Summary
La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.
Abstract
Une maladie oculaire du segment postérieur comme la rétinopathie diabétique modifie la physiologie de la rétine. La rétinopathie diabétique se caractérise par un décollement de la rétine, une rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) et une angiogenèse rétinienne. Un modèle de rat in vivo est un outil expérimental précieux pour examiner les changements dans la structure et la fonction de la rétine. Nous proposons trois techniques expérimentales différentes dans le modèle du rat pour identifier les changements morphologiques des cellules rétiniennes, du système vasculaire rétinien et de la BRB compromise. L’histologie rétinienne est utilisée pour étudier la morphologie de diverses cellules rétiniennes. En outre, la mesure quantitative est effectuée par le nombre de cellules rétiniennes et la mesure de l’épaisseur de différentes couches rétiniennes. Un test de dégradation BRB est utilisé pour déterminer la fuite de protéines extraoculaires du plasma vers le tissu vitré en raison de la dégradation de BRB. L’angiographie par fluorescence est utilisée pour étudier l’angiogenèse et les fuites des vaisseaux sanguins en visualisant le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran.
Introduction
La rétinopathie diabétique (DR) est l’une des complications secondaires les plus complexes du diabète sucré. C’est aussi la principale cause de cécité évitable dans la population en âge de travailler dans le monde. Dans une méta-analyse récente portant sur 32,4 millions de personnes aveugles, 830 000 (2,6%) personnes étaient aveugles en raison de DR1. La proportion de perte de vision attribuée au diabète se classait au septième rang en 2015 à 1,06% (0,15-2,38) dans le monde2,3.
La rétinopathie diabétique est diagnostiquée par des anomalies vasculaires dans les tissus oculaires postérieurs. Cliniquement, il est divisé en deux étapes - DR non proliférative (NPDR) et DR proliférative (PDR), en fonction de la vascularisation de la rétine. L’hyperglycémie est considérée comme le puissant régulateur de la RD car elle implique plusieurs voies impliquées dans la neurodégénérescence4,5, l’inflammation6,7 et la microvascularisation8 dans la rétine. Les multiples complications métaboliques induites par l’hyperglycémie comprennent l’accumulation de produits finaux de glycation avancée (AGE), de la voie polyol, de la voie hexosamine et de la voie protéine kinase-C. Ces voies sont responsables de la prolifération cellulaire (cellules endothéliales), de la migration (péricytes) et de l’apoptose (cellules rétiniennes neurales, péricytes et cellules endothéliales) en fonction des différents stades de la rétinopathie diabétique. Ces altérations métaboliques peuvent entraîner des changements physiologiques tels que le décollement de la rétine, la perte de cellules rétiniennes, la dégradation de la barrière hémato-rétinienne (BRB), les anévrismes et l’angiogenèse9.
Le diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) est une pratique bien établie et bien acceptée chez le rat pour évaluer la pathogenèse du diabète et ses complications. Les effets diabétogènes de STZ sont dus à la destruction sélective des îlots pancréatiques β-cellules10. En conséquence, les animaux subiront une carence en insuline, une hyperglycémie, une polydipsie et une polyurie, qui sont toutes caractéristiques du diabète sucré de type 1 humain11. Pour l’induction sévère du diabète, STZ est administré à 40-65 mg / kg de poids corporel par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à l’âge adulte. Après environ 72 h, ces animaux présentent une glycémie supérieure à 250 mg/dL10,12.
Pour comprendre les altérations physiologiques de la rétine dues à la neurodégénérescence, à l’inflammation et à l’angiogenèse, différentes techniques doivent être optimisées dans des modèles animaux expérimentaux. Les changements structurels et fonctionnels dans les cellules rétiniennes et les vaisseaux rétiniens peuvent être étudiés par diverses techniques telles que l’histologie, le test de dégradation BRB et l’angiographie par fluorescence.
L’histologie implique l’étude de l’anatomie des cellules, des tissus et des organes à un niveau microscopique. Il établit une corrélation entre la structure et la fonction des cellules/tissus. Plusieurs étapes sont effectuées pour visualiser et identifier les altérations microscopiques de la structure tissulaire, comparant ainsi les homologues sains et malades13. Par conséquent, il est essentiel de normaliser méticuleusement chaque étape de l’histologie. Diverses étapes de l’histologie rétinienne sont la fixation de l’échantillon, la coupe de l’échantillon, la déshydratation, le nettoyage, l’imprégnation avec de la paraffine, l’incorporation de paraffine, le sectionnement et la coloration (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine)13,14.
Dans une rétine saine, le transport des molécules à travers la rétine est contrôlé par BRB, composé de cellules endothéliales et de péricytes sur la face interne, et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes sur la face externe. Cependant, les cellules endothéliales internes du BRB et les péricytes commencent à dégénérer pendant la maladie, et le BRB est également compromis15. En raison de cette dégradation de la BRB, de nombreuses molécules de faible poids moléculaire s’infiltrent dans le tissu vitré et rétinien16. Au fur et à mesure que la maladie progresse, de nombreuses autres molécules protéiques (poids moléculaire faible et élevé) s’infiltrent également dans les tissus vitrés et rétiniens en raison de troubles de l’homéostasie17. Il conduit à diverses autres complications et finalement à l’œdème maculaire et à la cécité. Par conséquent, la quantification des niveaux de protéines dans le vitré et la comparaison des états sains et diabétiques ont compromis la BRB.
L’angiographie par fluorescence est une technique utilisée pour étudier la circulation sanguine de la rétine et de la choroïde à l’aide d’un colorant fluorescent. Il est utilisé pour visualiser le système vasculaire de la rétine et de la choroïde en injectant du colorant fluorescéine par voie intraveineuse ou par injection cardiaque18. Une fois le colorant injecté, il atteint d’abord les artères rétiniennes, suivies des veines rétiniennes. Cette circulation du colorant est généralement terminée dans les 5 à 10 minutes suivant l’injection du colorant19. C’est une technique importante pour diagnostiquer diverses maladies oculaires du segment postérieur, y compris la rétinopathie diabétique et la néovascularisation choroïdienne20. Il aide à détecter les changements vasculaires majeurs et mineurs dans les conditions normales et malades.
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Protocol
Ce protocole suit toutes les directives de soins aux animaux fournies par le Comité institutionnel d’éthique animale, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad.
1. Histologie rétinienne
- Énucléation et fixation de l’œil
- Euthanasier un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le témoin apparié selon l’âge (âgé de 14 à 15 semaines) à l’aide d’une dose élevée de pentobarbital (150 mg / kg) injectée par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes.
- Énucléez l’œil en faisant des incisions à l’aide d’une lame de scalpel sur les régions nasale et temporale de l’œil. Ensuite, coupez le long de ses bords à l’aide de pinces et de micro-ciseaux pour retirer l’œil de l’orbite orbitale.
REMARQUE: Avant de sacrifier des rats, gardez les solutions fixatrices prêtes.
ATTENTION : Le formaldéhyde irrite la peau, les yeux, le nez et les voies respiratoires. Il peut également causer le cancer car il est un puissant sensibilisant cutané. Portez des gants et manipulez-les sous le capot21. - Lavez soigneusement les yeux avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de Pétri pour éliminer le sang. Enlevez l’excès de graisse entourant l’œil pour une pénétration facile de la solution fixatrice.
- Placez immédiatement l’œil dans 5 mL de solution fixatrice à l’aide de pinces et assurez-vous qu’il n’est pas collé aux parois des flacons en verre. Remuez doucement pendant quelques secondes et remplacez le bouchon par un étiquetage approprié. Incuber l’œil en solution fixatrice pendant 24 à 48 h dans des conditions sombres à température ambiante.
- Rognage des tissus
- Après fixation, retirer l’œil de la solution fixatrice, laver avec 10 mL de PBS et le placer dans une boîte de Petri contenant 10 mL de PBS réfrigérée à 4 °C.
- À l’aide de micro-pinces, maintenez l’œil avec le nerf optique et faites une entaille au pars plana à l’aide de micro ciseaux. Coupez toute la marge de la cornée pour séparer la coupe antérieure d’un œil. À l’aide d’une pince, prenez doucement la lentille, jetez-la et coupez le nerf optique.
- À l’aide de micro-ciseaux incurvés, faites une section longitudinale de l’œillet postérieur, en passant à travers le disque optique en le divisant en deux moitiés. Placez-le dans la base de la cassette et fermez correctement le couvercle sans perturber les tissus. Étiquetez les cassettes avec le nom et la date de l’échantillon de tissu.
- Déshydratation, nettoyage et imprégnation paraffine des tissus
- Déshydrater les tissus coupés par transfert progressif dans 80 mL d’éthanol à 50 %, 70 %, 90 % et 100 %. Lors du transfert des cassettes d’une concentration à une autre, assurez-vous de les tamponner sur du papier de soie propre pour minimiser la contamination.
REMARQUE: Laissez le tissu rester dans chaque transfert pendant 30 minutes (deux fois). Le temps total consommé pour cette étape est d’environ 4 h. - Lors de la déshydratation, transférer les cassettes dans 80 mL de xylène pendant 30 min (deux fois) pour remplacer l’éthanol par du xylène.
REMARQUE: Après l’incubation avec du xylène, le tissu devient translucide.
ATTENTION : Le xylène est un composé aromatique avec un cycle benzénique. Il irrite les yeux et les muqueuses et peut également provoquer des dépressions. - Enfin, imprégner le tissu avec de la paraffine préchauffée à 60 °C pour remplacer le xylène dans le tissu. Tamponner les cassettes plusieurs fois sur du papier de soie pour minimiser la teneur en xylène et placer dans 200 mL de paraffine (liquide à 60 °C) pendant 2 h (1 h x 2).
ATTENTION: Évitez d’inhaler de la paraffine fondue, car elle produit de minuscules gouttelettes lipidiques qui peuvent causer une gêne respiratoire.
- Déshydrater les tissus coupés par transfert progressif dans 80 mL d’éthanol à 50 %, 70 %, 90 % et 100 %. Lors du transfert des cassettes d’une concentration à une autre, assurez-vous de les tamponner sur du papier de soie propre pour minimiser la contamination.
- Intégration de paraffine
- Allumez la machine d’enrobage de paraffine au moins 1 h avant utilisation pour faire fondre la paraffine et pour que les stations atteignent les températures souhaitées. Remplissez un moule en acier avec de la cire de paraffine fondue en le plaçant sur une surface chaude, puis retirez une cassette à la fois du récipient de paraffine.
- Déplacez le moule en acier d’une surface chaude à une surface froide (4 °C). À ce stade, la cire dans le moule commencera à se solidifier. Avant qu’il ne se solidifie complètement, placez le tissu dans de la cire à l’aide d’une pince et orientez le tissu de sorte que la partie du disque optique de la coupe postérieure soit orientée vers la base du moule.
REMARQUE: Assurez-vous que le tissu ne bouge pas et conserve l’orientation souhaitée. Si ce n’est pas le cas, remettez le moule sur la surface de travail chaude jusqu’à ce que toute la paraffine se liquéfie, puis recommencez à l’étape 1.4.2. - Lorsque la cire dans le moule commence à se solidifier, placez immédiatement la base de la cassette sur le dessus du moule. Remplissez soigneusement le moule avec de la paraffine au-dessus du bord supérieur de la cassette et transférez-le lentement sur une surface froide (près de -20 ° C) pour une solidification rapide. Jusqu’à ce qu’il se solidifie, répétez le processus avec d’autres cassettes de l’étape 1.4.2.
- Une fois tous les moules solidifiés, séparez le moule en acier de la cassette. Si c’est difficile, attendez un peu plus longtemps et réessayez (ne le retirez pas de force). La séparation devient plus facile à la solidification complète. Maintenant, la cassette devient la base du bloc de paraffine à maintenir pendant la section par microtome.
REMARQUE: Ce bloc peut être stocké à température ambiante pour une utilisation ultérieure. À ce stade, le processus peut être arrêté et poursuivi plus tard (si nécessaire).
- Sectionnement
- Installez une lame de microtome jetable dans le porte-lame. Enlevez l’excès de cire de paraffine autour des cassettes afin que les parties supérieure et inférieure des blocs restent parallèles au couteau. Placez le bloc sur le support de cassette.
- Déverrouillez le volant pour l’avancer jusqu’à ce que la surface du bloc soit en contact avec le bord du couteau. Coupez l’excès de cire de paraffine sur le bloc jusqu’à ce que le tissu soit visualisé à la surface du bloc. Réglez l’épaisseur de la section à 5 μm et coupez un ruban de cinq à six sections.
- À l’aide d’une pince, transférez doucement le ruban sur la surface du bain-marie préchauffé (environ 50 °C) pour déplier le ruban. Collectez des sections sur une lame de verre recouverte d’albumine de Mayer en tenant la lame sous la section. Soulevez doucement les sections et laissez les glissières sécher horizontalement pendant la nuit à 37 °C.
REMARQUE: Les lames peuvent être stockées à température ambiante dans des boîtes sèches pendant plusieurs mois. À cette étape, le processus peut être arrêté et poursuivi plus tard.
- Coloration
- Chauffer les lames à teindre dans un four à air chaud à 60 °C pendant 1 h avant de les utiliser pour que la paraffine fonde, et suivre les étapes mentionnées dans le tableau 1.
ATTENTION : Les taches d’hématoxyline et d’éosine sont toxiques lorsqu’elles sont inhalées ou ingérées. Ils ont été signalés comme étant cancérigènes.
- Chauffer les lames à teindre dans un four à air chaud à 60 °C pendant 1 h avant de les utiliser pour que la paraffine fonde, et suivre les étapes mentionnées dans le tableau 1.
| Réactif | Temps d’arrêt | Répétition (nombre de fois) |
| Xylène | 5 min | 2 |
| 100% Éthanol | 5 min | 2 |
| Éthanol à 90 % | 5 min | 2 |
| 70% d’éthanol | 5 min | 2 |
| Éthanol à 50 % | 5 min | 2 |
| Eau | 5 min | 2 |
| Hématoxyline | 4 min | 1 |
| Lavage à l’eau | ||
| 1% d’alcool acide dans 70% d’éthanol | 30 s | 1 |
| Lavage à l’eau | ||
| L’eau de Scott | 1 min | 1 |
| Lavage à l’eau | ||
| Éthanol à 50 % | 1 min | 1 |
| Éthanol à 95 % | 1 min | 1 |
| 0,25% Éosine | 5 s | 1 |
| Lavage à l’eau | ||
| Eau | 2 min | 1 |
| Éthanol à 95 % | 1 min | 1 |
| 100% Éthanol | 1 min | 1 |
| Xylène | 5 min | 2 |
| Mountant et couvercle | ||
Tableau 1. Procédure de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
2. Test de dégradation de la barrière hémato-encéphalique
- Prélèvement sanguin et vitré
- Anesthésier un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le témoin apparié selon l’âge (14 à 15 semaines) en utilisant de la kétamine (80 mg / kg) et de la xylazine (8 mg / kg). Confirmer l’état anesthésique par réflexe de retrait de la pédale (pincement de l’orteil). Prélever immédiatement 1 mL de sang par ponction cardiaque dans un tube revêtu d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour séparer le plasma du sang total.
- Euthanasier le rat à l’aide d’une forte dose de pentobarbital (150 mg/kg), injectée par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes. Énucléez l’œil et placez-le immédiatement sur de la glace carbonique.
- Placez l’œil dans une boîte de Petri propre au-dessus de la glace carbonique (recommandé) et commencez à disséquer l’œil comme mentionné à l’étape 1.2.2.
- Retirez la lentille, tirez soigneusement le vitré de la coupelle postérieure à l’aide de micro-pinces et placez-la dans un tube d’homogénéisation contenant trois à quatre billes de verre (2-4 mm).
REMARQUE: La dissection sur la glace carbonique est recommandée car le retrait de la lentille et du vitré est plus facile dans des conditions de gel.
- Préparation des échantillons
- Homogénéiser l’humeur vitrée dans un homogénéisateur de perles à vitesse moyenne pendant 10 s.
- Transférer les échantillons de sang (1 mL) et de vitre (10-20 μL) dans les tubes de microcentrifugation et centrifuger les deux échantillons à 5200 x g pendant 10 min à 4 °C.
REMARQUE: En cas d’homogénéisation réussie, le vitré a une consistance uniforme après centrifugation. Cependant, dans le cas d’une consistance non uniforme du vitré, répétez à partir de l’étape 2.2.1 avec un temps d’homogénéisation accru. - Prélever un surnageant dans les deux échantillons et diluer l’humeur vitrée et les échantillons de plasma dans un rapport de 1:10 et 1:20, respectivement, avec PBS.
- Quantification des protéines et rapport protéines vitréo-plasmatiques
- Pour quantifier la concentration en protéines dans les échantillons d’humeur vitrée et de plasma, ajoutez 5 μL d’échantillons dilués à 250 μL de réactif de Bradford, mélangez bien et lisez l’absorbance à 590 nm en 40 minutes.
REMARQUE: Si la valeur d’absorption des échantillons est supérieure à 1,0, diluer davantage les échantillons et répéter la procédure de l’étape 2.2.3. - Normalisez le niveau de protéines vitréennes au niveau de protéines plasmatiques du même rat et mesurez la différence de pli entre les rats sains et diabétiques.
- Pour quantifier la concentration en protéines dans les échantillons d’humeur vitrée et de plasma, ajoutez 5 μL d’échantillons dilués à 250 μL de réactif de Bradford, mélangez bien et lisez l’absorbance à 590 nm en 40 minutes.
3. Angiographie par fluorescence
- Injection de colorant FITC-dextran70000
- Anesthésiez un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le contrôle apparié à l’âge (14 à 15 semaines) à l’aide d’isoflurane à 3% et confirmez le réflexe de retrait de la pédale (pincement des orteils). Trempez la queue dans un bécher contenant de l’eau tiède (37-40 °C). Nettoyez la queue avec 70% d’éthanol avant d’injecter le colorant. Localisez la veine latérale de la queue et marquez la position d’injection dans la partie inférieure de la queue.
REMARQUE: Si l’insertion de l’aiguille échoue, essayez d’insérer à un autre endroit au-dessus de la position actuelle (pointe à la base de la queue). Cependant, il est conseillé d’injecter une fois car des piqûres répétées peuvent entraîner un développement de stress chez le rat, ce qui pourrait provoquer une vasoconstriction. - Injecter 1 mL de solution de colorant FITC-dextran70000 de 50 mg/mL dans la veine caudale et laisser circuler le colorant pendant 5 min. Euthanasier le rat avec une forte dose de pentobarbital (150 mg / kg), injecté par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes. Énucléez l’œil comme mentionné à l’étape 1.1.1.
REMARQUE: Si nécessaire, l’œil peut être fixé dans une solution de formaldéhyde à 4%, pendant 30 minutes au maximum.
- Anesthésiez un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le contrôle apparié à l’âge (14 à 15 semaines) à l’aide d’isoflurane à 3% et confirmez le réflexe de retrait de la pédale (pincement des orteils). Trempez la queue dans un bécher contenant de l’eau tiède (37-40 °C). Nettoyez la queue avec 70% d’éthanol avant d’injecter le colorant. Localisez la veine latérale de la queue et marquez la position d’injection dans la partie inférieure de la queue.
- Préparation du montage plat
- Pour préparer des supports plats, gardez les outils de dissection prêts avec les glissières et les couvercles. Placez l’œil dans une boîte de Petri remplie de PBS réfrigéré et commencez à disséquer l’œil comme mentionné à l’étape 1.2.2.
- Maintenant, placez la pointe d’une pince pointue entre la sclérotique et la rétine. Déplacez-le doucement tout le long du bord de la coupe, en vous assurant que la rétine n’est attachée à la sclérotique à aucun moment. S’il y a une obstruction, coupez lentement cette partie le long de la jante à l’aide de micro-ciseaux incurvés.
- Une fois qu’il est confirmé que la rétine n’est attachée à la sclérotique d’aucun côté, coupez près du disque optique, en faisant un petit trou tel que la rétine se détache complètement de la sclérotique. Poussez lentement la rétine dans une solution PBS et placez-la sur une lame plate propre à l’aide d’une spatule ou d’une pince.
- À l’aide de micro-ciseaux ou de lames de scalpel, faites des coupes mineures dans le tissu rétinien, en le divisant en quatre quadrants. Assurez-vous que les coupes sont à au moins 2 mm du trou laissé par le disque optique au centre, comme illustré à la figure 1.
- Enlevez l’excès de PBS des côtés du tissu à l’aide d’embouts de 0,2 mL sans perturber le support plat.
- Placez une goutte de support de montage anti-décoloration (50 μL à 100 μL) sur un support plat, couvrez avec un couvercle et visualisez immédiatement sous un microscope confocal.
REMARQUE: Maintenez un minimum de lumière pendant toute la procédure.
- Visualisation du montage plat
- Visualisez la monture plate sous l’objectif 10x d’un microscope confocal. Effectuez une numérisation de tuiles pour capturer l’ensemble du montage plat en une seule image. Le nombre de tuiles dépend de la taille de la monture plate rétinienne. En outre, effectuez un empilement Z pour visualiser les veines et les artères dans différents foyers (la taille préférée pour Z-stack est de 5 μm, selon laquelle, le nombre d’étapes Z-stack varie).
- Utilisez le détecteur PMT et HyD à % de gain comme 700-900 et 100-150, respectivement. Choisissez une plage d’émission comprise entre 510 et 530 nm pour le colorant FITC-dextran.
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Representative Results
Histologie rétinienne
Dans la rétine diabétique, les cellules rétiniennes subissent une dégénérescence. De plus, l’épaisseur des couches rétiniennes augmente en raison de l’œdème22. Les images obtenues après coloration à l’hématoxyline et à l’éosine peuvent être utilisées pour le comptage cellulaire et la mesure de l’épaisseur de différentes couches, comme le montre la figure 2 à l’aide d’ImageJ.
Test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne
Comme le BRB est compromis chez les rats diabétiques, les fuites deviennent importantes, conduisant à l’accumulation de biomolécules du plasma à la rétine et au vitré. Chez les rats diabétiques, les fuites de protéines du plasma vers le vitré sont environ trois fois plus élevées que chez les rats en bonne santé (Figure 3). Les protéines peuvent être estimées à l’aide de n’importe quelle méthode en kit telle que la méthode de Lowry, la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA) ou la méthode de Bradford (mentionnée dans cet article, section 2.3). Il est recommandé de disséquer fraîchement l’œil, car un retard dans le traitement pourrait entraîner une forte adhérence du vitré avec la rétine, ce qui le rend difficile à séparer. Une mauvaise séparation du vitré de la rétine peut entraîner des résultats faussement positifs.
Angiographie par fluorescence
Cette technique est utilisée pour visualiser les fuites et le vascularisation de la rétine, y compris les micro et macro vascularisations. La sélection de la taille du FITC-dextran est basée sur son application pour diverses études. Le FITC-dextran de faible poids moléculaire, allant de 4 à 6 kDa, est utilisé pour visualiser les fuites dans le système vasculaire. En revanche, des molécules FITC-dextran de haut poids moléculaire, allant de 70 kDa à 2 millions de Da, sont utilisées pour visualiser l’angiogenèse. Une injection réussie de colorant permet de visualiser l’ensemble de la vascularisation de la monture plate rétinienne, comme le montre la figure 4. Les images obtenues après microscopie confocale peuvent être utilisées pour déterminer la zone de vascularisation occupée dans l’ensemble de la rétine à l’aide du logiciel ImageJ pour comparer les groupes sains et malades.
Graphique 1. Préparation rétinienne à montage plat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Images histologiques de la rétine saine vs diabétique. (A) et (B) représentent les images rétiniennes colorées H &E du rat témoin (A) et diabétique (B) de moins de 40x. L’épaisseur globale de la rétine et de chaque couche augmente dans les conditions diabétiques (C). Abréviations : PRL = couche photoréceptrice, ONL = couche nucléaire externe, OPL = couche plexiforme externe, INL = couche nucléaire interne, IPL = couche plexiforme interne et GCL = couche de cellules ganglionnaires. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± et de développement durable. * représente une différence significative par rapport au groupe témoin (P < 0,0001), tandis que # représente une différence significative par rapport au groupe témoin à P < 0,05, obtenu par le test ANOVA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Dégradation de la barrière hémato-rétinienne chez les rats sains par rapport aux rats diabétiques. Le graphique représente le rapport des protéines plasmatiques vitrées des rats sains par rapport aux rats diabétiques. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. * représente une différence significative par rapport au groupe témoin (P < 0,01) obtenue par test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Angiographie par fluorescence du système vasculaire rétinien. (A) et (B) représentent une monture plate de la rétine visualisée par balayage de tuiles et en cousant les images sous 10x. (A) représente la rétine de contrôle, (B) représente la rétine diabétique. La flèche blanche indique une fuite. Toutes les images ont été obtenues par Z-stack (5 μm d’épaisseur). Les barres d’échelle en (A) et (B) sont de 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Histologie
L’histologie rétinienne est réalisée pour visualiser les changements morphologiques des cellules et des couches rétiniennes. Diverses étapes, y compris le choix de la solution fixative, la durée de fixation, la déshydratation et l’imprégnation à la paraffine, doivent être optimisées. La taille des tissus ne doit pas dépasser 3 mm, car la pénétration du fixateur devient lente. Le paraformaldéhyde à 4% couramment utilisé conduit à un décollement de la rétine même dans l’œil sain en raison de l’osmolarité relativement élevée de la solution par rapport à l’humeur aqueuse et à l’humeur vitrée, ce qui conduit à des résultats faussement positifs23. L’osmolarité élevée de la solution entraîne une contraction du volume et entraîne un rétrécissement des tissus. La solution fixative utilisée dans ce protocole est 1% de formaldéhyde avec 1,25% de glutaraldéhyde, qui a relativement moins d’osmolarité, réduit la distorsion tissulaire, minimise le décollement de la rétine de la couche épithéliale pigmentaire rétinienne et préserve également la structure dans son état natif. Un autre choix de solution fixative est l’acide acétique et l’éthanol avec du formaldéhyde. L’état acide de la solution fixatrice peut aider à la fixation rapide des tissus, tandis que l’éthanol améliore la pénétration de la solution fixatrice. Cependant, il est essentiel d’optimiser le rapport entre l’éthanol et l’acide acétique, car une concentration excessive peut entraîner un rétrécissement ou un gonflement des tissus, respectivement24. Les paramètres d’évaluation pour une fixation tissulaire réussie comprennent le décollement de la rétine, les couches rétiniennes intactes et le rétrécissement des tissus. Un autre facteur critique lors de la fixation est le volume de la solution fixative, qui doit être au moins 20 à 25 fois la taille de l’œil pour une fixation correcte25. En outre, il est important de faire tourbillonner le globe oculaire ou le tissu chaque fois qu’il est transféré d’une solution à une autre, afin qu’il ne colle pas au fond ou aux parois du récipient.
Un traitement incomplet des tissus, y compris la déshydratation et l’imprégnation à la paraffine, peut rétrécir et assécher les tissus, ce qui peut être visualisé lorsque la dépression se produit à la surface du bloc. En outre, un mauvais traitement des tissus entraînera également la coloration des sections en blanc lorsqu’elles sont exposées à l’eau25. Si le tissu n’est pas traité correctement, il peut être repris par le xylène pour éliminer la paraffine, suivi d’une réhydratation en downgradient d’éthanol (c.-à-d. éthanol à 100 %, éthanol à 90 % et éthanol à 70 %). Encore une fois, répétez les étapes de 1.3 à 1.4 pour préparer avec succès les blocs de paraffine.
Lors de la préparation des blocs de paraffine, il est essentiel de s’assurer que le tissu est entouré de tous les côtés par de la paraffine et qu’aucune bulle d’air n’est visible. Toute erreur dans la préparation du bloc entraînera une section infructueuse des tissus. Parfois, la coupe postérieure est pliée pendant le traitement; à ce stade, il peut être écarté doucement à l’aide de pinces (dans de la paraffine chauffée), mais pas dans la mesure où il endommage les tissus. Supposons que l’orientation des tissus dans le moule en acier ne soit pas celle souhaitée pendant que la paraffine commence à se solidifier; dans ce cas, il peut être remis à la paraffine fondue et au tissu pour réorienter le tissu afin de préparer des blocs de paraffine. De plus, lors du transfert du tissu dans le moule d’encastrement, assurez-vous que la paraffine autour du tissu ne se solidifie pas. Il crée une séparation de la racine des cheveux entre le tissu et le milieu d’incorporation (paraffine) dans le bloc25. Si cela se produit, faites fondre la paraffine autour du tissu en la plaçant dans de la paraffine chaude et en la plaçant à nouveau dans le moule en acier.
Pendant le sectionnement, la lame doit être suffisamment tranchante pour donner des rubans de tissu dépliés. N’utilisez pas une partie particulière de la lame plus de 30 fois. Si le bloc ne se sectionne pas correctement, supposez que la lame est émoussée et, par conséquent, remplacez-la ou affûtez-la à nouveau. Si les sections ne sont pas appropriées, cela pourrait également être dû à une mauvaise imprégnation de la paraffine ou à l’utilisation de vieille paraffine pour imprégner et préparer des blocs. La paraffine dans le bloc peut être fondue et la paraffine fraîche peut être utilisée pour préparer le bloc. Pour éviter les sections inégales, faites tourner la roue du microtome lentement avec des virages réguliers plutôt que des mouvements rapides et saccadés.
Lors de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, il est essentiel d’optimiser le temps de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, car cela peut entraîner une coloration insuffisante ou excessive des tissus. Une mauvaise fonte de la paraffine ou une réhydratation du tissu entraînera une coloration inégale. Il peut être visualisé comme les sections blanches sur la diapositive. Déshydrater le tissu et faire fondre à nouveau la paraffine dans un four à air chaud, suivi des étapes mentionnées dans le tableau 1. De plus, l’une des erreurs courantes commises lors de la coloration H & E est l’utilisation d’alcool comme déshydratant après la coloration Eosin. Une consommation excessive d’alcool peut entraîner une sous-coloration du cytoplasme et des corps d’inclusion, ce qui peut entraîner des sections mal colorées25. L’utilisation d’un milieu montagnard doit être effectuée immédiatement après l’élimination de l’excès de xylène et éviter le séchage du xylène car cela pourrait entraîner une distorsion du tissu. En outre, les montures à base aqueuse (comme le glycérol dans le PBS) doivent être évitées car le tissu est à l’état déshydraté. Le montagnard à base aqueuse ne pénètre pas dans le tissu et donne des images brumeuses.
En optimisant toutes les étapes mentionnées ci-dessus, les chercheurs seront en mesure d’effectuer l’histologie avec succès. Il faut environ trois tentatives pour choisir la solution fixative souhaitée et optimiser d’autres paramètres de processus.
Dégradation de la barrière hémato-rétinienne
L’étape la plus délicate de cette technique est l’isolement du vitré de l’œil. Il est préférable de l’effectuer sur un œil neuf. L’utilisation de glace carbonique est recommandée pour faciliter l’isolement du vitré, surtout si le vitré reste attaché à la rétine. Souvent, le mélange du cristallin ou de la rétine avec le vitré peut être identifié par la turbidité du vitré due à la rétine. Ces problèmes peuvent généralement être évités en utilisant des conditions de congélation. Cependant, si les étiquettes vitrées sont à côté de la lentille, elles peuvent être séparées en coupant à l’intersection de la lentille et vitrée à l’aide de micro-ciseaux. Si la rétine se retire avec le vitré, la rétine peut être enlevée pièce par pièce à l’aide de micro-pinces. L’utilisation de la centrifugation par filtre est également suggérée pour isoler facilement le vitré du cristallin et de la rétine26. Comme le vitré est une structure gélatineuse, il a besoin d’homogénéisation pour un mélange homogène de protéines. Habituellement, comme mentionné à l’étape 2.2.1, un seul cycle d’homogénéisation est suffisant pour une homogénéisation correcte, qui peut être identifiée par liquéfication de l’humeur vitrée lors de la centrifugation. Si la nature gélatineuse du vitré est observée après centrifugation, répéter l’homogénéisation (étape 2.2.1). La quantification des protéines peut être effectuée à l’aide de n’importe quelle méthode en kit, mais doit être sensible à la détection des faibles niveaux de protéines dans le vitré jusqu’à 2 μg / μL.
Angiographie par fluorescence
Cette technique vise à visualiser le réseau vasculaire de la rétine, et par conséquent, le colorant doit atteindre uniformément dans les microvaisseaux rétiniens. Différentes étapes peuvent être optimisées pour assurer cela, telles que le site d’injection et le temps de circulation. Un colorant peut être injecté par injection de veine caudale ou injection cardiaque. L’injection cardiaque risque d’injecter le colorant à un site autre que le cœur s’il n’est pas bien entraîné; par conséquent, l’injection de la veine caudale est préférable. Cependant, il est facile d’identifier la veine latérale lorsqu’elle est trempée dans de l’eau tiède (37-40 °C) et nettoyée avec de l’éthanol à 70%. L’éthanol aide à dilater les vaisseaux sanguins, ce qui peut aider à accéder à l’emplacement de la veine. Il est également essentiel que le colorant soit injecté dans la veine uniquement. L’échec de l’injection de colorant dans la veine de la queue peut être ressenti par la résistance lors de l’injection du colorant ou gonfler la zone voisine en raison de l’injection sous-cutanée. L’aiguille peut être retirée et réinsérée dans un autre site de la queue. L’injection réussie de la veine caudale peut également être visualisée par la miction forcée du rat; la couleur du colorant est visible dans l’urine de rat dans les 30 à 40 s.
En outre, le temps de circulation est essentiel; habituellement, 5 à 10 min sont suffisantes pour faire circuler le colorant dans les vaisseaux rétiniens avec succès. Un support plat peut être préparé dans un œil neuf ou un œil fixe. Préparer un support plat dans un œil neuf peut être difficile, mais une fois maîtrisé, la technique est la plus préférée car lors de la fixation, le colorant commence à fuir dans une solution fixative27. Par conséquent, la fixation ne doit pas être prolongée de plus de 30 minutes pour tout l’œil. En cas de difficulté à séparer la rétine fraîche, elle peut même être fixée dans une solution fixatrice (4% de formaldéhyde) après avoir séparé la coupe postérieure de la coupe antérieure pendant 15 à 20 min. On voit souvent que le colorant s’échappe des vaisseaux sanguins dans les tissus environnants, même dans la rétine saine. Cela pourrait être dû à une fixation excessive; par conséquent, le temps nécessaire à la fixation devrait être optimisé. Il ne fait qu’améliorer l’isolation facile de la rétine et préserver la structure pour une utilisation future. De plus, l’augmentation du temps de circulation du colorant chez l’animal peut également entraîner une fuite de colorant des vaisseaux rétiniens vers les tissus environnants, ce qui doit être optimisé.
La taille du FITC-dextran est essentielle car un colorant de poids moléculaire plus élevé n’entrera pas dans les microvascularisations. En revanche, un colorant de poids moléculaire inférieur s’échappera des nouveaux vaisseaux de la rétine saine28. Par conséquent, FITC-dextran avec un poids moléculaire de 70 kD est préféré pour effectuer une angiographie de fluorescence, pour visualiser les fuites et le vascularisation dans la rétine. Cependant, une limitation importante de cette technique est la durée de développement de la néovascularisation chez les rats diabétiques et la procédure invasive de l’étude, qui pourrait être remplacée à l’avenir par des techniques non invasives telles que l’électrorétinogramme, le fond d’œil et d’autres instruments optiques non invasifs.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Conseil indien de la recherche médicale (ICMR; ITR-2020-2882) pour le soutien financier au Dr Nirmal J. Nous tenons également à remercier la subvention de la Commission de l’Université pour avoir fourni une bourse de recherche junior à Manisha Malani et le Laboratoire central d’analyse, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad pour avoir fourni des infrastructures.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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