Summary
Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.
Abstract
Een posterieure segment oogziekte zoals diabetische retinopathie verandert de fysiologie van het netvlies. Diabetische retinopathie wordt gekenmerkt door een netvliesloslating, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB) en retinale angiogenese. Een in vivo rattenmodel is een waardevol experimenteel hulpmiddel om de veranderingen in de structuur en functie van het netvlies te onderzoeken. We stellen drie verschillende experimentele technieken voor in het rattenmodel om morfologische veranderingen van retinale cellen, retinale vasculatuur en gecompromitteerde BRB te identificeren. Retinale histologie wordt gebruikt om de morfologie van verschillende retinale cellen te bestuderen. Ook wordt kwantitatieve meting uitgevoerd door retinale celgetal- en diktemeting van verschillende retinale lagen. Een BRB-afbraaktest wordt gebruikt om de lekkage van extraoculaire eiwitten uit het plasma naar glasachtig weefsel te bepalen als gevolg van de afbraak van BRB. Fluorescentieangiografie wordt gebruikt om angiogenese en lekkage van bloedvaten te bestuderen door retinale vasculatuur te visualiseren met behulp van FITC-dextran-kleurstof.
Introduction
Diabetische retinopathie (DR) is een van de meest complexe secundaire complicaties van diabetes mellitus. Het is ook de belangrijkste oorzaak van vermijdbare blindheid bij de beroepsbevolking wereldwijd. In een recente meta-analyse van 32,4 miljoen blinde mensen waren 830.000 (2,6%) mensen blind als gevolg van DR1. Het aandeel van verlies van gezichtsvermogen toegeschreven aan diabetes stond in 2015 op de zevende plaats met 1,06% (0,15-2,38) wereldwijd2,3.
Diabetische retinopathie wordt gediagnosticeerd door vasculaire afwijkingen in de achterste oculaire weefsels. Klinisch is het verdeeld in twee stadia - Non-Proliferatieve DR (NPDR) en Proliferatieve DR (PDR), gebaseerd op de vascularisatie in het netvlies. Hyperglycemie wordt beschouwd als de krachtige regulator van DR omdat het verschillende routes impliceert die betrokken zijn bij neurodegeneratie4,5, ontsteking6,7 en microvasculatuur8 in het netvlies. Meerdere metabole complicaties geïnduceerd als gevolg van hyperglycemie omvatten de accumulatie van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's), polyolroute, hexosamineroute en eiwitkinase-C-route. Deze routes zijn verantwoordelijk voor celproliferatie (endotheelcellen), migratie (pericyten) en apoptose (neurale retinale cellen, pericyten en endotheelcellen) op basis van verschillende stadia van diabetische retinopathie. Deze metabole veranderingen kunnen leiden tot fysiologische veranderingen zoals netvliesloslating, verlies van retinale cellen, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB), aneurysma's en angiogenese9.
Streptozotocine (STZ) geïnduceerde type-1 diabetes is een gevestigde en goed geaccepteerde praktijk bij ratten voor het evalueren van diabetes pathogenese en de complicaties ervan. Diabetogene effecten van STZ zijn te wijten aan selectieve vernietiging van pancreaseilandjes β-cellen10. Als gevolg hiervan zullen de dieren insulinedeficiëntie, hyperglycemie, polydipsie en polyurie ondergaan, die allemaal kenmerkend zijn voor diabetes mellitus11 bij de mens type 1. Voor ernstige diabetesinductie wordt STZ toegediend met 40-65 mg / kg lichaamsgewicht intraveneus of intraperitoneaal tijdens de volwassenheid. Na ongeveer 72 uur vertonen deze dieren bloedglucosewaarden van meer dan 250 mg / dL10,12.
Om de fysiologische veranderingen van het netvlies als gevolg van neurodegeneratie, ontsteking en angiogenese te begrijpen, moeten verschillende technieken worden geoptimaliseerd in experimentele diermodellen. Structurele en functionele veranderingen in retinale cellen en retinale vaten kunnen worden bestudeerd door verschillende technieken zoals histologie, BRB-afbraaktest en fluorescentieangiografie.
Histologie omvat de studie van de anatomie van cellen, weefsels en organen op microscopisch niveau. Het legt een correlatie tussen de structuur en functie van cellen/weefsel. Verschillende stappen worden uitgevoerd om de microscopische veranderingen in de weefselstructuur te visualiseren en te identificeren, waardoor gezonde en zieke tegenhangers worden vergeleken13. Daarom is het essentieel om elke stap van de histologie zorgvuldig te standaardiseren. Verschillende stappen die betrokken zijn bij retinale histologie zijn fixatie van het monster, trimmen van het monster, uitdroging, opruimen, impregneren met paraffine, paraffine inbedding, sectie en kleuring (Hematoxyline en Eosine kleuring)13,14.
In een gezond netvlies wordt het transport van moleculen over het netvlies gecontroleerd door BRB, bestaande uit endotheelcellen en pericyten aan de binnenkant en retinale pigmentepitheelcellen aan de buitenkant. Innerlijke BRB-endotheelcellen en pericyten beginnen echter te degenereren tijdens de zieke toestand en BRB is ook aangetast15. Door deze BRB-afbraak lekken veel moleculen met een laag molecuulgewicht in glasvocht en netvliesweefsel16. Naarmate de ziekte vordert, lekken veel andere eiwitmoleculen (laag en hoog molecuulgewicht) ook in glasvocht en netvliesweefsel als gevolg van homeostasestoornissen17. Het leidt tot verschillende andere complicaties en uiteindelijk macula-oedeem en blindheid. Vandaar dat het kwantificeren van de eiwitniveaus in het glasvocht en het vergelijken van gezonde en diabetische toestanden BRB in gevaar bracht.
Fluorescentieangiografie is een techniek die wordt gebruikt om de bloedcirculatie van het netvlies en het vaatvlies te bestuderen met behulp van fluorescerende kleurstof. Het wordt gebruikt om vasculatuur van het netvlies en vaatvlies te visualiseren door fluoresceïnekleurstof te injecteren via intraveneuze route of hartinjectie18. Zodra de kleurstof is geïnjecteerd, bereikt deze eerst de retinale slagaders, gevolgd door retinale aderen. Deze circulatie van kleurstof wordt meestal voltooid binnen 5 tot 10 minuten na de injectie van kleurstof19. Het is een belangrijke techniek om verschillende posterieure segment oculaire ziekten te diagnosticeren, waaronder diabetische retinopathie en choroïdale neovascularisatie20. Het helpt bij het detecteren van grote en kleine vasculatuurveranderingen in normale en zieke omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt alle richtlijnen voor dierverzorging die worden verstrekt door de Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinale histologie
- Enucleatie en fixatie van het oog
- Euthanaseer een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar mannelijke rat samen met de leeftijd-gematchte controle (14 tot 15 weken oud) met behulp van een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg) geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteerbare hartslag bevestigt het overlijden binnen 2-5 minuten.
- Enucleeer het oog door incisies te maken met behulp van een scalpelmes op de neus- en temporale gebieden van het oog. Knip vervolgens langs de randen met een tang en microschaar om het oog uit de orbitale kom te verwijderen.
OPMERKING: Voordat u ratten opoffert, moet u de fixatieve oplossingen klaar houden.
LET OP: Formaldehyde irriteert de huid, het oog, de neus en de luchtwegen. Het kan ook kanker veroorzaken omdat het een krachtige huidsensibilisator is. Draag handschoenen en hanteer deze onder de motorkap21. - Was het oog grondig met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaaltje om bloed te verwijderen. Verwijder het overtollige vet rond het oog voor eenvoudige penetratie van de fixerende oplossing.
- Plaats het oog onmiddellijk in 5 ml fixatieve oplossing met behulp van een tang en zorg ervoor dat het niet vastzit aan wanden van glazen injectieflacons. Roer voorzichtig een paar seconden en vervang de dop door de juiste etikettering. Incubeer het oog in een fixatieve oplossing gedurende 24 tot 48 uur in donkere omstandigheden bij kamertemperatuur.
- Trimmen van weefsel
- Verwijder na fixatie het oog uit de fixatieve oplossing, was met 10 ml PBS en plaats het in een petrischaal met 10 ml PBS gekoeld bij 4 °C.
- Houd met behulp van een microtang het oog met de oogzenuw en maak een inkeping bij pars plana met behulp van een microschaar. Snijd door de hele rand van het hoornvlies om de voorste beker van een oog te scheiden. Gebruik een tang, kies de lens voorzichtig, gooi deze weg en snijd de oogzenuw door.
- Maak met behulp van een gebogen microschaar een lengtegedeelte van de achterste oogschelp, door de optische schijf en verdeelt deze in twee helften. Plaats het in de basis van de cassette en sluit het deksel goed zonder enige verstoring van het weefsel. Label de cassettes met de naam en datum van het weefselmonster.
- Uitdroging, clearing en paraffine impregnatie van weefsel
- Droog het getrimde weefsel uit door geleidelijke overdracht in 80 ml van 50%, 70%, 90% en 100% ethanol. Zorg ervoor dat u de cassettes tijdens het overbrengen van de cassettes van de ene concentratie naar de andere op schoon tissuepapier dept om besmetting te minimaliseren.
OPMERKING: Laat het weefsel gedurende 30 minuten (tweemaal) in elke overdracht staan. De totale tijd die voor deze stap wordt verbruikt, is ongeveer 4 uur. - Breng na uitdroging de cassettes gedurende 30 minuten (tweemaal) over in 80 ml xyleen om de ethanol te vervangen door xyleen.
OPMERKING: Na incubatie met xyleen wordt het weefsel doorschijnend.
LET OP: Xyleen is een aromatische verbinding met een benzeenring. Het irriteert het oog en het slijmvlies en kan ook depressies veroorzaken. - Impregneer ten slotte het weefsel met voorverwarmde paraffine bij 60 °C om xyleen in het weefsel te vervangen. Dep de cassettes meerdere keren op tissuepapier om het xyleengehalte te minimaliseren en plaats gedurende 2 uur (1 uur x 2) 200 ml paraffine (vloeistof bij 60 °C) in 2 uur (1 uur x 2).
LET OP: Vermijd het inhaleren van gesmolten paraffine, omdat het kleine lipidedruppeltjes produceert die ademhalingsongemakken kunnen veroorzaken.
- Droog het getrimde weefsel uit door geleidelijke overdracht in 80 ml van 50%, 70%, 90% en 100% ethanol. Zorg ervoor dat u de cassettes tijdens het overbrengen van de cassettes van de ene concentratie naar de andere op schoon tissuepapier dept om besmetting te minimaliseren.
- Paraffine inbedding
- Schakel de paraffine-insluitmachine ten minste 1 uur voor gebruik in om de paraffine te smelten en ervoor te zorgen dat de stations de gewenste temperaturen bereiken. Vul een stalen mal met gesmolten paraffine door deze op een heet oppervlak te plaatsen en verwijder vervolgens één cassette tegelijk uit de paraffinecontainer.
- Verplaats de stalen mal van een warm naar een koud oppervlak (4 °C). Op dit punt zal de was in de mal beginnen te stollen. Voordat het volledig stolt, plaatst u het weefsel in was met behulp van een tang en oriënteert u het weefsel zodat het optische schijfgedeelte van de achterste beker naar de basis van de mal is gericht.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel niet beweegt en de gewenste oriëntatie behoudt. Zo niet, plaats de vorm dan terug op het warme werkoppervlak totdat de hele paraffine vloeibaar wordt en begin dan opnieuw met stap 1.4.2. - Als de was in de mal begint te stollen, plaatst u onmiddellijk de cassettebasis bovenop de mal. Vul de mal voorzichtig met paraffine boven de bovenrand van de cassette en breng deze langzaam over naar een koud oppervlak (in de buurt van -20 °C) voor snelle stolling. Totdat het stolt, herhaalt u het proces met andere cassettes uit stap 1.4.2.
- Zodra alle mallen zijn gestold, scheidt u de stalen mal van de cassette. Als het moeilijk is, wacht dan wat langer en probeer het opnieuw (verwijder het niet met geweld). Scheiding wordt gemakkelijker na volledige stolling. Nu wordt de cassette de basis van het paraffineblok dat tijdens het doorsnijden door microtoom moet worden vastgehouden.
OPMERKING: Dit blok kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor verder gebruik. Op dit punt kan het proces worden gestopt en later worden voortgezet (indien nodig).
- Doorsnede
- Installeer een microtoom wegwerpmesje in de meshouder. Verwijder overtollige paraffine rond cassettes, zodat zowel het bovenste als het onderste gedeelte van de blokken evenwijdig aan het mes blijven. Plaats het blok op de cassettehouder.
- Ontgrendel het handwiel om het vooruit te helpen totdat het oppervlak van het blok in contact is met de rand van het mes. Trim de overtollige paraffine op het blok totdat het weefsel op het oppervlak van het blok is gevisualiseerd. Stel de sectiedikte in op 5 μm en knip een lint van vijf tot zes secties door.
- Breng het lint met een tang voorzichtig over op het oppervlak van het voorverwarmde waterbad (ongeveer 50 °C) om het lint uit te vouwen. Verzamel secties op een glazen dia bedekt met Mayer's albumine door de dia onder de sectie te houden. Til de secties voorzichtig op en laat de glijbanen 's nachts horizontaal drogen bij 37 °C.
OPMERKING: Dia's kunnen bij kamertemperatuur enkele maanden in droge dozen worden bewaard. Bij deze stap kan het proces worden gestopt en later worden voortgezet.
- Kleuring
- Verwarm de te kleuren glaasjes vóór gebruik gedurende 1 uur in een heteluchtoven bij 60 °C om de paraffine te laten smelten en volg de in tabel 1 vermelde stappen.
LET OP: Hematoxyline en Eosine vlekken zijn giftig bij inademing of inname. Er is gemeld dat ze kankerverwekkend zijn.
- Verwarm de te kleuren glaasjes vóór gebruik gedurende 1 uur in een heteluchtoven bij 60 °C om de paraffine te laten smelten en volg de in tabel 1 vermelde stappen.
| Reagens | Staande tijd | Herhaling (Aantal keren) |
| Xyleen | 5 min. | 2 |
| 100% Ethanol | 5 min. | 2 |
| 90% Ethanol | 5 min. | 2 |
| 70% Ethanol | 5 min. | 2 |
| 50% Ethanol | 5 min. | 2 |
| Water | 5 min. | 2 |
| Hematoxyline | 4 min. | 1 |
| Water wassen | ||
| 1% Zure alcohol in 70% Ethanol | 30 s | 1 |
| Water wassen | ||
| Scott's water | 1 min. | 1 |
| Water wassen | ||
| 50% Ethanol | 1 min. | 1 |
| 95% Ethanol | 1 min. | 1 |
| 0,25% Eosine | 5 s | 1 |
| Water wassen | ||
| Water | 2 min. | 1 |
| 95% Ethanol | 1 min. | 1 |
| 100% Ethanol | 1 min. | 1 |
| Xyleen | 5 min. | 2 |
| Mountant en coverslip | ||
Tabel 1. Hematoxyline en Eosine kleuring procedure
2. Bloed-hersenbarrière afbraaktest
- Bloed- en glasvochtverzameling
- Anesthetiseer een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar mannelijke rat samen met de leeftijd-gematchte controle (14 tot 15 weken) met ketamine (80 mg / kg) en xylazine (8 mg / kg). Bevestig de verdovingstoestand door pedaaltrekreflex (teenknijpen). Verzamel onmiddellijk 1 ml bloed door hartpunctie in een ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gecoate buis om plasma van volbloed te scheiden.
- Euthanaseer de rat met behulp van een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg), geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteerbare hartslag bevestigt het overlijden binnen 2-5 minuten. Enucleeer het oog en plaats het onmiddellijk op droogijs.
- Plaats het oog in een schone petrischaal boven droogijs (aanbevolen) en begin met het ontleden van het oog zoals vermeld in stap 1.2.2.
- Verwijder de lens, trek het glasvocht voorzichtig uit de achterste beker met behulp van een microtang en plaats het in een homogenisatiebuis met drie tot vier glasparels (2-4 mm).
OPMERKING: Dissectie op droogijs wordt aanbevolen omdat het verwijderen van de lens en het glasvocht gemakkelijker is onder vriesomstandigheden.
- Bereiding van monsters
- Homogeniseer glasvochthumor in een kraalhomogenisator op gemiddelde snelheid gedurende 10 s.
- Breng het bloed (1 ml) en de glasvochtmonsters (10-20 μL) over in de microcentrifugebuizen en centrifugeer beide monsters bij 5200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: In het geval van succesvolle homogenisatie heeft glasvocht een uniforme consistentie na centrifugeren. In het geval van niet-uniforme consistentie van glasvocht, herhaal dit echter vanaf stap 2.2.1 met een verhoogde homogenisatietijd. - Verzamel supernatant uit beide monsters en verdun glasvochthumor en plasmamonsters in respectievelijk 1:10 en 1:20 met PBS.
- Eiwitkwantificering en glasvocht-plasma-eiwitverhouding
- Om de eiwitconcentratie in glasvochthumor- en plasmamonsters te kwantificeren, voegt u 5 μL verdunde monsters toe aan 250 μL Bradford-reagens, mengt u goed en leest u de absorptie bij 590 nm binnen 40 minuten.
OPMERKING: Als de absorptiewaarde van de monsters hoger is dan 1,0, verdunt u de monsters verder en herhaalt u de procedure van stap 2.2.3. - Normaliseer het glasvochteiwitniveau naar plasma-eiwitniveau van dezelfde rat en meet het vouwverschil tussen gezonde versus diabetische ratten.
- Om de eiwitconcentratie in glasvochthumor- en plasmamonsters te kwantificeren, voegt u 5 μL verdunde monsters toe aan 250 μL Bradford-reagens, mengt u goed en leest u de absorptie bij 590 nm binnen 40 minuten.
3. Fluorescentieangiografie
- FITC-dextran70000 kleurstof injectie
- Verdoof een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar-mannelijke rat samen met de leeftijdsgematchte controle (14 tot 15 weken) met behulp van 3% isofluraan en bevestig de pedaalontwenningsreflex (teen knijpen). Dompel de staart in een bekerglas met warm water (37-40 °C). Reinig de staart met 70% ethanol voordat u de kleurstof injecteert. Zoek de laterale ader van de staart en markeer de injectiepositie in het onderste deel van de staart.
OPMERKING: Als het inbrengen van de naald mislukt, probeer dan op een andere locatie boven de huidige positie in te brengen (tip naar de basis van de staart). Het wordt echter geadviseerd om eenmaal te injecteren, omdat herhaald prikken kan leiden tot stressontwikkeling bij de rat, wat vasoconstrictie kan veroorzaken. - Injecteer 1 ml 50 mg/ml FITC-dextran70000 kleurstofoplossing door de staartader en laat de kleurstof gedurende 5 minuten circuleren. Euthanaseer de rat met een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg), geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteerbare hartslag bevestigt het overlijden binnen 2-5 minuten. Enucleer het oog zoals vermeld in stap 1.1.1.
OPMERKING: Indien nodig kan het oog worden gefixeerd in 4% formaldehyde-oplossing, gedurende niet meer dan 30 minuten.
- Verdoof een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar-mannelijke rat samen met de leeftijdsgematchte controle (14 tot 15 weken) met behulp van 3% isofluraan en bevestig de pedaalontwenningsreflex (teen knijpen). Dompel de staart in een bekerglas met warm water (37-40 °C). Reinig de staart met 70% ethanol voordat u de kleurstof injecteert. Zoek de laterale ader van de staart en markeer de injectiepositie in het onderste deel van de staart.
- Flat mount voorbereiding
- Voor het voorbereiden van platte bevestigingen houdt u de ontleedgereedschappen bij de hand, samen met de dia's en coverslips. Plaats het oog in een petrischaaltje gevuld met gekoeld PBS en begin met het ontleden van het oog zoals vermeld in stap 1.2.2.
- Plaats nu de punt van een puntige tang tussen de sclera en het netvlies. Beweeg het voorzichtig langs de rand van de beker en zorg ervoor dat het netvlies op geen enkel moment aan de sclera is bevestigd. Als er een obstructie is, knip dat deel dan langzaam langs de rand met behulp van een gebogen microschaar.
- Zodra is bevestigd dat het netvlies van geen enkele kant aan de sclera is bevestigd, snijdt u in de buurt van de optische schijf en maakt u een klein gaatje zodat het netvlies volledig loskomt van de sclera. Duw het netvlies langzaam in de PBS-oplossing en plaats het op een schone platte dia met behulp van een spatel of tang.
- Maak met behulp van een microschaar of scalpelmesjes kleine sneden in het netvliesweefsel en verdeel het in vier kwadranten. Zorg ervoor dat de sneden zich op een afstand van ten minste 2 mm van het gat bevinden dat de optische schijf in het midden heeft achtergelaten, zoals weergegeven in figuur 1.
- Verwijder overtollige PBS van de zijkanten van het weefsel met behulp van 0,2 ml tips zonder de platte houder te verstoren.
- Plaats een druppel anti-fading montagemedium (50 μL tot 100 μL) op een vlakke houder, dek af met een coverslip en visualiseer onmiddellijk onder een confocale microscoop.
OPMERKING: Houd minimale lichtinval gedurende de hele procedure.
- Visualisatie van flat mount
- Visualiseer de platte houder onder 10x objectief van een confocale microscoop. Voer het scannen van tegels uit om de volledige vlakke montage als één afbeelding vast te leggen. Het aantal tegels is afhankelijk van de grootte van de retinale platte houder. Voer ook Z-stacking uit om de aderen en slagaders in verschillende foci te visualiseren (voorkeursgrootte voor Z-stack is 5 μm, afhankelijk van welke, het aantal Z-stack-stappen varieert).
- Gebruik PMT- en HyD-detector bij % winst als respectievelijk 700-900 en 100-150. Kies een emissiebereik tussen 510-530 nm voor FITC-dextran-kleurstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinale histologie
In het diabetische netvlies ondergaan retinale cellen degeneratie. Bovendien neemt de dikte van de retinale lagen toe als gevolg van oedeem22. De beelden verkregen na hematoxyline- en eosinekleuring kunnen worden gebruikt voor het aantal cellen en het meten van de dikte van verschillende lagen, zoals weergegeven in figuur 2 met behulp van ImageJ.
Bloed-retinale barrièreafbraaktest
Omdat de BRB wordt aangetast bij diabetische ratten, wordt lekkage prominent, wat leidt tot de accumulatie van biomoleculen van plasma naar het netvlies en glasvocht. Bij diabetische ratten is de eiwitlekkage van plasma naar glasvocht ongeveer drie keer hoger in vergelijking met gezonde ratten (figuur 3). Eiwit kan worden geschat met behulp van elke kitmethode, zoals de Lowry-methode, bicinchoninezuur (BCA) -methode of Bradford-methode (vermeld in dit artikel, sectie 2.3). Het wordt aanbevolen om het oog vers te ontleden, omdat een vertraging in de verwerking kan leiden tot een sterke glasvochthechting met het netvlies, waardoor het moeilijk te scheiden is. Onjuiste scheiding van glasvocht van het netvlies kan leiden tot vals-positieve resultaten.
Fluorescentieangiografie
Deze techniek wordt gebruikt om de lekkage en vasculatuur van het netvlies te visualiseren, inclusief micro- en macrovasculatuur. De selectie van de grootte van FITC-dextran is gebaseerd op de toepassing ervan voor verschillende studies. Fitc-dextran met een laag molecuulgewicht, variërend van 4-6 kDa, wordt gebruikt om lekkage in de vasculatuur te visualiseren. Daarentegen worden FITC-dextran-moleculen met een hoog molecuulgewicht, variërend van 70 kDa tot 2 miljoen Da, gebruikt om angiogenese te visualiseren. Succesvolle injectie van kleurstof resulteert in het visualiseren van de volledige vasculatuur van de retinale flat mount, zoals weergegeven in figuur 4. De verkregen beelden na confocale microscopie kunnen worden gebruikt om het gebied van vasculatuur in het hele netvlies te bepalen met behulp van ImageJ-software om gezonde en zieke groepen te vergelijken.
Figuur 1. Retinale flat-mount voorbereiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Histologische beelden van gezond versus diabetisch netvlies. (A) en (B) vertegenwoordigen de H & E-gekleurde retinale beelden van controle (A) en diabetische rat (B) onder de 40x. De totale dikte van het netvlies en elke laag neemt toe bij diabetische aandoeningen (C). Afkortingen: PRL = fotoreceptorlaag, ONL = buitenste kernlaag, OPL = buitenste plexivormlaag, INL = binnenste nucleaire laag, IPL = binnenste plexivormlaag en GCL = Ganglioncellaag. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. * vertegenwoordigt een significant verschil met de controlegroep (P < 0,0001), terwijl # een significant verschil vertegenwoordigt met de controlegroep bij P < 0,05, verkregen door de ANOVA-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Bloed-retinale barrière afbraak bij gezonde versus diabetische ratten. De grafiek geeft de glasvochtplasma-eiwitverhouding weer van gezonde versus diabetische ratten. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * vertegenwoordigt een significant verschil met de controlegroep (P < 0,01) verkregen door ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Fluorescentieangiografie van retinale vasculatuur. (A) en (B) vertegenwoordigen een platte vatting van het netvlies gevisualiseerd door tegelscan en het naaien van de afbeeldingen onder 10x. (A) vertegenwoordigt het netvlies van de controle, (B) vertegenwoordigt diabetisch netvlies. De witte pijl duidt op lekkage. Alle beelden werden verkregen door Z-stack (5 μm dikte). Schaalbalken in (A) en (B) zijn 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologie
Retinale histologie wordt uitgevoerd om de morfologische veranderingen van retinale cellen en lagen te visualiseren. Verschillende stappen, waaronder de keuze van de fixatieve oplossing, de fixatieduur, uitdroging en paraffine-impregnatie, moeten worden geoptimaliseerd. De weefselgrootte mag niet groter zijn dan 3 mm, omdat de fixatieve penetratie langzaam wordt. De veelgebruikte 4% paraformaldehyde leidt tot netvliesloslating, zelfs in het gezonde oog vanwege de relatief hoge osmolariteit van de oplossing in vergelijking met waterige humor en glasvochthumor, wat leidt tot vals-positieve resultaten23. De hoge osmolariteit van de oplossing resulteert in volumecontractie en leidt tot krimp van weefsels. De fixatieve oplossing die in dit protocol wordt gebruikt, is 1% formaldehyde met 1,25% glutaaraldehyde, dat relatief minder osmolariteit heeft, de weefselvervorming vermindert, de netvliesloslating van de retinale pigmentepitheellaag minimaliseert en ook de structuur in zijn oorspronkelijke toestand behoudt. Een andere keuze van fixatieve oplossing is azijnzuur en ethanol met formaldehyde. Zure toestand van fixatieve oplossing kan helpen bij snelle fixatie van weefsel, terwijl ethanol de penetratie van de fixatieve oplossing verbetert. Het optimaliseren van de verhouding tussen ethanol en azijnzuur is echter essentieel, omdat overmatige concentratie kan leiden tot krimp of zwelling van het weefsel, respectievelijk24. Evaluatieparameters voor succesvolle weefselfixatie omvatten loslating van het netvlies, intacte retinale lagen en weefselkrimp. Een andere kritische factor bij het uitvoeren van fixatie is het volume van de fixatieve oplossing, dat minstens 20 tot 25 keer de grootte van het oog moet zijn voor een goede fixatie25. Bovendien is het belangrijk om de oogbol of het weefsel te draaien wanneer het van de ene oplossing naar de andere wordt overgebracht, zodat het niet aan de bodem of wanden van de container blijft plakken.
Onvolledige weefselverwerking, inclusief uitdroging en impregnatie met paraffine, kan krimpen en droog weefsel, wat kan worden gevisualiseerd wanneer depressie optreedt op het oppervlak van het blok. Bovendien zal slechte weefselverwerking ook resulteren in de kleuring van secties in wit bij blootstelling aan water25. Als het weefsel niet correct wordt verwerkt, kan het worden teruggenomen door xyleen om paraffine te verwijderen, gevolgd door rehydratatie in downgradient van ethanol (d.w.z. 100% ethanol, 90% ethanol en 70% ethanol). Herhaal nogmaals de stappen van 1,3 tot 1,4 om paraffineblokken met succes voor te bereiden.
Tijdens het voorbereiden van paraffineblokken is het essentieel om ervoor te zorgen dat het weefsel van alle kanten wordt omringd door paraffine en er geen luchtbellen worden gezien. Elke fout bij het voorbereiden van het blok zal leiden tot een mislukte doorsnede van weefsel. Soms wordt de achterste beker tijdens de verwerking gevouwen; op dit punt kan het voorzichtig uit elkaar worden getrokken met behulp van een tang (in verwarmde paraffine), maar niet in de mate dat het het weefsel beschadigt. Stel dat de weefseloriëntatie in stalen mal niet naar wens is terwijl de paraffine begint te stollen; in dat geval kan het worden teruggezet naar gesmolten paraffine en weefsel om het weefsel te heroriënteren om paraffineblokken te bereiden. Zorg er ook tijdens het overbrengen van het weefsel naar de inbeddingsvorm voor dat de paraffine rond het weefsel niet stolt. Het creëert een haarlijnscheiding tussen het weefsel en het inbeddingsmedium (paraffine) in het blok25. Als het gebeurt, smelt dan de paraffine rond het weefsel door het in hete paraffine te plaatsen en opnieuw in de stalen mal te plaatsen.
Tijdens het doorsnijden moet het mes scherp genoeg zijn om uitgevouwen linten weefsel te geven. Gebruik een bepaald deel van het mes niet meer dan 30 keer. Als het blok niet goed doorsnijdt, ga er dan van uit dat het mes stomp is en vervang het daarom of slijp het opnieuw. Als de secties niet goed zijn, kan dit ook te wijten zijn aan onjuiste paraffine-impregnatie of het gebruik van oude paraffine om blokken te impregneren en te bereiden. De paraffine in het blok kan worden omgesmolten en verse paraffine kan worden gebruikt om het blok voor te bereiden. Om de ongelijke secties te vermijden, draait u het wiel van de microtoom langzaam met gelijkmatige bochten in plaats van snelle, schokkerige bewegingen.
Tijdens het uitvoeren van Hematoxyline en Eosine kleuring, het optimaliseren van de tijd van Hematoxyline en Eosine vlek is van cruciaal belang als het kan leiden tot onder- of over-kleuring weefsels. Onjuist smelten van paraffine of rehydratatie van het weefsel zal leiden tot ongelijke kleuring. Het kan worden gevisualiseerd als de witte secties op de dia. Droog het weefsel uit en smelt paraffine opnieuw in een heteluchtoven, gevolgd door de in tabel 1 vermelde stappen. Bovendien is een van de meest voorkomende fouten tijdens H & E-kleuring het gebruik van alcohol als dehydrant na Eosine-vlek. Overmatig gebruik van alcohol kan leiden tot onderkleuring van cytoplasma en inclusielichamen, wat kan leiden tot slecht gekleurde secties25. Het gebruik van mountant medium moet onmiddellijk na het verwijderen van overtollig xyleen worden gedaan en het drogen van xyleen voorkomen, omdat dit kan leiden tot vervorming van het weefsel. Ook moet op water gebaseerde mountant (zoals glycerol in PBS) worden vermeden omdat het weefsel zich in een uitgedroogde toestand bevindt. Op water gebaseerde mountant dringt niet door het weefsel en resulteert in wazige beelden.
Na het optimaliseren van alle bovengenoemde stappen, zullen onderzoekers in staat zijn om histologie met succes uit te voeren. Het duurt ongeveer drie pogingen om de gewenste fixatieve oplossing te kiezen en andere procesparameters te optimaliseren.
Afbraak van de bloed-retinale barrière
De meest delicate stap in deze techniek is de isolatie van het glasvocht van het oog. Het kan het beste worden uitgevoerd met een frisse blik. Het gebruik van droogijs wordt aanbevolen voor eenvoudige isolatie van glasvocht, vooral als het glasvocht aan het netvlies blijft vastzitten. Vaak kan lens- of netvliesmix met glasvocht worden geïdentificeerd door troebelheid van glasvocht als gevolg van netvlies. Deze problemen kunnen meestal worden vermeden met behulp van vriesomstandigheden. Als de glasachtige tags zich echter naast de lens bevinden, kunnen ze worden gescheiden door te snijden op het snijpunt van de lens en het glasvocht met behulp van een microschaar. Als het netvlies samen met het glasvocht naar buiten trekt, kan het netvlies stukje bij beetje worden verwijderd met behulp van een micro-tang. Het gebruik van filtercentrifugatie wordt ook voorgesteld voor eenvoudige isolatie van het glasvocht van de lens en het netvlies26. Omdat glasvocht een gelachtige structuur is, moet het worden gehomogeniseerd voor een homogeen mengsel van eiwitten. Gewoonlijk, zoals vermeld in stap 2.2.1, is een enkele homogenisatiecyclus voldoende voor een goede homogenisatie, die kan worden geïdentificeerd door vloeibaarmaking van glasvochthumor bij centrifugeren. Als de gelaardheid van het glasvocht wordt waargenomen na centrifugeren, herhaalt u de homogenisatie (stap 2.2.1). Eiwitkwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van elke kitmethode, maar moet gevoelig zijn voor het detecteren van de lage eiwitniveaus in glasvocht tot 2 μg / μL.
Fluorescentieangiografie
Deze techniek is bedoeld om het vasculaire netwerk van het netvlies te visualiseren en daarom moet de kleurstof gelijkmatig in de retinale microvessels reiken. Hiervoor kunnen verschillende stappen worden geoptimaliseerd, zoals de injectieplaats en de circulatietijd. Een kleurstof kan worden geïnjecteerd via staartaderinjectie of hartinjectie. Hartinjectie riskeert het injecteren van de kleurstof op een andere plaats dan het hart als deze niet goed is getraind; daarom heeft staartaderinjectie de voorkeur. Het identificeren van de laterale ader is echter eenvoudig wanneer het in warm water (37-40 °C) wordt gedompeld en met 70% ethanol wordt gereinigd. Ethanol helpt de bloedvaten te verwijden, wat kan helpen bij het verkrijgen van toegang tot de locatie van de ader. Het is ook essentieel dat de kleurstof alleen in de ader wordt geïnjecteerd. Het niet injecteren van kleurstof in de staartader kan worden gevoeld door weerstand tijdens het injecteren van de kleurstof of het uitpuilen van het nabijgelegen gebied als gevolg van subcutane injectie. De naald kan worden verwijderd en opnieuw worden ingebracht op een andere plaats van de staart. Succesvolle staartaderinjectie kan ook worden gevisualiseerd door geforceerd urineren van de rat; de kleur van kleurstof is zichtbaar in rattenurine binnen 30 tot 40 s.
Ook de circulatietijd is essentieel; meestal zijn 5 tot 10 minuten voldoende om kleurstof in retinale vaten met succes te laten circuleren. Een platte houder kan worden voorbereid in een fris oog of een vast oog. Het voorbereiden van een platte houder in een fris oog kan een uitdaging zijn, maar eenmaal onder de knie, heeft de techniek de meeste voorkeur, omdat tijdens de fixatie de kleurstof begint te lekken in fixatieve oplossing27. Daarom mag de fixatie niet langer dan 30 minuten voor het hele oog worden verlengd. In geval van problemen met het scheiden van vers netvlies, kan het zelfs worden gefixeerd in een fixatieve oplossing (4% formaldehyde) na het scheiden van de achterste beker van de voorste beker gedurende 15 tot 20 minuten. Vaak wordt gezien dat de kleurstof uit de bloedvaten naar het omliggende weefsel lekt, zelfs in gezond netvlies. Dit kan te wijten zijn aan overmatige fixatie; daarom moet de tijd die nodig is voor fixatie worden geoptimaliseerd. Het verbetert alleen de eenvoudige isolatie van het netvlies en behoudt de structuur voor toekomstig gebruik. Bovendien kan een verhoogde circulatietijd van kleurstof in het dier ook leiden tot kleurstoflekkage van retinale vaten naar het omliggende weefsel, dat moet worden geoptimaliseerd.
De grootte van FITC-dextran is essentieel omdat kleurstof met een hoger molecuulgewicht niet in microvasculaturen terechtkomt. Daarentegen zal kleurstof met een lager molecuulgewicht lekken uit nieuwe vaten van het gezonde netvlies28. Daarom heeft FITC-dextran met een molecuulgewicht van 70 kD de voorkeur om fluorescentieangiografie uit te voeren, om lekkage en vasculatuur in het netvlies te visualiseren. Een belangrijke beperking van deze techniek is echter de duur van de ontwikkeling van neovascularisatie bij diabetische ratten en de invasieve procedure van de studie, die in de toekomst kan worden vervangen door niet-invasieve technieken zoals elektroretinogram, fundus en andere niet-invasieve optische instrumenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Auteurs willen graag de Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) voor financieringssteun aan Dr. Nirmal J. We willen ook de University Grant of Commission bedanken voor het verstrekken van Junior Research Fellowship aan Manisha Malani en Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus voor het verstrekken van infrastructurele faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
