Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En epitelslibningsmodel til undersøgelse af hornhindesårheling

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Her beskrives en protokol til oprettelse af et centralt hornhindeepitelslibesår i musen ved hjælp af en trephin og en stump golfkøllesud. Denne hornhindesårhelingsmodel er meget reproducerbar og bruges nu til at evaluere kompromitteret hornhindesårheling i forbindelse med sygdomme.

Abstract

Hornhinden er kritisk for synet og tegner sig for omkring to tredjedele af øjets brydningskraft. Afgørende for hornhindens rolle i synet er dens gennemsigtighed. På grund af sin ydre position er hornhinden imidlertid meget modtagelig for en lang række skader, der kan føre til tab af hornhindegennemsigtighed og eventuel blindhed. Effektiv hornhindesårheling som reaktion på disse skader er afgørende for at opretholde hornhindehomeostase og bevarelse af hornhindegennemsigtighed og brydningskapacitet. I tilfælde af kompromitteret hornhindesårheling bliver hornhinden sårbar over for infektioner, sårdannelser og ardannelse. I betragtning af den grundlæggende betydning af hornhindesårheling for bevarelsen af hornhindegennemsigtighed og syn er en bedre forståelse af den normale hornhindesårhelingsproces en forudsætning for at forstå nedsat hornhindesårheling forbundet med infektion og sygdom. Mod dette mål har murine modeller af hornhinde sår vist sig nyttige til at fremme vores forståelse af hornhinden sårheling mekanismer, der opererer under normale fysiologiske forhold. Her beskrives en protokol til oprettelse af en central hornhindeepitelslibning i musen ved hjælp af en trefin og en stump golfkøllesud. I denne model bruges en cirkulær trefin med en diameter på 2 mm, centreret over hornhinden, til at afgrænse sårområdet. Golfkølletud bruges med omhu til at debridere epitelet og skabe et cirkulært sår uden at beskadige hornhindeepitelkældermembranen. Det resulterende inflammatoriske respons fortsætter som en velkaraktericeret kaskade af cellulære og molekylære hændelser, der er kritiske for effektiv sårheling. Denne enkle hornhindesårhelingsmodel er meget reproducerbar og velpubliceret og bruges nu til at evaluere kompromitteret hornhindesårheling i forbindelse med sygdom.

Introduction

Hornhinden er den gennemsigtige forreste en tredjedel af øjet. Hornhinden tjener flere funktioner, herunder beskyttelse af øjets indre strukturer og dannelse af en strukturel barriere, der beskytter øjet mod infektioner1. Endnu vigtigere er hornhinden kritisk for synet og giver omkring to tredjedele af øjets brydningskraft 2,3. Afgørende for hornhindens rolle i synet er dens gennemsigtighed. På grund af sin ydre position udsættes hornhinden imidlertid for en lang række skader på daglig basis, der kan føre til forstyrrelse af dens barrierefunktion, tab af gennemsigtighed og eventuel blindhed. Tab af hornhindegennemsigtighed er en førende årsag til synshandicap på verdensplan 4,5. Hornhindeafskrabninger er en almindelig årsag til besøg på skadestuen (ER), der tegner sig for halvdelen af de øjenrelaterede tilfælde, der præsenteres på ER6. Over 1 million individer anslås at lide af øjenrelaterede skader årligt i USA7. Effektiv hornhindesårheling som reaktion på disse skader er afgørende for at opretholde hornhindehomeostase og bevare dens gennemsigtighed og brydningsevne. I tilfælde af kompromitteret hornhindesårheling bliver hornhinden sårbar over for infektioner, sårdannelser og ardannelse 8,9. Også den stigende popularitet af brydningsoperationer placerer en unik traumatisk udfordring på hornhinden10. I betragtning af den grundlæggende betydning af hornhindesårheling for bevarelsen af hornhindegennemsigtighed og syn er en bedre forståelse af den normale hornhindesårhelingsproces en forudsætning for at forstå nedsat hornhindesårheling forbundet med infektion og sygdom.

Til det formål er der udviklet flere dyremodeller af hornhindesårheling 11,12,13,14,15. Murine modeller af hornhinde sårheling har vist sig nyttige til at fremme vores forståelse af hornhinde sårheling mekanismer, der opererer under normale fysiologiske forhold. Forskellige typer hornhindesår er blevet anvendt til at studere hornhindesårheling, hver egnet til at undersøge forskellige aspekter af sårhelingsprocessen. De mest almindelige typer sårmodeller, der anvendes i hornhindesårhelingsundersøgelser, er de mekaniske og kemiske sårmodeller. Kemiske hornhindesår, der for det meste involverer skabelsen af alkaliske forbrændinger på hornhinden, er nyttige til at studere hornhindesår, opacificering og neovaskularisering13. Mekaniske hornhindesår involverer debridering (slid) sår og keratektomi sår 14,15,16. En intakt eller brudt hornhindeepitelkældermembran definerer henholdsvis debridering og keratektomi sår. I debrideringssår forbliver epitelkældermembranen intakt, mens i keratektomisår brydes kældermembranen med penetration hovedsagelig ind i den forreste stroma. Debrideringssår er mest nyttige til at studere re-epithelialisering, epitelcelleproliferation, immunrespons og nerveregenerering efter hornhindesår. Keratektomi sår, på den anden side, er mest nyttige til at studere hornhinde ardannelse14,15.

Her beskrives en protokol til oprettelse af et centralt hornhindeepitelslibesår i musen ved hjælp af en trephin og en stump golfkøllesud. Denne enkle hornhindesårhelingsmodel er meget reproducerbar og velpubliceret og bruges nu til at evaluere kompromitteret hornhindesårheling i forbindelse med sygdom17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees ved University of Houston og Baylor College of Medicine. Retningslinjerne skitseret i Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erklæring om brugen af dyr i syn og oftalmisk forskning blev fulgt ved håndtering og brug af musene.

1. Forberedelse

  1. Fremstilling af fluoresceinopløsning
    1. Forbered 1% fluoresceinopløsning ved at opløse 10 mg natriumfluorescensalt i 1 ml sterilt saltvand eller sterilt 1x phosphatbufret saltvand (PBS).
      BEMÆRK: Forbered natriumfluoresceinopløsning på brugsdagen eller en dag før for at undgå mikrobiel kontaminering. Når fluoresceinopløsningen fremstilles en dag før brug, ved 4 °C væk fra lys. Pak rør med aluminiumsfolie for at forhindre fotoblegning.
    2. Opdel opløsningen i alikvoter, der er egnede til brug i et enkelt eksperiment. 1-1,5 μL fluoresceinopløsning anvendes pr. Mus pr. Tidspunkt. Brug følgende formel til at beregne det volumen af alikvote, der er passende for et enkelt eksperiment:
      Equation 1
      BEMÆRK: For eksempel, hvis seks mus studeres i et enkelt forsøg med sårstørrelse overvåget på fem tidspunkter, ville mængden af alikvot, der er egnet til det enkelte eksperiment, være:
      Equation 2
  2. Fremstilling af ketamin/xylazincocktail til anæstesi af mus.
    1. For at forberede 10 ml cocktail blandes 2,0 ml ketamin (100 mg/ml) med 1,0 ml xylazin (20 mg/ml) og tilsættes 7,0 ml steril PBS. Forbered ketamin / xylazin cocktail en dag før eller på dagen for operationen.
      BEMÆRK: Alle opløsninger skal anvendes ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

2. Anæstesi

  1. Vej musen (8-12 uger gamle C57BL/6 vildtypemus) for at bestemme den passende mængde bedøvelsesmiddel, der skal administreres. Brug den tohånds musefastholdelsesteknik til at fastholde og håndtere mus til injektion af bedøvelsesvæsken18. Administrere ketamin/xylazincocktail intraperitonealt (i.p.) i en endelig koncentration på 80 mg/kg ketamin og 8 mg/kg xylazin.
  2. Vent, indtil fuldstændig anæstesi er opnået, før du udfører hornhindesår på musen. Evaluer dybden af anæstesi ved at vurdere pedalrefleksen efter tåklemme. Når tilstrækkelig anæstesi er opnået, bør musen ikke bevæge sig på tåspids.
    BEMÆRK: Fordi mus hurtigt mister kropsvarme under anæstesi, er det vigtigt at give en kilde til varme for mus for at forhindre hypotermi. Placer mus på en varmekilde (varmepude) under anæstesi og genopretningsfaser.

3. Oprettelse af hornhindesår

  1. Sår kun højre eller venstre øje. Oprethold konsistens med øjet (dvs. venstre eller højre), der er såret, når du bevæger dig fra mus til mus.
    BEMÆRK: Fordi slid beskadiger hornhindenerverne og reducerer skarpheden, kan såring af begge øjne forårsage betydeligt ubehag og svækkelse. Da analgetika har potentialet til at undertrykke inflammatoriske reaktioner, kan deres anvendelse være en confounder i visse eksperimenter med det formål at forstå hornhindebetændelse. Undgåelse af analgetika i hornhindesårforsøg blev godkendt af vores Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
  2. At skabe epitelhornhinde såret
    1. Under et dissekeringsmikroskop skal du bruge trefinen med en diameter på 2 mm (se figur 1) til at afgrænse midten af hornhinden og holde øjet vidt åbent ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren til at holde øjenlågene. Drej forsigtigt trephinen for at få et indtryk på hornhindeepitelet.
      BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for ikke at anvende for stort tryk, når du bruger trefinen, da dette kan resultere i hornhindeperforering. Der skal også udvises omhu for at placere trephin centralt. Eleverne kan bruges som et vartegn til at lokalisere midten af hornhinden.
    2. Under et dissekerende mikroskop skal du holde den stumpe golfkøllespude (se figur 1) ca. 45° fra hornhindens overflade inden for det område, der er afgrænset med trefinen. Skrab forsigtigt og kontinuerligt epitelet inden for det afgrænsede område med spud for at debridere epitelet.
      BEMÆRK: Anvend ikke overdreven kraft ved debridering, da det også kan forårsage hornhindeperforering. Musens øjne kan tørre op under sårprocessen, hvilket gør debridering vanskelig. I et sådant tilfælde påføres steril PBS på den okulære overflade for at opretholde optimal hydrering.

Figure 1
Figur 1: 2 mm trephin og stump golfkølle spud. Trefinen bruges til at afgrænse et cirkulært område ved hornhindecentret, og golfkøllespud bruges til at fjerne epitelet inden for det afgrænsede område. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Overvågning af sårlukning og re-epithelialisering

  1. Pipette 1-1,5 μL 1% fluoresceinopløsning på den sårede overflade og billedhornhinden ved hjælp af et digitalt mikroskop med en blå lyskilde.
  2. Anskaf billeder inden for det første minut af fluoresceinopløsning ud over at undgå spredning til omgivende epitel, hvilket fører til overvurdering af sårstørrelsen. Sårede hornhinden afbildes på bestemte tidspunkter (dvs. 0 timer, 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer) efter såring.
    BEMÆRK: På alle tidspunkter udføres billeddannelse under anæstesi; ketamin/xylazin anvendes på såringstidspunktet, mens isofluran anvendes på efterfølgende tidspunkter. Mus anholdes individuelt i separate bure i løbet af sårlukningsovervågningen. Når de er anbragt sammen, har mus en tendens til at slikke kuldkammeratens øjne, en adfærd, der har vist sig at påvirke sårheling i forskellige væv19,20.
  3. Analyser optagne billeder, sporing af sårområde ved hjælp af en billedanalysesoftware. Sårområdet for hvert tidspunkt udtrykkes som en procentdel af det oprindelige sårområde ved 0 timer.

5. Immunofluorescens billeddannelse og analyse

  1. Afliv mus ved en IACUC-godkendt metode (i dette tilfælde overdosering af kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation) på ønskede tidspunkter efter såring.
  2. Høst øjenkugler ved forsigtigt at trykke på den laterale canthus for at fortrænge øjeæblet ved hjælp af iris buet saks. Styr saksen bag øjeæblet for at få et fast greb om synsnerven, og skær derefter nerven, hvilket gør det muligt at fjerne øjeæblet.
  3. Fastgør hvert øjeæble i 1 ml 1x PBS indeholdende 2% paraformaldehyd i 1 time ved stuetemperatur, og vask derefter tre gange i 1 ml 1x PBS i 5 minutter hver.
  4. Under et dissekerende mikroskop skal du bruge et kirurgisk blad til at lave et snit i scleraen, ca. 500 μm distal til limbus, og derefter skære gennem kloden. Brug tang til forsigtigt at fjerne irismaterialet fra hornhinden, og trim derefter forsigtigt scleralvævet væk, og sørg for at lade limbuset være intakt.
  5. Lav fire delvise radiale snit, hver ca. 1 mm i længden, som strækker sig fra den perifere hornhinde og stopper kort fra midten for at lade hornhinden flade ud.
  6. Permeabilisere og blokere hornhinden i 1 ml 2% bovin serumalbumin (BSA) og 0,01% TritonX -100 i 1x PBS i 15 minutter efterfulgt af blokering i 2% BSA i 1x PBS i yderligere 45 minutter ved stuetemperatur.
  7. Inkuber hornhinden natten over ved 4 °C i en cocktail af direkte mærkede unikke fluorokromkonjugerede antistoffer fremstillet i 1x PBS indeholdende 2 % BSA.
    BEMÆRK: Antistoffer er målrettet mod at mærke specifikke celler og væv af interesse. For eksempel er endotel, neutrofiler og blodplader mærket med henholdsvis anti-CD3121,22, anti-Ly-6G23,24 og anti-CD41 25,26 antistoffer. 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) tilsættes til antistofcocktailen for at visualisere kerner.
  8. Efter inkubation vaskes hornhinden tre gange i 1x PBS i 15 minutter hver.
  9. Monter hornhinden på et mikroskop, der glider i en dråbe anti-fade fluorescensmonteringsmedium, dæksel med et dækslip og billede med den ønskede forstørrelse (4x til 100x mål) ved hjælp af et fluorescenslysmikroskop. Tag billeder i fuld tykkelse af hornhinden på tværs af forskellige regioner som illustreret i figur 2A.
    BEMÆRK: Mønsteret af mikroskopisk analyse illustreret i figur 2A bruges til at analysere specifikke regionale ændringer i inflammation og celledeling. Både DAPI og Ly-6G farvning bruges til at identificere de ekstravaskulære neutrofiler. Ved DAPI-farvning har sfæriske neutrofiler en tydelig hestesko- eller doughnutformet kerne (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Hornhindebilleddannelsesstrategi og neutrofilinfiltration efter central slid. (A) Skematisk repræsentation af en hornhindehæl, der viser ni mikroskopiske felter på tværs af hornhindens diameter. Gråzonen repræsenterer det oprindelige sårområde. Bredden af hver region er 500 μm. (B) Bemærk den tydelige hestesko- eller doughnutform af neutrofile kerner med DAPI-farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser en transmissionselektronmikrograf af et hornhindesår skabt med den stumpe golfkøllespeud, hvilket viser, at epitelkældermembranen faktisk er intakt efter skade.

Figure 3
Figur 3: Epitelkældermembranen forbliver intakt efter hornhindeslibning. Transmissionselektronmikrograf af et hornhindesår skabt med den stumpe golfkøllesud. Pilespidserne peger på kældermembranen under det resterende epitel, der omgiver såret, mens pilene peger på kældermembranen i det fornægtede område. Dette viser kontinuiteten i kældermembranen fra de uhæmmede til de slibede dele af hornhinden, hvilket viser, at kældermembranen efterlades intakt efter debridering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Denne protokol til hornhindesår er blevet brugt til i vid udstrækning at karakterisere sårhelingsdynamikken for et 2 mm epitelslibningssår 27,28,29,30,31,32,33. Evnen til at overvåge hastigheden af sårlukning og re-epithelialisering in vivo er en central del af denne model. Som vist i figur 4A muliggør brugen af fluoresceinopløsning og et digitalt mikroskop med en blå lyskilde visualisering af sårstørrelsen. I denne model udføres sårlukningsovervågning på tidspunktet for såring (0 timer), 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer efter såring. Figur 4B viser kinetikken ved sårlukning over 30 timer. I 8-12 uger gamle C57BL/6 vildtypemus er sårlukning og reepithelialisering typisk komplet 24 timer efter såring som illustreret i figur 4B, og et velreguleret inflammatorisk respons er grundlæggende for effektiv sårheling 34,35,36.

Figure 4
Figur 4: Epitelsårlukning blev evalueret ved hjælp af fluoresceinfarvning. (A) Repræsentative billeder af fluoresceinfarvning af hornhindesåret ved 0 timer, 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer. I denne model er sårlukning typisk komplet 24 timer efter såring. Bemærk manglen på grøn farvning i den centrale hornhinde ved 24 timer og 30 timer. (B) Sårlukningskinetik, der indikerer fuldstændig sårlukning med 24 timer efter sårning. Værdien på hvert tidspunkt udtrykkes som en procentdel af det oprindelige sårområde (dvs. sårareal ved 0 timer) (n ≥ 6). Data præsenteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Det inflammatoriske respons på sår i denne model er godt karakteriseret. Epitelslibningssåret fremkalder en hurtig inflammatorisk reaktion i hornhindelet limbal vaskulatur, der hovedsageligt er karakteriseret ved vasodilatation, blodpladeekstravasation begrænset til limbus 37,38,39 og neutrofil ekstravasation med migration mod midten af hornhinden 40. Figur 5 viser limbal vaskulaturen af en usåret hornhinde med ekstravaskulære neutrofiler (figur 5A) og en såret hornhinde med ekstravaskulære blodplader og neutrofiler (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: Inflammatorisk cellebilleddannelse ved limbus. Fotomikrograf af hornhindelimmet, der viser farvning for de limbale blodkar med anti-CD31-antistof (vist i rødt), neutrofiler med anti-Ly-6G-antistof (vist i grønt) og blodplader med anti-CD41-antistof (vist i blåt). A) ingen slidstyrke og B) 30 timer efter slid. Klik her for at se en større version af denne figur.

I denne model vurderes neutrofilinfiltration i hornhinden på tværs af fem forskellige regioner som illustreret i figur 2A. For at bestemme disse forskellige regioner fanges et billede af den fulde hornhinde helmontering, der visualiserer den limbale vaskulatur med anti-CD31-farvning. Den inderste kant af limbalområdet på hvert kronblad er markeret ved hjælp af den limbale vaskulatur som vejledning. Afstanden fra den inderste kant af limbalområdet fra det ene kronblad til det andet i vandret (x) eller lodret (y) retning måles for hver hornhinde helmontering. For 8-12 uger gamle C57BL/6 vildtypemus er denne afstand ~3,7 mm. Denne afstand dækker de perifere til perifere regioner. Midten af hornhindens helmontering beregnes derefter som det punkt, der svarer til halvdelen af den vandrette eller lodrette diameter af hele resten. Den paracentrale region er 500 μm venstre, højre, op eller ned fra det beregnede centrum. De øvrige felter er alle 500 μm fra det foregående felt. Både DAPI og Ly-6G farvning bruges til at identificere de ekstravaskulære neutrofiler. Neutrofiltællinger i hver hornhinderegion fra de fire kvadranter er gennemsnitlige og udtrykt som neutrofiler pr. Mark.

Blodpladevurdering i denne model udføres kun ved limbus; under hornhindesårheling ekstravaserer blodplader og lokaliserer til limbus27,37. Det samlede antal blodplader ved limbus tælles, og antallet udtrykkes som blodplader/mm2 af limbalarealet. Tællingerne fra de fire kronblade kan være samlede eller gennemsnitlige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med dette metodepapir var at beskrive en protokol til oprettelse af et centralt hornhindeepitelslibesår i musen ved hjælp af en trefin og en stump golfkøllesud. Denne murine model er blevet brugt til at studere hornhindebetændelse og dens bidrag til sårheling. Denne type model kan bruges til at studere hornhindesårhelingsmekanismer under normale fysiologiske forhold og i patologier 17,28,29,41,42. Modellen er blevet brugt til at undersøge hornhindesårheling under patologiske tilstande, som det fremgår af en undersøgelse af nedsat hornhindesårheling i en musemodel af diætinduceret fedme17. En klar fordel ved denne model er, at den skaber en nøjagtig (2 mm) reproducerbar epitelsårstørrelse med en præcis central placering uden at bryde ind i kældermembranen. Denne model af hornhindesår er ligetil og hurtig at udføre. Ud over den stumpe golfkølle spud 29,39,43,44,45, den roterende burr (Algerbrush)38,46,47 og diamantblad 32,37,40,48,49,50,51 kan begge bruges til at skabe slidsåret i denne model. I hænderne på en erfaren bruger er der ingen væsentlig forskel i slidsåret, der er skabt af begge værktøjer. Til træningsformål og i hænderne på en nybegynder er det ofte lettere at opnå reproducerbare resultater med den stumpe golfkøllespud sammenlignet med den roterende burr og diamantblad. Den roterende burr (Algerbrush) kræver en delikat berøring, ellers kan den roterende burr beskadige epitelkældermembranen. Dette er også blevet rapporteret af andre efterforskere52,53. På den anden side efterlader den stumpe golfkøllesud konsekvent epitelkældermembranen intakt.

For at kunne reproducere denne hornhindesårprotokol og observere den efterfølgende epithelialisering og inflammationsdynamik skal den samme stamme og aldersgruppe af mus anvendes, og sårets størrelse og dybde skal oprettes som beskrevet ovenfor. Hornhindesårhelingsdynamikken og tidslinjerne beskrevet i denne protokol er for C57BL/6-musestammen og deles muligvis ikke, hvis der anvendes en anden musestamme. Pal-Ghosh et al.54 rapporterede variationer i C57BL/6's og BALB/c's evne til at helbrede hornhindeepiteldebrideringssår. For den samme hornhindesårstørrelse er hornhindesårlukning og reepithelialisering langsommere hos BALB / c-mus. Tidslinjen for afslutning af sårlukning og den karakteristiske inflammatoriske respons, der er beskrevet her, er for et cirkulært sår med en diameter på 2 mm. Der forventes en længere afslutningstid for sårlukning for sårdiametre større end 2 mm, mens der forventes en kortere tid for sårdiametre under 2 mm. Også større hornhindesår, især dem tættere på limbus, forventes at fremkalde et mere overdrevet inflammatorisk respons, da flere leukocytter rekrutteres i hornhinden16. Endnu vigtigere bør såret begrænses til hornhindeepitelet. Sår, der bryder epitelkældermembranen eller trænger ind i hornhindestromaen, tager længere tid at helbrede. Disse sår er også forbundet med et ændret inflammatorisk respons, neovaskularisering, myofibroblastdannelse og ardannelse55,56.

Der skal udvises forsigtighed i hvert trin for at forhindre mikrobiel infektion i den slibede hornhinde. Mikrobiel infektion ændrer det inflammatoriske respons og kan føre til sårdannelser, ardannelse og synstab57. For at forhindre mikrobiel infektion i såret bør sterile værktøjer og opløsninger altid anvendes. Hvis flere mus bliver såret ad gangen, skal der anvendes en steril trephin til hver mus. Mellem musene skal golfkøllespudset vaskes i steril PBS efterfulgt af desinfektion i 70% ethanol og vaskes igen i steril PBS. Hvis såring udføres på yderligere mus over flere dage, skal den udføres på samme tid af dagen. Dette er for at kontrollere den cirkadiske effekt på sårheling og betændelse. I C57BL/6-mus påvirker tidspunktet på dagen, hvor såret fremstilles, hastigheden og kvaliteten af hornhindesårheling. Hurtigere sårlukning og større celledeling observeres, når mus bliver såret om morgenen sammenlignet med sår om eftermiddagen eller aftenen42. Døgnrytmeeffekten på sårheling er rapporteret i andre væv, herunder huden58,59. Sår i denne model udføres altid om morgenen.

Det resulterende inflammatoriske respons på sår i denne model fortsætter som en velkaraktericeret kaskade af cellulære og molekylære hændelser, der er kritiske for effektiv sårheling. De bedst karakteriserede cellulære spillere i den slidinducerede betændelse i denne model er neutrofiler og blodplader. Neutrofiler er de første respondenter på stedet for hornhindeskrabelse; signifikante niveauer af neutrofiler påvises i hornhindestroma inden for 6 timer efter såring. Neutrofiler er ansvarlige for at rydde celleaffald, en proces, der er iboende for betændelse og sårreparation60. Ud over deres fagocytiske aktiviteter indeholder neutrofiler vækstfaktorer såsom vaskulære endotelvækstfaktorer (VEGF)61. VEGF er en afgørende neuro-regenerativ faktor for hornhindenerver regenerering efter sår62,63 og er også vigtig for hornhindeepitelcelledeling45,63. Neutrofil infiltration ved limbus forekommer i to bølger med den første top ved 18 timer og den anden top ved 30 timer efter såring40. Ved hjælp af neutropeniske mus37,40 har neutrofil ekstravasation og efterfølgende migration til midten af hornhinden vist sig at være afgørende for hornhindesårheling. Selvom det traditionelt er kendt for at være afgørende for opretholdelsen af hæmostase og blodkoagulation, har blodplader også en anerkendt nøglerolle i hornhindesårheling37. Blodplader indeholder adskillige mediatorer, der bidrager til betændelse og vævsopløsning64,65. Hos mus med trombocytopeni er denne model blevet brugt til at vise, at blodplader er vigtige for effektiv hornhindesårheling37.

Selvom neutrofiler og blodplader er de bedst karakteriserede celler i denne model, har immunceller som gamma delta T-celler, naturlige dræberceller og dendritiske celler også vist sig at være involveret i immunresponset på sår ved hjælp af denne model27,48. Naturlig dræbercelleekstravasation i stroma 28,29 og migration af gamma delta T-celler til det helbredende epitel27 er blevet rapporteret. Denne model er også blevet brugt til at identificere adhæsionsmolekyler, der er nøglen til immuncelle ekstravasation under hornhinde sårheling. Lymfocytfunktion antigen-1 (LFA-1)32, CD1851 og intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1)47,49 har alle vist sig at være afgørende for neutrofil ekstravasation og effektiv hornhindesårheling ved hjælp af denne model. Epitelcelledeling som reaktion på sårdannelse, hvilket er kritisk for epitel-stratificering efter sårlukning vurderes ved hjælp af mitotiske tal. Kromosomal kondensering i forskellige stadier af celledeling giver kernerne et karakteristisk udseende kendt som en mitotisk figur. DAPI-farvning af kernen muliggør visualisering af disse mitotiske figurer.

Modellen med hornhindeslibning har vist sig at være bemærkelsesværdigt reproducerbar og givet betydelig indsigt i de cellulære og molekylære mekanismer, der bidrager til effektiv sårheling. Det er dog værd at bemærke, at der er begrænsninger for modellen med hensyn til dens kliniske anvendelighed. Modellen og dens resultater gælder kun for enkle, ikke-gennemtrængende epitelafskrabninger. Som tidligere nævnt vil hornhindeskader som følge af gennemtrængende sår forårsaget af fysisk eller kemisk fornærmelse fremkalde forskellige sårhelende kinetik og resultater, især hvis såret bliver inficeret, som det ofte forekommer i tilfælde af skader på den menneskelige hornhinde. Når det er sagt, giver musehornhinde slidsårmodellen et glimrende fundament for at studere grundlæggende principper for betændelse, der modulerer hornhindesårheling.

Hornhindesårprotokollen, der er beskrevet her, er ligetil og let gengivet. Det giver et nyttigt værktøj til at undersøge grundlæggende spørgsmål om hornhindesårhelingsprocessen og dens tilhørende inflammatoriske respons. Dens potentiale til at hjælpe med at forstå hornhindepatologier forbundet med sårhelingskomplikationer er kun begyndelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Finansiering: Støttet af: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. og R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) og Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Medicin udgave 178 hornhinde sårheling slid golfkøllesud trefin
En epitelslibningsmodel til undersøgelse af hornhindesårheling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter