Summary
Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.
Abstract
Diyabetik retinopati gibi bir arka segment göz hastalığı retinanın fizyolojisini değiştirir. Diyabetik retinopati retina dekolmanı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması ve retinal anjiyogenez ile karakterizedir. Bir in vivo sıçan modeli, retinanın yapısındaki ve işlevindeki değişiklikleri incelemek için değerli bir deneysel araçtır. Sıçan modelinde retina hücrelerinin, retina vaskülatürünün ve hasar görmüş BRB'nin morfolojik değişikliklerini tanımlamak için üç farklı deneysel teknik öneriyoruz. Retinal histoloji, çeşitli retina hücrelerinin morfolojisini incelemek için kullanılır. Ayrıca retina hücre sayımı ve farklı retina tabakalarının kalınlık ölçümü ile kantitatif ölçüm yapılır. BRB'nin parçalanması nedeniyle ekstraoküler proteinlerin plazmadan vitreus dokusuna sızmasını belirlemek için BRB parçalanma testi kullanılır. Floresan anjiyografi, FITC-dextran boyası kullanarak retinal vaskülatürü görselleştirerek anjiyogenezi ve kan damarlarının sızıntısını incelemek için kullanılır.
Introduction
Diyabetik retinopati (DR), diabetes mellitusun en karmaşık sekonder komplikasyonlarından biridir. Aynı zamanda dünya çapında çalışma çağındaki nüfusta önlenebilir körlüğün önde gelen nedenidir. 32.4 milyon kör insanın yakın tarihli bir meta-analizinde, 830.000 (% 2.6) kişi DR1 nedeniyle kördü. Diyabete atfedilen görme kaybı oranı, 2015 yılında dünya çapında %1,06 (0,15-2,38) ile yedinci sırada yer almıştır2,3.
Diyabetik retinopati tanısı arka oküler dokulardaki vasküler anormallikler ile konur. Klinik olarak, retinadaki vaskülarizasyona bağlı olarak Proliferatif Olmayan DR (NPDR) ve Proliferatif DR (PDR) olmak üzere iki aşamaya ayrılır. Hiperglisemi, retinada nörodejenerasyon4,5, inflamasyon6,7 ve mikrovaskülatür8 ile ilgili çeşitli yolları içerdiği için DR'nin güçlü düzenleyicisi olarak kabul edilir. Hiperglisemiye bağlı olarak indüklenen çoklu metabolik komplikasyonlar arasında ileri glikasyon son ürünlerinin (AGE'ler), polyol yolunun, hekzozamin yolunun ve protein kinaz-C yolunun birikmesi sayılabilir. Bu yollar, diyabetik retinopatinin farklı evrelerine bağlı olarak hücre proliferasyonu (endotel hücreleri), migrasyon (perisitler) ve apoptozdan (nöral retina hücreleri, perisitler ve endotel hücreleri) sorumludur. Bu metabolik değişiklikler retina dekolmanı, retina hücrelerinin kaybı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması, anevrizmalar ve anjiyogenez gibi fizyolojik değişikliklere yol açabilir9.
Streptozotosin (STZ) ile indüklenen tip-1 diyabet, diyabet patogenezini ve komplikasyonlarını değerlendirmek için sıçanlarda iyi bilinen ve iyi kabul görmüş bir uygulamadır. STZ'nin diyabetojenik etkileri, pankreas adacığının seçici yıkımına bağlıdır β hücreler10. Sonuç olarak, hayvanlar insülin eksikliği, hiperglisemi, polidipsi ve poliüriye maruz kalacaktır ve bunların hepsi insan tipi-1 diabetes mellitusun karakteristiğidir11. Şiddetli diyabet indüksiyonu için STZ, yetişkinlik döneminde intravenöz veya intraperitoneal olarak 40-65 mg / kg vücut ağırlığında uygulanır. Yaklaşık 72 saat sonra, bu hayvanlar 250 mg / dL10,12'den daha yüksek kan şekeri seviyeleri sunar.
Retinanın nörodejenerasyon, inflamasyon ve anjiyogeneze bağlı fizyolojik değişikliklerini anlamak için, deneysel hayvan modellerinde farklı teknikler optimize edilmelidir. Retina hücreleri ve retina damarlarındaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikler histoloji, BRB yıkım testi, floresan anjiyografi gibi çeşitli tekniklerle incelenebilir.
Histoloji, hücrelerin, dokuların ve organların anatomisinin mikroskobik düzeyde incelenmesini içerir. Hücrelerin/dokunun yapısı ve işlevi arasında bir korelasyon kurar. Doku yapısındaki mikroskobik değişiklikleri görselleştirmek ve tanımlamak, böylece sağlıklı ve hastalıklı meslektaşları karşılaştırmak için birkaç adım gerçekleştirilir13. Bu nedenle, histolojinin her adımını titizlikle standartlaştırmak esastır. Retinal histolojide yer alan çeşitli adımlar numunenin fiksasyonu, numunenin kesilmesi, dehidrasyon, temizleme, parafin ile emprenye etme, parafin gömme, kesitleme ve boyama (Hematoksilin ve Eozin boyama)13,14.
Sağlıklı bir retinada, moleküllerin retina boyunca taşınması, iç tarafta endotel hücreleri ve perisitlerden ve dış tarafta retinal pigment epitel hücrelerinden oluşan BRB tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, iç BRB endotel hücreleri ve perisitler hastalıklı durum sırasında dejenere olmaya başlar ve BRB de tehlikeye girer15. Bu BRB parçalanması nedeniyle, birçok düşük molekül ağırlıklı molekül vitreus ve retina dokusuna sızmaktadır16. Hastalık ilerledikçe, diğer birçok protein molekülü (düşük ve yüksek moleküler ağırlık) da homeostaz bozukluğu nedeniyle vitreus ve retina dokusuna sızmaktadır17. Çeşitli diğer komplikasyonlara ve sonuçta makula ödemi ve körlüğe yol açar. Bu nedenle, vitreustaki protein seviyelerinin ölçülmesi ve sağlıklı ve diyabetik durumların karşılaştırılması, BRB'nin tehlikeye atıldığını ölçer.
Floresan anjiyografi, floresan boya kullanarak retina ve koroidin kan dolaşımını incelemek için kullanılan bir tekniktir. İntravenöz yolla veya kardiyak enjeksiyon yoluyla floresein boyası enjekte edilerek retina ve koroid vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılır18. Boya enjekte edildikten sonra, önce retinal arterlere, ardından retinal damarlara ulaşır. Bu boya sirkülasyonu genellikle boya enjeksiyonundan itibaren 5 ila 10 dakika içinde tamamlanır19. Diyabetik retinopati ve koroidal neovaskülarizasyon dahil olmak üzere çeşitli posterior segment oküler hastalıkların tanısında önemli bir tekniktir20. Normal ve hastalıklı durumlarda majör ve minör vaskülatür değişikliklerini tespit etmeye yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsü tarafından sağlanan tüm hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir.
1. Retina histolojisi
- Gözün enükleasyonu ve fiksasyonu
- 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 haftalık) ile birlikte ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz.
- Gözün burun ve temporal bölgelerinde neşter bıçağı kullanarak kesi yaparak gözü enüklee edin. Daha sonra gözü orbital soketten çıkarmak için forseps ve mikro makas kullanarak kenarları boyunca kesin.
NOT: Sıçanları feda etmeden önce, fiksatif çözeltileri hazır bulundurun.
DİKKAT: Formaldehit cildi, gözü, burnu ve solunum yollarını tahriş eder. Güçlü bir cilt hassaslaştırıcı olduğu için kansere de neden olabilir. Eldiven giyin ve kaputun altında tutun21. - Kanı çıkarmak için gözü bir Petri kabında 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile iyice yıkayın. Fiksatif çözeltinin kolay nüfuz etmesi için gözü çevreleyen fazla yağı çıkarın.
- Gözü hemen forseps yardımıyla 5 mL fiksatif çözeltiye yerleştirin ve cam şişelerin duvarlarına yapışmadığından emin olun. Birkaç saniye hafifçe karıştırın ve kapağı uygun etiketleme ile değiştirin. Oda sıcaklığında karanlık koşullarda 24 ila 48 saat boyunca fiksatif çözeltide gözü inkübe edin.
- Doku kırpma
- Fiksasyondan sonra, gözü fiksatif çözeltiden çıkarın, 10 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de soğutulmuş 10 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
- Mikro forseps kullanarak, gözü optik sinir ile tutun ve mikro makas yardımıyla pars plana'da bir nick yapın. Bir gözün ön fincanını ayırmak için korneanın tüm kenar boşluğunu kesin. Forseps kullanarak, lensi nazikçe seçin, atın ve optik siniri kesin.
- Kavisli mikro makas kullanarak, optik diskten geçerek arka vizör adaptörünün uzunlamasına bir bölümünü iki yarıya bölün. Kasetin tabanına yerleştirin ve dokuya herhangi bir rahatsızlık vermeden kapağı düzgün bir şekilde kapatın. Kasetleri doku numunesi adı ve tarihi ile etiketleyin.
- Dokunun dehidrasyonu, temizlenmesi ve parafin emprenye edilmesi
- Kesilen dokuyu% 50,% 70,% 90 ve% 100 etanolün 80 mL'sinde kademeli olarak transfer ederek kurutun. Kasetleri bir konsantrasyondan diğerine aktarırken, kontaminasyonu en aza indirmek için temiz kağıt mendil üzerine bastığınızdan emin olun.
NOT: Dokunun her transferde 30 dakika (iki kez) bekletin. Bu adım için harcanan toplam süre yaklaşık 4 saattir. - Dehidrasyon üzerine, etanolün ksilen ile değiştirilmesi için kasetleri 30 dakika (iki kez) boyunca 80 mL ksilene aktarın.
NOT: Ksilen ile inkübasyondan sonra, doku yarı saydam hale gelir.
DİKKAT: Ksilen, benzen halkalı aromatik bir bileşiktir. Göz ve mukoza zarını tahriş eder ve ayrıca depresyonlara neden olabilir. - Son olarak, dokudaki ksilenin yerini almak için dokuyu 60 ° C'de önceden ısıtılmış parafin ile emprenye edin. Ksilen içeriğini en aza indirmek için kasetleri kağıt mendil üzerine birkaç kez darpın ve 2 saat (1 h x 2) boyunca 200 mL parafin (60 ° C'de sıvı) içine yerleştirin.
DİKKAT: Erimiş parafini solumaktan kaçının, çünkü solunum rahatsızlığına neden olabilecek küçük lipit damlacıkları üretir.
- Kesilen dokuyu% 50,% 70,% 90 ve% 100 etanolün 80 mL'sinde kademeli olarak transfer ederek kurutun. Kasetleri bir konsantrasyondan diğerine aktarırken, kontaminasyonu en aza indirmek için temiz kağıt mendil üzerine bastığınızdan emin olun.
- Parafin gömme
- Parafin gömme makinesini, parafini eritmek ve istasyonların istenen sıcaklıklara ulaşması için kullanmadan en az 1 saat önce açın. Çelik bir kalıbı sıcak bir yüzeye yerleştirerek erimiş parafin mumu ile doldurun, ardından parafin kabından bir seferde bir kaseti çıkarın.
- Çelik kalıbı sıcak bir yüzeyden soğuk bir yüzeye (4 ° C) taşıyın. Bu noktada, kalıptaki balmumu katılaşmaya başlayacaktır. Tamamen katılaşmadan önce, forseps yardımıyla dokuyu balmumuna yerleştirin ve dokuyu, arka kabın optik disk kısmı kalıbın tabanına bakacak şekilde yönlendirin.
NOT: Dokunun hareket etmediğinden ve istenen oryantasyonunu koruduğundan emin olun. Değilse, tüm parafin sıvılaşana kadar kalıbı tekrar ılık çalışma yüzeyine koyun, ardından adım 1.4.2 ile tekrar başlayın. - Kalıptaki balmumu katılaşmaya başladığında, kaset tabanını hemen kalıbın üzerine yerleştirin. Kalıbı kasetin üst kenarının üstündeki parafin ile dikkatlice doldurun ve hızlı katılaşma için yavaşça soğuk bir yüzeye (-20 ° C'ye yakın) aktarın. Katılaşana kadar, işlemi adım 1.4.2'deki diğer kasetlerle tekrarlayın.
- Tüm kalıplar katılaştıktan sonra, çelik kalıbı kasetten ayırın. Zorsa, biraz daha bekleyin ve tekrar deneyin (zorla çıkarmayın). Tam katılaşma ile separasyon daha kolay hale gelir. Şimdi kaset, mikrotom tarafından bölümleme sırasında tutulacak parafin bloğunun tabanı haline gelir.
NOT: Bu blok daha fazla kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. Bu noktada, işlem durdurulabilir ve daha sonra (gerekirse) devam ettirilebilir.
- Bölümleme
- Bıçak tutucuya tek kullanımlık bir mikrotom bıçağı takın. Kasetlerin etrafındaki fazla parafin mumunu çıkarın, böylece blokların hem üst hem de alt kısımları bıçağa paralel kalır. Bloğu kaset tutucuya takın.
- Bloğun yüzeyi bıçağın kenarıyla temas edene kadar ilerletmek için el çarkının kilidini açın. Doku bloğun yüzeyinde görselleştirilinceye kadar blok üzerindeki fazla parafin mumunu kesin. Bölüm kalınlığını 5 μm'ye ayarlayın ve beş ila altı bölümden oluşan bir şerit kesin.
- Forseps kullanarak, şeridi açmak için şeridi önceden ısıtılmış su banyosunun yüzeyine (yaklaşık 50 ° C) yavaşça aktarın. Mayer'in albüminiyle kaplı cam bir slayttaki bölümleri, slaytı bölümün altında tutarak toplayın. Bölümleri yavaşça kaldırın ve kızakların 37 ° C'de gece boyunca yatay olarak kurumasını bekleyin.
NOT: Slaytlar oda sıcaklığında kuru kutularda birkaç ay saklanabilir. Bu adımda, işlem durdurulabilir ve daha sonra devam ettirilebilir.
- Boy -ama
- Parafinin erimesi için kullanmadan önce 60 °C'de sıcak hava fırınında lekelenecek kızakları 1 saat ısıtın ve Tablo 1'de belirtilen adımları izleyin.
DİKKAT: Hematoksilin ve Eozin lekeleri solunduğunda veya yutulduğunda toksiktir. Kanserojen oldukları bildirilmiştir.
- Parafinin erimesi için kullanmadan önce 60 °C'de sıcak hava fırınında lekelenecek kızakları 1 saat ısıtın ve Tablo 1'de belirtilen adımları izleyin.
| Reaktif | Ayakta Durma Süresi | Tekrarlama (Kaç kez) |
| Ksilen | 5 dk | 2 |
| %100 Etanol | 5 dk | 2 |
| %90 Etanol | 5 dk | 2 |
| %70 Etanol | 5 dk | 2 |
| %50 Etanol | 5 dk | 2 |
| Su | 5 dk | 2 |
| Hematoksilen | 4 dk | 1 |
| Su ile yıkama | ||
| %1 %70 Etanol içinde asit alkol | 30 Saniye | 1 |
| Su ile yıkama | ||
| Scott'ın suyu | 1 dk | 1 |
| Su ile yıkama | ||
| %50 Etanol | 1 dk | 1 |
| %95 Etanol | 1 dk | 1 |
| % 0.25 Eozin | 5 sn. | 1 |
| Su ile yıkama | ||
| Su | 2 dk | 1 |
| %95 Etanol | 1 dk | 1 |
| %100 Etanol | 1 dk | 1 |
| Ksilen | 5 dk | 2 |
| Montaj ve kapak kaydırma | ||
Tablo 1. Hematoksilin ve Eozin boyama prosedürü
2. Kan-beyin bariyeri parçalanma testi
- Kan ve vitreus toplanması
- 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (8 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın. Anestezik durumu pedal çekme refleksi (ayak parmağı sıkışması) ile onaylayın. Plazmayı tam kandan ayırmak için hemen etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı bir tüpe kardiyak ponksiyon yoluyla 1 mL kan toplayın.
- İntraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak sıçanı ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz. Gözü enüklee edin ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin.
- Gözü kuru buzun üzerinde temiz bir Petri kabına yerleştirin (önerilir) ve adım 1.2.2'de belirtildiği gibi gözü diseke etmeye başlayın.
- Lensi çıkarın, vitriosu mikro forseps kullanarak arka bardaktan dikkatlice çekin ve üç ila dört cam boncuk (2-4 mm) içeren bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
NOT: Dondurucu koşullar altında lensin ve vitreusun çıkarılması daha kolay olduğu için kuru buz üzerinde diseksiyon yapılması önerilir.
- Numunelerin hazırlanması
- Vitröz mizahı bir boncuk homojenizatöründe 10 sn boyunca orta hızda homojenize edin.
- Kan (1 mL) ve vitreus numunelerini (10-20 μL) mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve her iki numuneyi de 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5200 x g'de santrifüj edin.
NOT: Başarılı homojenizasyon durumunda, vitreus santrifüjlemeden sonra homojen bir kıvama sahiptir. Bununla birlikte, vitreusun homojen olmayan kıvamında olması durumunda, artan homojenizasyon süresi ile adım 2.2.1'den itibaren tekrarlayın. - Her iki numuneden de süpernatant toplayın ve PBS ile vitreus mizah ve plazma örneklerini sırasıyla 1:10 ve 1:20 oranında seyreltin.
- Protein miktarı ve vitreus-plazma protein oranı
- Vitröz mizah ve plazma numunelerinde protein konsantrasyonunu ölçmek için, 250 μL Bradford reaktifine 5 μL seyreltilmiş numune ekleyin, iyice karıştırın ve 40 dakika içinde 590 nm'de absorbansı okuyun.
NOT: Numunelerin absorpsiyon değeri 1.0'ın üzerindeyse, numuneleri daha fazla seyreltin ve adım 2.2.3'teki prosedürü tekrarlayın. - Vitröz protein seviyesini aynı sıçandan plazma protein seviyesine normalleştirin ve sağlıklı ve diyabetik sıçanlar arasındaki kıvrım farkını ölçün.
- Vitröz mizah ve plazma numunelerinde protein konsantrasyonunu ölçmek için, 250 μL Bradford reaktifine 5 μL seyreltilmiş numune ekleyin, iyice karıştırın ve 40 dakika içinde 590 nm'de absorbansı okuyun.
3. Floresan anjiyografi
- FITC-dextran70000 boya enjeksiyonu
- 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını% 3 izofluran kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın ve pedal çekilme refleksini (ayak parmağı sıkışması) onaylayın. Kuyruğu ılık su (37-40 ° C) içeren bir beherin içine batırın. Boyayı enjekte etmeden önce kuyruğu% 70 etanol ile temizleyin. Kuyruğun yanal damarını bulun ve kuyruğun alt kısmındaki enjeksiyon pozisyonunu işaretleyin.
NOT: İğnenin yerleştirilmesi başarısız olursa, geçerli konumun üzerinde başka bir yere yerleştirmeyi deneyin (ucu kuyruğun tabanına kadar). Bununla birlikte, tekrarlanan iğneleme, sıçanda stres gelişimine yol açabileceğinden, vazokonstriksiyona neden olabileceğinden, bir kez enjekte edilmesi tavsiye edilir. - Kuyruk damarından 1 mL 50 mg/mL FITC-dextran70000 boya çözeltisi enjekte edin ve boyanın 5 dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Sıçanı, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150mg / kg) ile ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz. Adım 1.1.1'de belirtildiği gibi gözü enüklee edin.
NOT: Gerekirse, göz en fazla 30 dakika boyunca %4 formaldehit çözeltisine sabitlenebilir.
- 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını% 3 izofluran kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın ve pedal çekilme refleksini (ayak parmağı sıkışması) onaylayın. Kuyruğu ılık su (37-40 ° C) içeren bir beherin içine batırın. Boyayı enjekte etmeden önce kuyruğu% 70 etanol ile temizleyin. Kuyruğun yanal damarını bulun ve kuyruğun alt kısmındaki enjeksiyon pozisyonunu işaretleyin.
- Düz montaj hazırlığı
- Düz montajlar hazırlamak için, diseksiyon aletlerini slaytlar ve kapak kaymaları ile birlikte hazır bulundurun. Gözü soğutulmuş PBS ile dolu bir Petri kabına yerleştirin ve adım 1.2.2'de belirtildiği gibi gözü diseke etmeye başlayın.
- Şimdi sivri uçlu bir forsepilin ucunu sklera ve retina arasına yerleştirin. Retinanın herhangi bir noktada skleraya bağlı olmadığından emin olarak bardağın kenarı boyunca yavaşça hareket ettirin. Herhangi bir tıkanıklık varsa, kavisli mikro makas kullanarak jant boyunca bu kısmı yavaşça kesin.
- Retinanın skleraya herhangi bir taraftan bağlanmadığı doğrulandıktan sonra, optik diskin yakınında kesin, retinanın skleradan tamamen ayrılacağı şekilde küçük bir delik açın. Retinayı yavaşça PBS çözeltisine itin ve spatula veya forseps yardımıyla temiz ve düz bir slayta yerleştirin.
- Mikro makas veya neşter bıçakları kullanarak, retina dokusunda küçük kesikler yapın ve dört kadrana bölün. Kesiklerin, Şekil 1'de gösterildiği gibi, optik diskin merkezde bıraktığı delikten en az 2 mm uzakta olduğundan emin olun.
- Düz montajı bozmadan 0,2 mL uçlar kullanarak fazla PBS'yi dokunun kenarlarından çıkarın.
- Düz bir montaj üzerine bir damla solmaya karşı montaj ortamı (50 μL ila 100 μL) yerleştirin, bir kapak kayması ile örtün ve hemen bir konfokal mikroskop altında görselleştirin.
NOT: Tüm prosedür boyunca minimum ışığı koruyun.
- Düz montajın görselleştirilmesi
- Düz montajı, bir konfokal mikroskobun 10x hedefi altında görselleştirin. Tüm düz montajı tek bir görüntü olarak yakalamak için karo taraması gerçekleştirin. Fayans sayısı, retinal düz montajın boyutuna bağlıdır. Ayrıca, damarları ve arterleri farklı odaklarda görselleştirmek için Z-istifleme yapın (Z-yığını için tercih edilen boyut, hangisine bağlı olarak, Z-yığını adımlarının sayısının değiştiğine bağlı olarak 5 μm'dir).
- PMT ve HyD dedektörünü sırasıyla 700-900 ve 100-150 olarak % kazançta kullanın. FITC-dextran boyası için 510-530 nm arasındaki emisyon aralığını seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retina histolojisi
Diyabetik retinada, retina hücreleri dejenerasyona uğrar. Ayrıca ödem nedeniyle retina tabakalarının kalınlığı da artar22. Hematoksilin ve Eozin boyama işleminden sonra elde edilen görüntüler, ImageJ kullanılarak Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücre sayımı ve farklı katmanların kalınlığının ölçülmesi için kullanılabilir.
Kan-retina bariyeri parçalanma testi
BRB diyabetik sıçanlarda tehlikeye girdiğinden, sızıntı belirgin hale gelir ve plazmadan retinaya ve vitreusa biyomoleküllerin birikmesine neden olur. Diyabetik sıçanlarda, plazmadan vitreusa protein sızıntısı, sağlıklı sıçanlara kıyasla yaklaşık üç kat daha yüksektir (Şekil 3). Protein, Lowry yöntemi, Bicinchoninic acid (BCA) yöntemi veya Bradford yöntemi (bu yazıda bahsedilen, bölüm 2.3) gibi herhangi bir kit yöntemi kullanılarak tahmin edilebilir. İşlemdeki bir gecikme retina ile güçlü vitreus yapışmasına yol açabileceğinden ve ayrılmayı zorlaştırabileceğinden, gözün taze bir şekilde diseke edilmesi önerilir. Vitreusun retinadan yanlış ayrılması yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.
Floresan anjiyografi
Bu teknik, mikro ve makro vaskülatür de dahil olmak üzere retinanın sızıntısını ve vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılır. FITC-dextran boyutunun seçimi, çeşitli çalışmalar için uygulanmasına dayanmaktadır. 4-6 kDa arasında değişen düşük molekül ağırlıklı FITC-dextran, vaskülatürdeki sızıntıyı görselleştirmek için kullanılır. Buna karşılık, anjiyogenezi görselleştirmek için 70 kDa ila 2 milyon Da arasında değişen yüksek moleküler ağırlıklı FITC-dextran molekülleri kullanılır. Başarılı bir boya enjeksiyonu, Şekil 4'te gösterildiği gibi retinal düz montajın tüm vaskülatürünün görselleştirilmesiyle sonuçlanır. Konfokal mikroskopi sonrası elde edilen görüntüler, sağlıklı ve hastalıklı grupları karşılaştırmak için ImageJ yazılımı kullanılarak tüm retinada kaplayan vaskülatür alanını belirlemek için kullanılabilir.
Şekil 1. Retinal düz montaj hazırlığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Sağlıklı ve diyabetik retinanın histoloji görüntüleri. (A) ve (B), 40x'in altındaki kontrol (A) ve diyabetik sıçanların (B) H & E boyalı retinal görüntülerini temsil eder. Retinanın ve her bir tabakanın toplam kalınlığı diyabetik koşullarda artar (C). Kısaltmalar: PRL = fotoreseptör tabakası, ONL = dış nükleer tabaka, OPL = dış pleksiform tabaka, INL = iç nükleer tabaka, IPL = iç pleksiform tabaka ve GCL = Ganglion hücre tabakası. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir. * kontrol grubundan anlamlı bir farkı temsil eder (P < 0.0001), # ise ANOVA testi ile elde edilen P < 0.05'teki kontrol grubundan anlamlı bir farkı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Sağlıklı ve diyabetik sıçanlarda kan-retinal bariyer parçalanması. Grafik, sağlıklı ve diyabetik sıçanların vitreus plazma protein oranını temsil etmektedir. Veriler ortalama SEM ± olarak gösterilmektedir. * eşlenmemiş t-testi ile elde edilen kontrol grubundan (P < 0.01) anlamlı bir farkı temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Retinal vaskülatür floresan anjiyografisi. (A) ve (B) karo taraması ile görselleştirilen düz bir retina montajını temsil eder ve görüntüleri 10x'in altına diker. (A) kontrol retinasını, (B) diyabetik retinayı temsil eder. Beyaz ok sızıntıyı gösterir. Tüm görüntüler Z-yığını (5 μm kalınlık) ile elde edildi. (A) ve (B) içindeki ölçek çubukları 0,5 mm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histoloji
Retina histolojisi, retina hücrelerinin ve tabakalarının morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için yapılır. Fiksatif çözelti seçimi, fiksasyon süresi, dehidrasyon ve parafin emprenye etme dahil olmak üzere çeşitli adımların optimize edilmesi gerekir. Fiksatif penetrasyon yavaşladığı için doku boyutu 3 mm'yi geçmemelidir. Yaygın olarak kullanılan %4'lük paraformaldehit, çözeltinin sulu mizah ve vitreus mizahına kıyasla nispeten yüksek ozmolaritesi nedeniyle sağlıklı gözde bile retina dekolmanı ile sonuçlanır ve bu da yanlış pozitif sonuçlara yol açar23. Çözeltinin yüksek ozmolaritesi hacim daralmasına neden olur ve dokuların büzülmesine neden olur. Bu protokolde kullanılan fiksatif çözelti,% 1.25 glutaraldehit ile% 1.25 formaldehittir, bu da nispeten daha az ozmolariteye sahiptir, doku bozulmasını azaltır, retina pigmenti epitel tabakasından retina dekolmanı en aza indirir ve ayrıca yapıyı doğal haliyle korur. Fiksatif çözeltinin bir başka seçeneği de asetik asit ve formaldehit içeren etanoldür. Fiksatif çözeltinin asidik durumu, dokunun hızlı bir şekilde sabitlenmesine yardımcı olabilirken, etanol fiksatif çözeltinin penetrasyonunu arttırır. Bununla birlikte, etanol ve asetik asit oranının optimize edilmesi esastır, çünkü aşırı konsantrasyon sırasıyla dokunun büzülmesine veya şişmesine neden olabilir24. Başarılı doku fiksasyonu için değerlendirme parametreleri retinanın ayrılmasını, sağlam retina tabakalarını ve doku büzülmesini içerir. Fiksasyon yapılırken bir diğer kritik faktör, uygun fiksasyon için gözün boyutunun en az 20 ila 25 katı olması gereken fiksatif çözeltinin hacmidir25. Ek olarak, bir çözeltiden diğerine aktarıldığında göz küresini veya dokuyu döndürmek önemlidir, böylece kabın dibine veya duvarlarına yapışmaz.
Parafin ile dehidrasyon ve emprenye dahil olmak üzere tamamlanmamış doku işleme, bloğun yüzeyinde depresyon meydana geldiğinde görselleştirilebilen dokuyu küçültebilir ve kurutabilir. Ek olarak, zayıf doku işleme de suya maruz kaldığında bölümlerin beyaza dönüşmesine neden olur25. Doku doğru işlenmezse, parafini çıkarmak için ksilen yoluyla geri alınabilir, ardından etanolün indirgeninde rehidrasyon (yani,% 100 etanol,% 90 etanol ve% 70 etanol). Yine, parafin bloklarını başarıyla hazırlamak için 1.3'ten 1.4'e kadar olan adımları tekrarlayın.
Parafin blokları hazırlanırken dokunun her taraftan parafin ile çevrelendiğinden ve hava kabarcığı görülmediğinden emin olmak önemlidir. Bloğun hazırlanmasındaki herhangi bir hata, dokunun başarısız bir şekilde kesilmesine yol açacaktır. Bazen işlem sırasında arka fincan katlanır; Bu noktada, forseps (ısıtılmış parafin içinde) kullanılarak hafifçe ayrılabilir, ancak dokuya zarar verdiği ölçüde değil. Parafin katılaşmaya başlarken çelik kalıptaki doku oryantasyonunun istenildiği gibi olmadığını varsayalım; Bu durumda, parafin blokları hazırlamak için dokuyu yeniden yönlendirmek için erimiş parafin ve dokuya geri konulabilir. Ayrıca, dokuyu gömme kalıbına aktarırken, dokunun etrafındaki parafinin katılaşmadığından emin olun. Doku ile bloktaki gömme ortamı (parafin) arasında bir saç çizgisi ayrımı oluşturur25. Bu durumda, parafini sıcak parafine yerleştirerek ve tekrar çelik kalıba yerleştirerek dokunun etrafında eritin.
Bölümleme sırasında, bıçak katlanmamış doku şeritleri verecek kadar keskin olmalıdır. Bıçağın belirli bir bölümünü 30 defadan fazla kullanmayın. Blok düzgün bir şekilde kesişmezse, bıçağın kör olduğunu varsayalım ve bu nedenle değiştirin veya yeniden keskinleştirin. Bölümler uygun değilse, uygun olmayan parafin emprenye edilmesi veya blokları emprenye etmek ve hazırlamak için eski parafinin kullanılması da olabilir. Bloktaki parafin eritilebilir ve bloğu hazırlamak için taze parafin kullanılabilir. Düzensiz bölümlerden kaçınmak için, mikrotomun tekerleğini hızlı, sarsıntılı hareketler yerine eşit dönüşlerle yavaşça döndürün.
Hematoksilin ve Eozin boyama yaparken, Hematoksilin ve Eozin boyamasının zamanını optimize etmek, dokuların az veya aşırı boyanmasına yol açabileceği için kritik öneme sahiptir. Parafinin yanlış erimesi veya dokunun rehidrasyonu düzensiz lekelenmeye yol açacaktır. Slayttaki beyaz bölümler olarak görselleştirilebilir. Dokuyu kurutun ve parafini tekrar sıcak hava fırınında eritin, ardından Tablo 1'de belirtilen adımları izleyin. Ayrıca, H&E boyama sırasında yapılan yaygın hatalardan biri, Eozin boyasından sonra dehidrant olarak alkol kullanılmasıdır. Aşırı alkol kullanımı, sitoplazmanın ve inklüzyon cisimlerinin az boyanmasına neden olabilir ve bu da kötü boyanmış bölümlere yol açabilir25. Montaj ortamının kullanımı, fazla ksilenin çıkarılmasından hemen sonra yapılmalı ve dokunun bozulmasına neden olabileceğinden ksilenin kurumasından kaçınılmalıdır. Ayrıca, sulu bazlı mountant (PBS'deki gliserol gibi), doku susuz bir durumda olduğu için kaçınılmalıdır. Sulu bazlı mountant dokuya nüfuz etmez ve puslu görüntülere neden olur.
Yukarıda belirtilen tüm adımları optimize ettikten sonra, araştırmacılar histolojiyi başarıyla gerçekleştirebileceklerdir. İstenilen fiksatif çözümü seçme ve diğer proses parametrelerini optimize etme girişimleri yaklaşık üç yıl sürer.
Kan-retina bariyeri parçalanması
Bu teknikteki en hassas adım, vitreusun gözden izole edilmesidir. En iyi taze bir göz üzerinde gerçekleştirilir. Vitreusun kolay izolasyonu için kuru buz kullanılması önerilir, özellikle de vitreus retinaya bağlı kalırsa. Genellikle, vitreus ile lens veya retina karışımı, retinaya bağlı vitreusun bulanıklığı ile tanımlanabilir. Bu sorunlar genellikle donma koşulları kullanılarak önlenebilir. Bununla birlikte, vitreus etiketleri lensin yanındaysa, mikro makas kullanılarak lens ve vitreusun kesiştiği noktada kesilerek ayrılabilirler. Retina vitreus ile birlikte dışarı çekilirse, retina mikro forseps kullanılarak parça parça çıkarılabilir. Vitreusun lensten ve retinadan kolay izolasyonu için filtre santrifüjleme kullanımı da önerilmektedir26. Vitröz jel benzeri bir yapı olduğundan, homojen bir protein karışımı için homojenizasyona ihtiyaç duyar. Genellikle, adım 2.2.1'de belirtildiği gibi, santrifüjleme üzerine vitreus mizahının sıvılaştırılmasıyla tanımlanabilen uygun homojenizasyon için tek bir homojenizasyon döngüsü yeterlidir. Santrifüjlemeden sonra vitreusun jel yapısı gözlenirse, homojenizasyonu tekrarlayın (adım 2.2.1). Protein niceliği herhangi bir kit yöntemi kullanılarak yapılabilir, ancak 2 μg / μL'ye kadar vitreustaki düşük protein seviyelerini tespit etmeye duyarlı olmalıdır.
Floresan anjiyografi
Bu teknik, retinanın vasküler ağını görselleştirmeyi amaçlamaktadır ve bu nedenle, boyanın retinal mikrodamarlarda eşit olarak ulaşması gerekir. Bunu sağlamak için enjeksiyon bölgesi ve dolaşım süresi gibi çeşitli adımlar optimize edilebilir. Kuyruk damarı enjeksiyonu veya kalp enjeksiyonu yoluyla bir boya enjekte edilebilir. Kardiyak enjeksiyon, iyi eğitilmemişse boyayı kalpten başka bir bölgeye enjekte etme riski; bu nedenle kuyruk damarı enjeksiyonu tercih edilir. Bununla birlikte, lateral venin tanımlanması ılık suya (37-40 ° C) batırıldığında ve% 70 etanol ile temizlendiğinde kolaydır. Etanol, damarın konumuna erişmede yardımcı olabilecek kan damarlarının genişlemesine yardımcı olur. Boyanın sadece damar içine enjekte edilmesi de önemlidir. Kuyruk damarına boya enjekte edilmemesi, boyanın enjekte edilmesi veya deri altı enjeksiyonu nedeniyle yakındaki bölgenin şişirilmesi sırasında dirençle hissedilebilir. İğne çıkarılabilir ve kuyruğun başka bir bölgesine tekrar yerleştirilebilir. Başarılı kuyruk damarı enjeksiyonu, sıçanın zorla idrara çıkmasıyla da görselleştirilebilir; boyanın rengi sıçan idrarında 30 ila 40 s arasında görülebilir.
Ayrıca, dolaşım süresi esastır; Genellikle, retina damarlarında boyayı başarılı bir şekilde dolaştırmak için 5 ila 10 dakika yeterlidir. Düz bir montaj taze bir gözle veya sabit bir gözle hazırlanabilir. Taze bir gözde düz bir montaj hazırlamak zor olabilir, ancak bir kez ustalaşıldığında, teknik en çok fiksasyon sırasında olduğu gibi tercih edilir, boya fiksatif çözeltide sızmaya başlar27. Bu nedenle, fiksasyon tüm göz için 30 dakikadan fazla uzatılmamalıdır. Taze retinayı ayırmakta zorluk çekmesi durumunda, arka kabı 15 ila 20 dakika boyunca ön kaptan ayırdıktan sonra fiksatif bir çözeltiye (% 4 formaldehit) bile sabitlenebilir. Boyanın sağlıklı retinada bile kan damarlarından çevre dokuya sızdığı sıklıkla görülür. Bunun nedeni aşırı fiksasyon olabilir; Bu nedenle, fiksasyon için gereken süre optimize edilmelidir. Sadece retinanın kolay izolasyonunu arttırır ve yapıyı gelecekte kullanmak üzere korur. Ayrıca, hayvandaki boyanın dolaşım süresinin artması, retina damarlarından çevre dokuya boya sızıntısına neden olabilir ve bu da optimize edilmesi gerekir.
FITC-dextran boyutu, daha yüksek moleküler ağırlıklı boya mikro vaskülatürlere girmeyeceği için esastır. Buna karşılık, daha düşük moleküler ağırlıklı boya, sağlıklı retinanın yeni damarlarından sızacaktır28. Bu nedenle, floresan anjiyografi yapmak, retinadaki sızıntı ve vaskülatürü görselleştirmek için 70 kD moleküler ağırlığa sahip FITC-dextran tercih edilir. Bununla birlikte, bu tekniğin önemli bir sınırlaması, diyabetik sıçanlarda neovaskülarizasyonun gelişim süresi ve gelecekte elektroretinogram, fundus ve diğer invaziv olmayan optik aletler gibi invaziv olmayan tekniklerle değiştirilebilecek olan çalışmanın invaziv prosedürüdür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne (ICMR; ITR-2020-2882) Dr. Nirmal J.'ye finansman desteği için Ayrıca, Manisha Malani'ye ve Merkezi Analitik Laboratuvar Tesisi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsüne altyapı tesisi sağladığı için Junior Research Fellowship sağladığı için Üniversite Komisyon Hibesine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
