Summary
糖尿病性網膜症は、失明の主な原因の1つです。組織学、血液網膜関門破壊アッセイ、および蛍光血管造影は、網膜の病態生理学を理解するための貴重な技術であり、糖尿病性網膜症に対する効率的な薬物スクリーニングをさらに強化することができる。
Abstract
糖尿病性網膜症のような後部眼疾患は、網膜の生理機能を変化させる。糖尿病性網膜症は、網膜剥離、血液網膜関門(BRB)の破壊、および網膜血管新生を特徴とする。in vivoラットモデルは、網膜の構造と機能の変化を調べるための貴重な実験ツールです。我々は、網膜細胞、網膜血管系、および損なわれたBRBの形態学的変化を同定するために、ラットモデルにおいて3つの異なる実験技術を提案する。網膜組織学は、様々な網膜細胞の形態を研究するために使用される。また、定量的測定は、異なる網膜層の網膜細胞数および厚さ測定によって行われる。BRBブレークダウンアッセイは、BRBの分解による血漿から硝子体組織への眼外タンパク質の漏れを決定するために使用される。蛍光血管造影は、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化することにより、血管新生および血管の漏出を研究するために使用される。
Introduction
糖尿病性網膜症(DR)は、真性糖尿病の最も複雑な二次合併症の1つです。また、世界中の生産年齢人口における予防可能な失明の主な原因でもあります。3,240万人の盲人を対象とした最近のメタアナリシスでは、83万人(2.6%)がDR1のために失明した。糖尿病に起因する視力喪失の割合は、2015年に1.06%(0.15-2.38)で世界第7位にランクされました2,3。
糖尿病性網膜症は、後眼組織の血管異常によって診断される。臨床的には、網膜における血管新生に基づいて、非増殖性DR(NPDR)および増殖性DR(PDR)の2つの段階に分けられる。高血糖は、網膜の神経変性4,5、炎症6,7、および微小血管系8に関与するいくつかの経路に関与するため、DRの強力な調節因子と考えられています。高血糖のために誘発される複数の代謝合併症には、終末糖化産物(AGE)、ポリオール経路、ヘキソサミン経路、およびプロテインキナーゼ-C経路の蓄積が含まれる。これらの経路は、糖尿病性網膜症の異なる段階に基づく細胞増殖(内皮細胞)、遊走(周皮細胞)、およびアポトーシス(神経網膜細胞、周皮細胞、および内皮細胞)の原因である。これらの代謝変化は、網膜剥離、網膜細胞の喪失、血液網膜関門(BRB)の破壊、動脈瘤、血管新生などの生理学的変化につながる可能性があります9。
ストレプトゾトシン(STZ)誘発性1型糖尿病は、糖尿病の病因およびその合併症を評価するためのラットにおいて十分に確立され、広く受け入れられている慣行である。STZの糖尿病誘発作用は、膵島β細胞の選択的破壊によるものである10。その結果、動物はインスリン欠乏症、高血糖、多飲症、多尿症を受け、これらはすべてヒト1型糖尿病の特徴です11。重度の糖尿病誘発の場合、STZは成人期に静脈内または腹腔内に40〜65mg / kg体重で投与される。約72時間後、これらの動物は250mg / dLを超える血糖値を示す10,12。
神経変性、炎症、および血管新生による網膜の生理学的変化を理解するためには、実験動物モデルにおいて異なる技術を最適化するべきである。網膜細胞および網膜血管の構造的および機能的変化は、組織学、BRBブレークダウンアッセイ、および蛍光血管造影法などの様々な技術によって研究することができる。
組織学は、顕微鏡レベルでの細胞、組織、および器官の解剖学の研究を含む。それは細胞/組織の構造と機能の間の相関関係を確立します。組織構造の微視的な変化を視覚化および同定するためにいくつかのステップが実行され、それによって健康な対応物と罹患した対応物を比較する13。したがって、組織学の各ステップを細心の注意を払って標準化することが不可欠です。網膜組織学に関与する様々なステップは、標本の固定、標本のトリミング、脱水、透明化、パラフィンによる含浸、パラフィン包埋、切片化、および染色(ヘマトキシリンおよびエオジン染色)13,14である。
健康な網膜では、網膜を横切る分子の輸送は、内側の内皮細胞と周皮細胞、外側の網膜色素上皮細胞で構成されるBRBによって制御されます。しかし、内部BRB内皮細胞および周皮細胞は、罹患状態の間に変性を開始し、BRBも損なわれる15。このBRB分解により、多くの低分子量分子が硝子体組織および網膜組織に漏れ出す16。病気が進行するにつれて、他の多くのタンパク質分子(低分子量および高分子量)も恒常性障害のために硝子体および網膜組織に漏れます17。それは様々な他の合併症、そして最終的には黄斑浮腫および失明をもたらす。したがって、硝子体内のタンパク質レベルを定量化し、健常状態と糖尿病状態を比較して、損なわれたBRBを測定する。
蛍光血管造影は、蛍光色素を用いて網膜や脈絡膜の血液循環を研究するために使用される技術である。これは、静脈内経路または心臓注射 を介して フルオレセイン色素を注入することによって、網膜および脈絡膜の血管系を視覚化するために使用される18。色素が注入されると、最初に網膜動脈に到達し、続いて網膜静脈に到達する。この染料の循環は、通常、染料19の注入から5〜10分以内に完了する。糖尿病性網膜症や脈絡膜血管新生を含む様々な後部眼疾患を診断することは重要な技術です20。これは、正常および罹患状態における大小の血管系変化を検出するのに役立ちます。
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Protocol
このプロトコルは、ハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニにある機関動物倫理委員会が提供するすべての動物ケアガイドラインに従います。
1. 網膜組織学
- 眼の核生成と固定
- 生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、腹腔内経路を介して注射した高用量のペントバルビタール(150mg/kg)を用いて、年齢適合対照(14~15週齢)と共に安楽死させる。検出可能な心拍は、2〜5分以内に死亡を確認することはありません。
- メスの刃を使って眼の鼻側頭部および側頭部に切開を行って眼球を有核化する。次に、鉗子とマイクロハサミを使用してその縁に沿って切断し、眼窩ソケットから目を取り除きます。
注:ラットを犠牲にする前に、固定液を準備しておいてください。
警告: ホルムアルデヒドは、皮膚、目、鼻、気道を刺激します。それはまた、強力な皮膚感作剤であるため、癌を引き起こす可能性があります。手袋を着用し、ボンネットの下で取り扱ってください21。 - シャーレ内のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液10mLで眼を十分に洗浄し、血液を除去した。固定液の浸透を容易にするために、目を囲む余分な脂肪を取り除きます。
- 鉗子の助けを借りてすぐに5mLの固定液に目を置き、ガラスバイアルの壁にくっついていないことを確認してください。数秒間優しくかき混ぜ、キャップを適切なラベルと交換してください。眼を固定液中で室温の暗条件下で24〜48時間インキュベートする。
- 組織のトリミング
- 固定後、固定液から眼球を取り出し、10 mLのPBSで洗浄し、これを10 mLのPBSを入れたシャーレに入れ、4°Cで冷却した。
- マイクロ鉗子を使用して、視神経で目を保持し、マイクロハサミの助けを借りて パースプラナ でニックネームを作ります。角膜の縁全体を切断して、眼の前部カップを分離する。鉗子を使ってレンズをそっと摘んで捨て、視神経を切ってください。
- 湾曲したマイクロハサミを使用して、後眼杯の縦断面を作り、視ディスクを通過して2つの半分に分割する。カセットのベースに置き、組織に支障をきたすことなく蓋を適切に閉じます。カセットに組織サンプル名と日付をラベル付けします。
- 組織の脱水、透明化、およびパラフィン含浸
- 50%、70%、90%、および100%エタノールの80mL中で徐々に移すことによってトリミングされた組織を脱水する。カセットをある濃度から別の濃度に移すときは、汚染を最小限に抑えるために清潔なティッシュペーパーにカセットテープを貼ってください。
メモ:各転写で組織を30分間(2回)放置します。このステップに費やされる合計時間は約 4 時間です。 - 脱水後、カセットを80mLのキシレンに30分間(2回)移し、エタノールをキシレンで置換した。
注:キシレンとのインキュベーション後、組織は半透明になります。
警告: キシレンはベンゼン環を持つ芳香族化合物です。それは目や粘膜を刺激し、またうつ病を引き起こす可能性があります。 - 最後に、組織中のキシレンを置換するために60°Cで予め加熱したパラフィンを組織に含浸させる。キシレン含有量を最小限に抑えるためにカセットをティッシュペーパーに数回軽くたたき、200mLのパラフィン(60°Cで液体)に2時間(1時間x2)入れます。
注意: 溶けたパラフィンは小さな脂肪滴を生じるため、吸入は呼吸不快感を引き起こす可能性があるため、避けてください。
- 50%、70%、90%、および100%エタノールの80mL中で徐々に移すことによってトリミングされた組織を脱水する。カセットをある濃度から別の濃度に移すときは、汚染を最小限に抑えるために清潔なティッシュペーパーにカセットテープを貼ってください。
- パラフィン埋め込み
- パラフィンを溶かし、ステーションが所望の温度に達するために使用する前に、少なくとも1時間前にパラフィン包埋機の電源を入れてください。溶融したパラフィンワックスをスチールモールドで満たし、熱い表面に置き、パラフィン容器から一度に1つのカセットを取り外します。
- 鋼金型を高温表面から低温表面(4°C)に移動します。この時点で、金型内のワックスが固化し始めます。それが完全に固まる前に、鉗子の助けを借りて組織をワックスに入れ、後部カップの視神経椎間板部分が型の底に向くように組織を向ける。
メモ:組織が動かないようにし、目的の向きを維持してください。そうでない場合は、パラフィン全体が液化するまで金型を暖かい作業面に戻してから、ステップ1.4.2からやり直します。 - 金型内のワックスが固化し始めたら、すぐにカセットベースを金型の上に置きます。カセットの上端より上のパラフィンで金型を慎重に充填し、急速に凝固させるために冷たい表面(-20°C付近)にゆっくりと移します。固まるまで、ステップ1.4.2の他のカセットでこのプロセスを繰り返します。
- すべての金型が固まったら、スチール金型をカセットから分離します。難しい場合は、もう少し待ってからもう一度やり直してください(無理に外さないでください)。完全な固化により分離が容易になる。今カセットはミクロトームによる切片化中に保持されるパラフィンブロックの基部となる。
注:このブロックは、さらに使用するために室温で保存することができます。この時点で、プロセスを停止し、後で続行できます (必要な場合)。
- セクショニング
- 使い捨てミクロトームブレードをブレードホルダーに取り付けます。カセットの周りの余分なパラフィンワックスを取り除き、ブロックの上部と下部の両方がナイフと平行になるようにします。ブロックをカセットホルダーに合わせます。
- ハンドホイールのロックを解除して、ブロックの表面がナイフの端に接触するまで前進させます。組織がブロックの表面に視覚化されるまで、ブロック上の余分なパラフィンワックスをトリミングします。断面の厚さを5μmに設定し、5~6本の断面のリボンを切断する。
- 鉗子を使用して、リボンを予め加温した水浴(約50°C)の表面に静かに移し、リボンを広げます。メイヤーのアルブミンでコーティングされたスライドガラスの断面を、その断面の下にスライドを持って集めます。切片を静かに持ち上げ、スライドを水平に37°Cで一晩乾燥させます。
メモ:スライドは、ドライボックスに室温で数ヶ月間保管することができます。このステップでは、プロセスを停止し、後で続行できます。
- 染色
- パラフィンが溶融するために使用前に60°Cの熱風オーブンで染色されるスライドを1時間加熱し、 表1に記載の手順に従ってください。
注意:ヘマトキシリンとエオジンの汚れは、吸入または摂取すると有毒です。それらは発癌性であることが報告されている。
- パラフィンが溶融するために使用前に60°Cの熱風オーブンで染色されるスライドを1時間加熱し、 表1に記載の手順に従ってください。
| 試薬 | スタンディングタイム | 繰り返し (回数) |
| キシレン | 5分 | 2 |
| 100%エタノール | 5分 | 2 |
| 90%エタノール | 5分 | 2 |
| 70%エタノール | 5分 | 2 |
| 50%エタノール | 5分 | 2 |
| 水 | 5分 | 2 |
| ヘマトキシリン | 4分 | 1 |
| 水洗い | ||
| 70%エタノール中の1%酸性アルコール | 30秒 | 1 |
| 水洗い | ||
| スコットの水 | 1分 | 1 |
| 水洗い | ||
| 50%エタノール | 1分 | 1 |
| 95%エタノール | 1分 | 1 |
| 0.25% エオシン | 5 秒 | 1 |
| 水洗い | ||
| 水 | 2分 | 1 |
| 95%エタノール | 1分 | 1 |
| 100%エタノール | 1分 | 1 |
| キシレン | 5分 | 2 |
| マウント剤とカバースリップ | ||
表 1.ヘマトキシリンおよびエオジン染色手順
2. 血液脳関門破壊アッセイ
- 血液と硝子体の採取
- 生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、ケタミン(80mg/kg)およびキシラジン(8mg/kg)を用いて年齢適合対照(14~15週間)とともに麻酔する。ペダル離脱反射(つま先ピンチ)により麻酔状態を確認する。直ちに心臓穿刺により1mLの血液をエチレンジアミン四酢酸(EDTA)被覆チューブに集め、血漿を全血から分離する。
- 腹腔内経路を通して注射された高用量のペントバルビタール(150mg / kg)を用いてラットを安楽死させる。検出可能な心拍は、2〜5分以内に死亡を確認することはありません。目を核形成し、すぐにドライアイスの上に置きます。
- ドライアイスの上のきれいなペトリ皿に目を置き (推奨)、手順 1.2.2 で説明したように眼の解剖を開始します。
- レンズを取り外し、マイクロ鉗子を使用してガラス質を後部カップから慎重に引き出し、3〜4個のガラスビーズ(2〜4mm)を含む均質化チューブに入れます。
注: ドライアイスの解剖は、凍結条件下ではレンズと硝子体の取り外しが容易であるため、推奨されます。
- サンプルの調製
- ビーズホモジナイザーでガラス質のユーモアを中速で10秒間均質化します。
- 血液(1 mL)および硝子体サンプル(10-20 μL)を微量遠心チューブに移し、両方のサンプルを5200 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
注:ホモジナイゼーションが成功した場合、硝子体は遠心分離後に均一な一貫性を有する。ただし、硝子体の不均一な稠度の場合は、均質化時間を長くしてステップ2.2.1から繰り返す。 - 両方のサンプルから上清を収集し、血漿サンプルをPBSでそれぞれ1:10および1:20の比率で希釈する。
- タンパク質定量と硝子体-血漿タンパク質比
- 硝子体液および血漿サンプル中のタンパク質濃度を定量するには、希釈サンプル5 μLを250 μLのブラッドフォード試薬に加え、よく混合し、40分以内に590 nmでの吸光度を読み取る。
注: サンプルの吸収値が 1.0 を超える場合は、サンプルをさらに希釈し、手順 2.2.3 の手順を繰り返します。 - 硝子体タンパク質レベルを同じラットの血漿タンパク質レベルに正規化し、健康なラットと糖尿病のラットのフォールド差を測定します。
- 硝子体液および血漿サンプル中のタンパク質濃度を定量するには、希釈サンプル5 μLを250 μLのブラッドフォード試薬に加え、よく混合し、40分以内に590 nmでの吸光度を読み取る。
3. 蛍光血管造影
- FITCデキストラン70000 染料注入
- 生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、年齢一致対照(14~15週)とともに3%イソフルランを用いて麻酔し、ペダル離脱反射(つま先ピンチ)を確認した。温水(37-40°C)を入れたビーカーに尾を浸します。染料を注入する前に、70%エタノールで尾をきれいにしてください。尾の側静脈の位置を確認し、尾の下部の注射位置をマークします。
メモ: 針の挿入に失敗した場合は、現在の位置より上の別の位置(先端を尾の付け根まで)に挿入してみます。しかし、繰り返し刺すとラットのストレス発症につながり、血管収縮を引き起こす可能性があるため、一度注射することをお勧めします。 - 50 mg/mL の FITC-デキストラン70000 色素溶液 1 mL を尾静脈から注入し、色素を 5 分間循環させます。腹腔内経路を介して注射された高用量のペントバルビタール(150mg / kg)でラットを安楽死させる。検出可能な心拍は、2〜5分以内に死亡を確認することはありません。ステップ 1.1.1 で説明したように、目を離核させます。
注:必要に応じて、目は4%ホルムアルデヒド溶液で30分以内に固定することができます。
- 生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、年齢一致対照(14~15週)とともに3%イソフルランを用いて麻酔し、ペダル離脱反射(つま先ピンチ)を確認した。温水(37-40°C)を入れたビーカーに尾を浸します。染料を注入する前に、70%エタノールで尾をきれいにしてください。尾の側静脈の位置を確認し、尾の下部の注射位置をマークします。
- フラットマウントの準備
- フラットマウントを準備するには、スライドとカバースリップと一緒に解剖ツールを準備しておいてください。冷えたPBSで満たされたペトリ皿に目を置き、ステップ1.2.2で述べたように眼の解剖を開始します。
- 次に、強膜と網膜の間に尖った鉗子の先端を置きます。カップの縁に沿って静かに動かし、網膜がどの時点でも強膜に付着していないことを確認します。障害物がある場合は、湾曲したマイクロはさみを使用してリムに沿ってその部分をゆっくりと切断します。
- 網膜がどの側からも強膜に付着していないことを確認したら、視ディスクの近くで切り取り、網膜が強膜から完全に剥離するように小さな穴を開けます。網膜をPBS溶液にゆっくりと押し込み、ヘラまたは鉗子の助けを借りて清潔な平らなスライドの上に置きます。
- マイクロハサミまたはメス刃を使用して、網膜組織に小さな切り傷をつけ、それを4つの象限に分割する。 図 1 に示すように、中央の光ディスクが残した穴から切り込みが少なくとも 2 mm 離れていることを確認します。
- フラットマウントを乱すことなく、0.2 mLチップを使用して組織の側面から余分なPBSを除去します。
- フェード防止マウント培地(50 μL~100 μL)をフラットマウントの上に置き、カバースリップで覆い、共焦点顕微鏡ですぐに視覚化します。
メモ: 手順全体を通して、最小限の光を維持してください。
- フラットマウントの可視化
- 共焦点顕微鏡の10倍の対物レンズの下でフラットマウントを視覚化します。タイルスキャンを実行して、フラットマウント全体を単一のイメージとしてキャプチャします。タイルの数は、網膜フラットマウントのサイズに依存する。また、Zスタッキングを実行して、異なる病巣の静脈および動脈を視覚化する(Zスタックの好ましいサイズは5μmであり、それに応じてZスタックステップの数は変化する)。
- PMTおよびHyD検出器を%ゲインでそれぞれ700-900および100-150として使用します。FITCデキストラン色素の発光範囲を510~530nmの範囲で選択してください。
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Representative Results
網膜組織学
糖尿病性網膜では、網膜細胞は変性を受ける。さらに、浮腫22のために網膜層の厚さが増加する。ヘマトキシリンおよびエオジン染色後に得られた画像は、ImageJを用いて 図2 に示すように、細胞数および異なる層の厚さの測定に使用することができる。
血液網膜関門破壊アッセイ
糖尿病ラットにおいてBRBが損なわれると、漏出が顕著になり、血漿から網膜および硝子体への生体分子の蓄積につながる。糖尿病ラットでは、血漿から硝子体へのタンパク質漏出は、健康なラットと比較して約3倍高い(図3)。タンパク質は、ローリー法、ビシンコニン酸(BCA)法、ブラッドフォード法(本稿のセクション2.3で言及)などの任意のキット法を使用して推定することができる。処理の遅れが網膜との強い硝子体接着につながり、分離が困難になる可能性があるため、眼を新たに解剖することが推奨される。網膜からの硝子体の不適切な分離は、偽陽性の結果につながる可能性があります。
蛍光血管造影
この技術は、網膜の漏出および血管系を視覚化するために使用される, マイクロおよびマクロ血管系を含みます.FITC−デキストランのサイズの選択は、様々な研究のためのその適用に基づいている。4〜6kDaの範囲の低分子量FITC−デキストランは、血管系における漏出を視覚化するために使用される。対照的に、70kDa〜200万Daの範囲の高分子量FITC−デキストラン分子は、血管新生を視覚化するために使用される。色素の注入が成功すると、図4に示すように、網膜フラットマウントの血管系全体を視覚化する 結果が得られます。共焦点顕微鏡検査後に得られた画像を使用して、ImageJソフトウェアを使用して網膜全体に占める血管系の領域を決定し、健常群と罹患群を比較することができる。
図1.網膜フラットマウント調製。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.健康な対糖尿病性網膜の組織学画像。(A)および(B)は、40x以下の対照(A)および糖尿病ラット(B)のH&E染色網膜画像を表す。網膜および各層の全体的な厚さは、糖尿病状態において増加する(C)。略語:PRL = 感光体層、ONL = 外顆粒層、OPL = 外側網状層、INL = 内顆粒層、IPL = 内側網状層、および GCL = 神経節細胞層。*は対照群(P±0.0001)との有意差を表し、一方#はANOVA検定により得られたP<0.05における対照群との有意差を表す<。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.健康なラットと糖尿病ラットの血液網膜障壁の破壊。 グラフは、健常ラット対糖尿病ラットの硝子体血漿タンパク質比を表す。*は、不対t検±定により得られた対照群(P<0.01)との有意差を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.網膜血管系の蛍光血管造影。(A)および(B)は、タイルスキャンおよび10x下で画像をステッチすることによって視覚化された網膜のフラットマウントを表し、(A)は対照網膜を表し、(B)は糖尿病性網膜を表す。白矢印は漏れを示します。全ての画像はZスタック(厚さ5μm)により得た。(A)と(B)のスケールバーは0.5 mmです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
組織学
網膜組織学は、網膜細胞および層の形態学的変化を視覚化するために行われる。固定液の選択、固定期間、脱水、パラフィン含浸など、さまざまなステップを最適化する必要があります。固定液の浸透が遅くなるため、組織サイズは3mmを超えてはならない。一般的に使用される4%パラホルムアルデヒドは、房水および硝子体液と比較して溶液の浸透圧が比較的高いため、健康な眼においても網膜剥離をもたらし、偽陽性の結果をもたらす23。溶液の高い浸透圧は、体積収縮をもたらし、組織の収縮をもたらす。このプロトコルで使用される固定液は、1%ホルムアルデヒドと1.25%グルタルアルデヒドであり、これは比較的低い浸透圧を有し、組織の歪みを減少させ、網膜色素上皮層からの網膜剥離を最小限に抑え、また構造をその天然状態で保存する。固定液の別の選択肢は、酢酸およびエタノールとホルムアルデヒドである。固定液の酸性状態は組織の迅速な固定を助け、エタノールは固定液の浸透を改善する。しかし、エタノールと酢酸の比率を最適化することは、過剰濃度がそれぞれ組織の収縮または腫脹につながる可能性があるため、不可欠です24。組織固定を成功させるための評価パラメータには、網膜の剥離、無傷の網膜層、および組織の収縮が含まれる。固定を行う際のもう1つの重要な要素は固定液の量であり、これは適切な固定のために眼の大きさの少なくとも20〜25倍でなければならない25。さらに、ある溶液から別の溶液に移されるたびに眼球または組織を渦巻き、容器の底または壁にくっつかないようにすることが重要です。
脱水およびパラフィンによる含浸を含む不完全な組織処理は、ブロックの表面に窪みが生じたときに視覚化され得る収縮および乾燥組織を収縮および乾燥させることができる。さらに、不十分な組織処理はまた、水にさらされると切片が白色に着色する結果にもなる25。組織が正しく処理されない場合は、キシレンを通してパラフィンを除去し、続いてエタノール(すなわち、100%エタノール、90%エタノール、および70%エタノール)で再水和することができる。ここでも、1.3 ~ 1.4 の手順を繰り返して、パラフィンブロックを正常に準備します。
パラフィンブロックを調製する際には、組織がパラフィンによって四方八方から囲まれ、気泡が見えないことを確認することが不可欠です。ブロックの準備を間違えると、組織の切片化が失敗します。時々、後部カップは処理中に折り畳まれます。この時点で、鉗子(加熱パラフィン中)を使用して静かに引き離すことができますが、組織を損傷する程度ではありません。パラフィンが固化し始める間、鋼鋳型の組織配向が望ましくないと仮定する。その場合、融解したパラフィンと組織を元に戻して組織の向きを変えてパラフィンブロックを調製することができる。また、包埋型に組織を移しながら、組織の周囲のパラフィンが固化しないようにする。ブロック25内の組織と包埋剤(パラフィン)との間にヘアライン分離を作成する。それが起こった場合は、熱いパラフィンに入れて組織の周りのパラフィンを溶かし、再びスチールモールドに入れます。
切片化の間、ブレードは、組織の折り畳まれたリボンを与えるのに十分なほど鋭くなければならない。ブレードの特定の部分を30回以上使用しないでください。ブロックが正しく切断されない場合は、ブレードが鈍いと仮定して、ブレードを交換するか、研ぎ直してください。セクションが適切でない場合は、不適切なパラフィン含浸または古いパラフィンを使用して含浸させ、ブロックを準備することも原因である可能性があります。ブロック内のパラフィンを溶かすことができ、新鮮なパラフィンを使用してブロックを調製することができる。不均一な部分を避けるために、ミクロトームの車輪を速くてぎくしゃくした動きではなく、均等に回転させてゆっくりと回転させます。
ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行う間、ヘマトキシリンおよびエオジン染色の時間を最適化することは、組織を過小染色または過剰染色する可能性があるため、重要である。パラフィンの不適切な融解または組織の再水和は、不均一な染色につながる。スライド上の白いセクションとして視覚化できます。組織を脱水し、再び熱風オーブン中でパラフィンを溶融し、続いて表1に記載したステップを踏んだ。さらに、H&E染色中に行われる一般的なエラーの1つは、Eosin染色後の脱水剤としてアルコールを使用することです。アルコールの過剰使用は、細胞質および封入体の過小染色につながり、染色不良切片につながる可能性がある25。マウント剤培地の使用は、過剰なキシレンを除去した直後に行う必要があり、組織の歪みにつながる可能性があるため、キシレンの乾燥は避けてください。また、水性ベースのマウント剤(PBS中のグリセロールなど)は、組織が脱水状態にあるため避けなければならない。水性ベースのマウント剤は組織に浸透せず、ぼやけた画像をもたらします。
上記のすべてのステップを最適化すると、研究者は組織学を正常に実行できるようになります。所望の固定液溶液を選択し、他のプロセスパラメータを最適化する試みをファイスするのに約3回かかる。
血液網膜関門の破壊
この技術の最も繊細なステップは、硝子体を眼から隔離することである。それは新鮮な目で最もよく行われます。硝子体を簡単に分離するには、特に硝子体が網膜に付着したままの場合は、ドライアイスの使用をお勧めします。多くの場合、硝子体との水晶体または網膜混入は、網膜に起因する硝子体の濁りによって識別することができる。これらの問題は、通常、凍結条件を使用して回避することができます。ただし、ガラス質タグがレンズの横にある場合は、マイクロハサミを使用してレンズとガラス質の交点で切断することで分離できます。網膜が硝子体とともに引き抜かれると、微小鉗子を用いて網膜を一つ一つ取り除くことができます。フィルター遠心分離の使用は、水晶体および網膜からの硝子体を容易に単離するためにも示唆される26。硝子体はゲル状構造であるため、タンパク質の均質な混合物のために均質化が必要である。通常、ステップ2.2.1で述べたように、単一の均質化サイクルは、遠心分離時の硝子体液の液化によって同定することができる適切な均質化のために十分である。遠心分離後に硝子体のゲル状の性質が認められる場合は、ホモジナイズを繰り返す(工程2.2.1)。タンパク質の定量は、任意のキット法を使用して行うことができますが、ガラス質中の低タンパク質レベルを最大 2 μg/μL まで検出することに敏感でなければなりません。
蛍光血管造影
この技術は網膜の血管網を視覚化することを目的としており、したがって、色素は網膜微小血管に均等に到達しなければならない。これを確実にするために、注射部位や循環時間など、さまざまなステップを最適化することができます。染料は、尾静脈注射または心臓注射 を介して 注射することができる。心臓注射は、十分に訓練されていない場合、心臓以外の部位に色素を注入するリスクがあります。したがって、尾静脈注射が好ましい。しかし、温水(37〜40°C)に浸漬し、70%エタノールで洗浄すると、側静脈の識別が容易である。エタノールは血管を拡張するのを助け、静脈の位置にアクセスするのを助けることができます。染料が静脈にのみ注入されることも不可欠です。尾静脈に色素を注入できないことは、皮下注射により色素を注入したり、近くの領域を膨らませたりしながら抵抗によって感じることができる。針は取り外して、尾の別の部位に再挿入することができます。成功した尾静脈注射は、ラットの強制排尿によって視覚化することもできる。染料の色は、30〜40秒以内にラットの尿中に見える。
また、循環時間は不可欠です。通常、5〜10分で網膜血管内の色素を正常に循環させるのに十分である。フラットマウントは、新鮮な目または固定された目で準備することができます。新鮮な目でフラットマウントを準備することは困難な場合がありますが、一度習得すると、固定中に色素が固定液中に漏れ始めるため、この技術が最も好ましい27。したがって、固定は目全体に対して30分以上延長してはならない。新鮮な網膜を分離するのが難しい場合は、後部カップを前部カップから15〜20分間分離した後、固定液(4%ホルムアルデヒド)に固定することさえできます。健康な網膜でも、色素が血管から周囲の組織に漏れることがよく見られます。これは、過度の固定が原因である可能性があります。したがって、固定に必要な時間を最適化する必要があります。それは網膜の容易な分離を高め、将来の使用のために構造を保存するだけです。さらに、動物における色素の循環時間の増加は、網膜血管から周辺組織への色素漏出にもつながりかねず、これは最適化される必要がある。
FITC−デキストランのサイズは、より高い分子量の色素が微小血管系に侵入しないので必須である。対照的に、より低分子量の色素は健康な網膜の新しい血管から漏れるでしょう28。したがって、分子量70kDのFITC−デキストランは、蛍光血管造影を行い、網膜における漏出および血管系を視覚化するために好ましい。しかし、この技術の重大な制限は、糖尿病ラットにおける新生血管形成の発達期間および研究の侵襲的手順であり、将来的には網膜電図、眼底、および他の非侵襲的光学機器などの非侵襲的技術によって置き換えられる可能性がある。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、インド医学研究評議会(ICMR;ITR-2020-2882)は、Nirmal J博士への資金援助のため。また、マニシャ・マラニとハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニ中央分析研究所施設にジュニア・リサーチ・フェローシップを提供し、インフラ施設を提供してくれた大学助成金にも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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