха. Любая ошибка в приготовлении блока приведет к неудачному срезанию ткани. Иногда задняя чашечка складывается во время обработки; в этот момент его можно аккуратно раздвинуть с помощью щипцов (в нагретом парафине), но не в той степени, в которой он повреждает ткань. Предположим, что ориентация ткани в стальной форме не такая желательная, пока парафин начинает затвердевать; в этом случае его можно поместить обратно в расплавленный парафин и ткань для повторной ориентации ткани для приготовления парафиновых блоков. Кроме того, при переносе ткани во встраиваемую форму убедитесь, что парафин вокруг ткани не затвердевает. Он создает разделение волосяного покрова между тканью и встраивающей средой (парафином) в блок25. Если это произойдет, расплавите парафин вокруг ткани, поместив его в горячий парафин и снова поместив в стальную форму.
Во время разрезания лезвие должно быть достаточно острым, чтобы дать развернутые ленты ткани. Не используйте определенную часть лезвия более 30 раз. Если блок не срезается должным образом, предположим, что лезвие тупое и, следовательно, замените его или повторно заточите. Если секции не являются правильными, это также может быть связано с неправильной пропиткой парафина или использованием старого парафина для пропитки и приготовления блоков. Парафин в блоке можно расплавить, а свежий парафин можно использовать для приготовления блока. Чтобы избежать неровных участков, медленно вращайте колесо микротома с ровными поворотами, а не быстрыми, отрывистыми движениями.
При выполнении окрашивания гематоксилином и эозином оптимизация времени окрашивания гематоксилина и эозина имеет решающее значение, поскольку это может привести к недостаточному или чрезмерному окрашиванию тканей. Неправильное расплавление парафина или регидратация ткани приведет к неравномерному окрашиванию. Его можно визуализировать как белые участки на слайде. Обезвоживают ткань и снова расплавляют парафин в печи с горячим воздухом, следуя шагам, указанным в таблице 1. Кроме того, одной из распространенных ошибок, выполняемых во время окрашивания H&E, является использование спирта в качестве дегидранта после окрашивания Эозина. Чрезмерное употребление алкоголя может привести к недостаточному окрашиванию цитоплазмы и включению тел, что может привести к плохо окрашенным участкам25. Использование монтажной среды следует делать сразу после удаления избытка ксилола и избегать высыхания ксилола, так как это может привести к искажению ткани. Кроме того, следует избегать монтирования на водной основе (например, глицерина в PBS), поскольку ткань находится в обезвоженном состоянии. Монтажник на водной основе не проникает в ткани и приводит к туманным изображениям.
После оптимизации всех шагов, упомянутых выше, исследователи смогут успешно выполнить гистологию. Требуется около трех попыток выбрать желаемое фиксирующее решение и оптимизировать другие параметры процесса.
Разрушение гемато-ретинального барьера
Самым деликатным шагом в этой технике является изоляция стекловидного тела от глаза. Лучше всего его выполнять на свежем глазу. Использование сухого льда рекомендуется для легкой изоляции стекловидного тела, особенно если стекловидное тело остается прикрепленным к сетчатке. Часто смесь хрусталика или сетчатки со стекловидным телом может быть идентифицирована по мутности стекловидного тела из-за сетчатки. Этих проблем обычно можно избежать, используя условия замерзания. Однако, если стекловидные метки находятся рядом с линзой, их можно разделить, разрезав на пересечении хрусталика и стекловидного тела с помощью микроножек. Если сетчатка вытягивается вместе со стекловидным телом, сетчатку можно удалить по частям с помощью микрощипцов. Использование фильтрующей центрифугации также предлагается для легкой изоляции стекловидного тела от хрусталика и сетчатки26. Поскольку стекловидное тело представляет собой гелеобразную структуру, оно нуждается в гомогенизации для однородной смеси белков. Обычно, как упоминалось на этапе 2.2.1, для правильной гомогенизации достаточно одного цикла гомогенизации, который может быть идентифицирован путем сжижения стекловидного тела при центрифугировании. Если после центрифугирования наблюдается гелевая природа стекловидного тела, повторяют гомогенизацию (этап 2.2.1). Количественная оценка белка может быть выполнена с использованием любого метода набора, но должна быть чувствительна к обнаружению низких уровней белка в стекловидном теле до 2 мкг/мкл.
Флуоресцентная ангиография
Этот метод направлен на визуализацию сосудистой сети сетчатки, и, следовательно, краситель должен равномерно достигать микрососудов сетчатки. Для обеспечения этого могут быть оптимизированы различные этапы, такие как место инъекции и время циркуляции. Краситель может быть введен с помощью инъекции в хвостовую вену или сердечной инъекции. Сердечная инъекция рискует ввести краситель в место, отличное от сердца, если оно плохо обучено; поэтому предпочтительна инъекция в хвостовую вену. Однако идентифицировать боковую вену легко при погружении в теплую воду (37-40 °C) и очистке 70% этанолом. Этанол помогает расширить кровеносные сосуды, что может помочь в доступе к расположению вены. Также важно, чтобы краситель вводился только в вену. Неспособность ввести краситель в хвостовую вену может ощущаться сопротивлением при инъекции красителя или выпуклости близлежащей области из-за подкожной инъекции. Игла может быть удалена и повторно вставлена в другой участок хвоста. Успешная инъекция хвостовой вены также может быть визуализирована принудительным мочеиспусканием крысы; цвет красителя виден в моче крыс в течение 30 - 40 с.
Кроме того, время циркуляции имеет важное значение; обычно для успешного циркуляции красителя в сосудах сетчатки достаточно от 5 до 10 минут. Плоское крепление может быть приготовлено свежим глазом или фиксированным глазом. Подготовка плоского крепления на свежем глазу может быть сложной задачей, но после освоения техника является наиболее предпочтительной, так как во время фиксации краситель начинает просачиваться в фиксирующий раствор27. Поэтому фиксация не должна затягиваться более чем на 30 мин для всего глаза. В случае затруднения отделения свежей сетчатки ее можно даже зафиксировать в фиксаторном растворе (4% формальдегид) после отделения задней чашки от передней чашки в течение 15-20 мин. Часто видно, что краситель просачивается из кровеносных сосудов в окружающие ткани, даже в здоровую сетчатку. Это может быть связано с избыточной фиксацией; следовательно, время, необходимое для фиксации, должно быть оптимизировано. Это только усиливает легкую изоляцию сетчатки и сохраняет структуру для будущего использования. Более того, повышенное время циркуляции красителя у животного также может привести к утечке красителя из сосудов сетчатки в окружающие ткани, что необходимо оптимизировать.
Размер FITC-декстрана имеет важное значение, так как краситель с более высокой молекулярной массой не будет попадать в микро-сосуды. Напротив, краситель с более низкой молекулярной массой будет просачиваться из новых сосудов здоровой сетчатки28. Поэтому FITC-декстран с молекулярной массой 70 кД предпочтительнее для выполнения флуоресцентной ангиографии, для визуализации утечки и сосудистой системы в сетчатке. Однако существенным ограничением этого метода является продолжительность развития неоваскуляризации у крыс с диабетом и инвазивная процедура исследования, которая может быть заменена в будущем неинвазивными методами, такими как электроретинограмма, глазное дно и другие неинвазивные оптические инструменты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Индийский совет медицинских исследований (ICMR; ITR-2020-2882) для финансирования поддержки д-ра Нирмала Дж. Мы также хотели бы поблагодарить Университетский грант Комиссии за предоставление младшей исследовательской стипендии Манише Малани и Центральному аналитическому лабораторному центру, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада для предоставления инфраструктурного объекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
