Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

Abstract

הקרנית קריטית לראייה, ומהווה כשני שלישים מכוח השבירה של העין. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית רגישה מאוד למגוון רחב של פציעות שעלולות להוביל לאובדן שקיפות הקרנית ועיוורון בסופו של דבר. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור שקיפות הקרנית ויכולות השבירה. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים והצטלקות. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות. לקראת מטרה זו, מודלים של מורין של פציעת קרנית הוכיחו את עצמם כיעילים לקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. כאן מתואר פרוטוקול ליצירת שחיקה מרכזית של אפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד מועדון גולף קהה. במודל זה, טרפין עגול בקוטר 2 מ"מ, שמרכזו מעל הקרנית, משמש לתיחום אזור הפצע. מועדון הגולף spud משמש בזהירות כדי debride את האפיתל וליצור פצע עגול מבלי לפגוע בקרום מרתף אפיתל הקרנית. התגובה הדלקתית המתקבלת מתרחשת כמפל מאופיין היטב של אירועים תאיים ומולקולריים שהם קריטיים לריפוי פצעים יעיל. מודל פשוט זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי קרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

Introduction

הקרנית היא החלק הקדמי השקוף של שליש מהעין. הקרנית משרתת מספר פונקציות כולל הגנה על המבנים הפנימיים של העין ויצירת מחסום מבני המגן על העין מפני זיהומים1. חשוב מכך, הקרנית חיונית לראייה, ומספקת כשני שלישים מכוח השבירה של העין 2,3. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית חשופה למגוון רחב של פציעות על בסיס יומיומי שעלולות להוביל לשיבוש בתפקוד המחסום שלה, לאובדן שקיפות ולעיוורון בסופו של דבר. אובדן שקיפות הקרנית הוא גורם מוביל ללקוי ראייה ברחבי העולם 4,5. שחיקות קרנית הן סיבה נפוצה לביקורים בחדר המיון (ER), המהווים מחצית מהמקרים הקשורים לעין המוצגים במיון6. על פי הערכות, יותר ממיליון בני אדם סובלים מפציעות הקשורות לעיניים מדי שנה בארצות הברית7. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור השקיפות ויכולות השבירה שלו. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים וצלקותשל 8,9. כמו כן, הפופולריות הגוברת של ניתוחי שבירה מציבה אתגר טראומטי ייחודי על הקרנית10. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות.

לשם כך פותחו מספר מודלים של בעלי חיים של ריפוי פצעי הקרנית 11,12,13,14,15. מודלים של מורין של ריפוי פצעי הקרנית הוכיחו את עצמם כיעילים בקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. סוגים שונים של פצעי הקרנית שימשו בחקר ריפוי פצעי הקרנית, שכל אחד מהם מתאים לחקר היבטים שונים של תהליך ריפוי הפצע. הסוגים הנפוצים ביותר של מודלים של פצעים המשמשים במחקרי ריפוי פצעים בקרנית הם המודלים המכניים והכימיים של פצעים. פצעי קרנית כימיים, הכוללים בעיקר יצירת כוויות אלקליין על הקרנית, שימושיים לחקר כיבים בקרנית, אטימות וניאו-וסקולריזציה13. פצעי קרנית מכניים כוללים פצעי חיטוי (שחיקה) ופצעי כריתת קרטום 14,15,16. קרום מרתף אפיתל שלם או פרוץ של הקרנית מגדיר פצעי כריתה וקרתית דם, בהתאמה. בפצעי חיטוי, קרום מרתף האפיתל נשאר שלם, בעוד שבפצעי כריתת קרטום, קרום המרתף נפרץ עם חדירה בעיקר לתוך הסטרומה הקדמית. פצעי חיטוי הם השימושיים ביותר לחקר אפיתליאליזציה מחדש, התפשטות תאי אפיתל, תגובה חיסונית והתחדשות עצבים בעקבות פציעת הקרנית. פצעי כריתת קרטקומיה, לעומת זאת, שימושיים ביותר לחקר הצטלקות הקרנית14,15.

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל ריפוי פצעי הקרנית הפשוט הזה ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי הקרנית שנפגעו בהקשר של מחלה17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יוסטון ובמכללת ביילור לרפואה. ההנחיות שפורטו בהצהרת האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) בדבר השימוש בבעלי חיים בראייה ובמחקרי עיניים, בוצעו בטיפול בעכברים ובשימוש בהם.

1. הכנה

  1. הכנת תמיסת פלואורסצין
    1. יש להכין תמיסת פלואורסציין של 1% על ידי המסת 10 מ"ג של מלח נתרן פלואורסציין ב-1 מ"ל של מלח סטרילי או מי מלח סטריליים 1x פוספטים (PBS).
      הערה: הכינו תמיסת נתרן פלואורסציין ביום השימוש או יום לפני כן כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. כאשר מכינים זאת יום לפני השימוש, יש לאחסן את תמיסת הפלואורסצין במרחק של 4 מעלות צלזיוס מהאור. עוטפים צינורות בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנת תמונות.
    2. חלקו את התמיסה לאליפוטים המתאימים לשימוש בניסוי אחד. 1-1.5 μL של תמיסת פלואורסציין משמש לכל עכבר לכל נקודת זמן. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפח ה- aliquot המתאים לניסוי יחיד:
      Equation 1
      הערה: לדוגמה, אם שישה עכברים נחקרים בניסוי יחיד עם גודל פצע מנוטר בחמש נקודות זמן, נפח האליקוט המתאים לניסוי יחיד זה יהיה:
      Equation 2
  2. הכנת קוקטייל קטמין/קסילאזין להרדמה של עכברים.
    1. כדי להכין 10 מ"ל של קוקטייל, יש לערבב 2.0 מ"ל של קטמין (100 מ"ג/מ"ל) עם 1.0 מ"ל של קסילאזין (20 מ"ג/מ"ל), ולהוסיף 7.0 מ"ל של PBS סטרילי. מכינים קוקטייל קטמין/קסילאזין יום לפני או ביום הניתוח.
      הערה: יש להשתמש בכל הפתרונות בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת.

2. הרדמה

  1. שקלו את העכבר (עכברי C57BL/6 wildtype בני 8-12 שבועות) כדי לקבוע את הכמות המתאימה של חומר הרדמה למתן. השתמש בטכניקת ריסון העכבר בשתי ידיים כדי לרסן ולטפל בעכברים להזרקת ההרדמה18. יש לתת קטמין/קוקטייל קסילאזין תוך-צפקינלי (i.p.) בריכוז סופי של 80 מ"ג/ק"ג של קטמין ו-8 מ"ג/ק"ג קסילאזין.
  2. יש להמתין עד שתושג הרדמה מלאה לפני ביצוע פציעת קרנית בעכבר. להעריך את עומק ההרדמה על ידי הערכת רפלקס הדוושה לאחר צביטה בבוהן. כאשר הרדמה נאותה מושגת, העכבר לא צריך לזוז על צביטה הבוהן.
    הערה: מכיוון שעכברים מאבדים במהירות את חום הגוף במהלך ההרדמה, חשוב לספק מקור חום לעכברים כדי למנוע היפותרמיה. הניחו את העכברים על מקור חום (כרית חימום) בשלבי ההרדמה וההחלמה.

3. יצירת פצע הקרנית

  1. פצעו את עין ימין או שמאל בלבד. שמרו על עקביות עם העין (כלומר, שמאלה או ימינה) שנפצעת בעת מעבר מעכבר לעכבר.
    הערה: מכיוון ששפשופים פוגעים בעצבי הקרנית ומפחיתים את החדות, פציעה בשתי העיניים עלולה לגרום לאי נוחות ופגיעה משמעותית. מאחר שלמשככי כאבים יש פוטנציאל לדכא תגובות דלקתיות, השימוש בהם עשוי להיות מבלבל בניסויים מסוימים שמטרתם להבין את דלקת הקרנית. הימנעות ממשככי כאבים בניסויים בפצעי קרנית אושרה על ידי הוועדה המוסדית שלנו לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
  2. כדי ליצור את פצע הקרנית אפיתל
    1. תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמשו בטרפין בקוטר 2 מ"מ (ראו איור 1) כדי לתחם את מרכז הקרנית, והשאירו את העין פתוחה לרווחה באמצעות האגודל והאצבע המורה כדי להחזיק את העפעפיים. סובבו בעדינות את הטרפין כדי לעשות רושם על אפיתל הקרנית.
      הערה: יש להקפיד שלא להפעיל לחץ מוגזם בעת שימוש בטרפין מכיוון שהדבר עלול לגרום לניקוב הקרנית. כמו כן, יש להקפיד למקם את הטרפין במרכז. האישונים יכולים לשמש כנקודת ציון לאיתור מרכז הקרנית.
    2. תחת מיקרוסקופ מנתח, החזיקו את ה-spud של מועדון הגולף הקהה (ראו איור 1) במרחק של כ-45° מפני השטח של הקרנית בתוך האזור התוחם עם הטרפין. בזהירות וברציפות לגרד את האפיתל בתוך האזור התוחם עם spud כדי debride את האפיתל.
      הערה: אין להפעיל כוח מופרז ב- debridement מכיוון שזה יכול גם לגרום לניקוב הקרנית. עיניהם של עכברים יכולות להתייבש במהלך תהליך הפציעה, מה שמקשה על ההדברה. במקרה כזה, להחיל PBS סטרילי על משטח העין כדי לשמור על הידרציה אופטימלית.

Figure 1
איור 1: טרפין 2 מ"מ וספוד מועדון גולף קהה. הטרפין משמש לתיחום אזור מעגלי במרכז הקרנית, ומועדון הגולף spud משמש להסרת האפיתל בתוך האזור התוחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. מעקב אחר סגירת הפצע ואפיתליזציה מחדש

  1. פיפטה 1-1.5 μL של תמיסת פלואורסציין של 1% על פני השטח הפצועים וקרנית תמונה באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי עם מקור אור כחול.
  2. רכשו תמונות בדקה הראשונה של תוספת תמיסת הפלואורסצין כדי למנוע התפשטות לאפיתל שמסביב, מה שמוביל להערכת יתר של גודל הפצע. קרניות פצועות מצולמות בזמנים ספציפיים (כלומר, 0 שעות, 12 שעות, 18 שעות, 24 שעות ו-30 שעות) לאחר הפציעה.
    הערה: בכל נקודות הזמן, ההדמיה מתבצעת בהרדמה; קטמין/קסילאזין משמש בזמן הפציעה בעוד איזופלורן משמש בנקודות הזמן הבאות. עכברים שוכנים בנפרד בכלובים נפרדים למשך כל הזמן של ניטור סגירת הפצע. כאשר הם שוכנים יחד, עכברים נוטים ללקק את עיניו של חבר המלטה, התנהגות שהוכחה כמשפיעה על ריפוי פצעים ברקמות שונות19,20.
  3. נתח תמונות שצולמו, תוך התחקות אחר אזור הפצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. אזור הפצע עבור כל נקודת זמן מתבטא כאחוז מאזור הפצע המקורי בשעה 0.

5. הדמיה וניתוח אימונופלואורסצנטיות

  1. המתת חסד עכברים בשיטה שאושרה על ידי IACUC (במקרה זה, מנת יתר של פחמן דו חמצני ואחריה נקע צוואר הרחם) בנקודות הזמן הרצויות לאחר הפציעה.
  2. קציר את גלגלי העיניים על ידי לחיצה עדינה על הקנטוס הצדדי כדי לעקור את גלגל העין באמצעות מספריים מעוקלים בקשתית. הנחה את המספריים מאחורי גלגל העין לתפוס בחוזקה את עצב הראייה, ולאחר מכן לחתוך את העצב, המאפשר להסיר את גלגל העין.
  3. קבעו כל גלגל עיניים ב-1 מ"ל של 1x PBS המכיל 2% פרפורמלדהיד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים ב-1 מ"ל של 1x PBS למשך 5 דקות כל אחד.
  4. תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש בלהב כירורגי כדי לבצע חתך בסקלרה, כ-500 מיקרומטר דיסטלי ללימבוס, ולאחר מכן חתך את כדור הארץ. באמצעות מלקחיים, הסר בעדינות את חומר הקשתית מהקרנית, ולאחר מכן חתך בזהירות את הרקמה הסקלרלית, תוך הקפדה להשאיר את הלימבוס שלם.
  5. בצע ארבעה חתכים רדיאליים חלקיים, כל אחד באורך של כ-1 מ"מ, המשתרעים מהקרנית ההיקפית ועוצרים קצר מהמרכז כדי לאפשר לקרנית להשתטח.
  6. מחלחלים וחוסמים קרניות ב-1 מ"ל של 2% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.01% TritonX -100 ב-1x PBS למשך 15 דקות ולאחר מכן חוסמים 2% BSA ב-1x PBS למשך 45 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
  7. דגירה של קרניות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בקוקטייל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום ייחודיים המסומנים ישירות, המוכנים ב-1x PBS המכילים 2% BSA.
    הערה: נוגדנים ממוקדים לסימון תאים ורקמות ספציפיים בעלי עניין. לדוגמה, אנדותל, נויטרופילים וטסיות דם מסומנים בנוגדנים נגד CD3121,22, אנטי-Ly-6G23,24 ונוגדנים נגד CD4125,26, בהתאמה. 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) מתווסף לקוקטייל הנוגדנים כדי להמחיש גרעינים.
  8. לאחר הדגירה, יש לשטוף קרניות שלוש פעמים ב-1x PBS למשך 15 דקות כל אחת.
  9. הר קרניות על שקופית מיקרוסקופ בטיפה של תווך הרכבה פלואורסצנטית נגד דהייה, כיסוי עם כיסוי, ותמונה עם ההגדלה הרצויה (4x עד 100x מטרה) באמצעות מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי. צלם תמונות בעובי מלא של הקרנית באזורים שונים, כפי שמודגם באיור 2A.
    הערה: תבנית הניתוח המיקרוסקופי המתוארת באיור 2A משמשת לניתוח שינויים אזוריים ספציפיים בדלקת ובחלוקת תאים. גם צביעת DAPI וגם Ly-6G משמשים לזיהוי הנויטרופילים האקסטרווסקולריים. עם צביעת DAPI, לנויטרופילים כדוריים יש גרעין ייחודי בצורת פרסה או סופגנייה (איור 2B).

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית הדמיית הקרנית וחדירת נויטרופילים לאחר שחיקה מרכזית. (A) ייצוג סכמטי של הקרנית כולה המציג תשעה שדות מיקרוסקופיים בקוטר הקרנית. השטח האפור מייצג את אזור הפצע המקורי. הרוחב של כל אזור הוא 500 מיקרומטר. (B) שימו לב לצורת הפרסה או הסופגנייה המובהקת של גרעיני נויטרופילים עם צביעת DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3 מראה מיקרוגרף אלקטרוני תמסורת של פצע בקרנית שנוצר עם ספוד מועדון הגולף הקהה, ומדגים כי קרום המרתף האפיתליאלי אכן שלם לאחר פציעה.

Figure 3
איור 3: קרום מרתף אפיתל נשאר שלם לאחר שחיקת הקרנית. מיקרוגרף אלקטרונים של תמסורת של פצע קרנית שנוצר עם מועדון הגולף הבוטה spud. ראשי החצים מצביעים על קרום המרתף שמתחת לאפיתל שנותר המקיף את הפצע, בעוד שהחצים מצביעים על קרום המרתף באזור המנוקד. זה מראה את ההמשכיות של קרום המרתף מהחלקים הלא מרופדים לחלקים המבוהלים של הקרנית, מה שמדגים כי קרום המרתף נותר שלם לאחר ההשחתה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

פרוטוקול זה לפציעת קרנית שימש לאפיון נרחב של דינמיקת ריפוי הפצע עבור פצע שחיקה אפיתליאלי 2 מ"מ 27,28,29,30,31,32,33. היכולת לעקוב אחר קצב סגירת הפצע ואפיתליזציה מחדש in vivo היא חלק מרכזי במודל זה. כפי שניתן לראות באיור 4A, השימוש בתמיסת פלואורסציין ובמיקרוסקופ דיגיטלי עם מקור אור כחול מאפשר הדמיה של גודל הפצע. במודל זה, ניטור סגירת הפצע מתבצע בזמן הפציעה (0 שעות), 12 שעות, 18 שעות, 24 שעות ו -30 שעות לאחר הפציעה. איור 4B מראה את הקינטיקה של סגירת הפצע במשך 30 שעות. בעכברים מסוג בר C57BL/6 בני 8-12 שבועות, סגירת פצעים ואפיתליזציה מחדש הושלמו בדרך כלל 24 שעות לאחר הפציעה כפי שמודגם באיור 4B ותגובה דלקתית מוסדרת היטב היא בסיסית לריפוי פצעים יעיל 34,35,36.

Figure 4
איור 4: סגירת פצע אפיתל הוערכה באמצעות צביעת פלואורסצין. (A) תמונות מייצגות של צביעת פלואורסצין של פצע הקרנית ב-0 שעות, 12 שעות, 18 שעות, 24 שעות ו-30 שעות. במודל זה, סגירת הפצע הושלמה בדרך כלל 24 שעות לאחר הפציעה. שימו לב להיעדר צביעה ירוקה בקרנית המרכזית ב-24 שעות ו-30 שעות(B) קינטיקה של סגירת פצעים המציינת סגירה מוחלטת של הפצע ב-24 שעות לאחר הפציעה. הערך בכל נקודת זמן מבוטא כאחוז מאזור הפצע המקורי (כלומר, אזור הפצע ב-0 שעות) (n ≥ 6). נתונים המוצגים כסטיית תקן ממוצעת ±. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

התגובה הדלקתית לפציעה במודל זה מאופיינת היטב. פצע שחיקת האפיתל מעורר תגובה דלקתית מהירה בכלי הדם הגפיים הקרניים המאופיינים בעיקר בהרחבת כלי הדם, ראוותנות טסיות הדם המוגבלת ללימבוס 37,38,39 וראוותנות נויטרופילית עם נדידה לכיוון מרכז הקרנית40. איור 5 מראה את כלי הדם הלימביים של קרנית לא מעוותת עם נויטרופילים חוץ-וסקולריים (איור 5A) וקרנית פצועה עם טסיות דם חוץ-וסקולריות ונויטרופילים (איור 5B).

Figure 5
איור 5: הדמיית תאים דלקתיים בלימבוס. פוטומיקרוגרף של לימבוס הקרנית מראה כתמים לכלי הדם הלימביים עם נוגדן נגד CD31 (מוצג באדום), נויטרופילים עם נוגדן anti-Ly-6G (מוצג בירוק), וטסיות עם נוגדן נגד CD41 (מוצג בכחול). (A) ללא שחיקה ו-(ב) 30 שעות לאחר שחיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

במודל זה, חדירת נויטרופילים לקרנית מוערכת על פני חמישה אזורים נפרדים כפי שמודגם באיור 2A. כדי לקבוע את האזורים המובהקים האלה, נלכדת תמונה של הקרנית המלאה, הממחישה את כלי הדם הגפיים עם צביעה נגד CD31. הקצה הפנימי ביותר של האזור הלימבי על כל עלי כותרת מסומן באמצעות כלי הדם הגפיים כמדריך. המרחק מהקצה הפנימי ביותר של האזור הלימלי מעלי כותרת אחד לשני בכיוון האופקי (x) או האנכי (y) נמדד עבור כל קרנית בשלמותה. עבור עכברים מסוג C57BL/6 בני 8-12 שבועות, מרחק זה הוא כ-3.7 מ"מ. מרחק זה מכסה את האזורים ההיקפיים-להיקפיים. לאחר מכן מחושב מרכז הקרנית כולה כנקודה המתאימה למחצית מהקוטר האופקי או האנכי של כל ההר. האזור הפרה-צנטרלי הוא 500 מיקרומטר שמאלה, ימינה, למעלה או למטה מהמרכז המחושב. השדות האחרים הם כולם 500 מיקרומטר מהשדה הקודם. גם צביעת DAPI וגם Ly-6G משמשים לזיהוי הנויטרופילים האקסטרווסקולריים. ספירות נויטרופילים בכל אזור קרנית מארבעת הרבעים ממוצעות ומבוטאות כנויטרופילים לכל שדה.

הערכת טסיות דם במודל זה מבוצעת בלימבוס בלבד; במהלך ריפוי פצע הקרנית, טסיות הדם מתרבות ומתמקמות ללימבוס27,37. המספר הכולל של טסיות הדם בלימבוס נספר, והספירות מבוטאות כטסיות/מ"מ2 של שטח הגפיים. הספירות מארבעת עלי הכותרת ניתנות לסכם או לממוצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת מאמר השיטות הזה הייתה לתאר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל מורין זה שימש לחקר דלקת הקרנית ותרומתה לריפוי פצעים. סוג זה של מודל יכול לשמש לחקר מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית בתנאים פיזיולוגיים רגילים ובפתולוגיות 17,28,29,41,42. המודל שימש לחקר ריפוי פצעי הקרנית בתנאים פתולוגיים כפי שמעיד מחקר על ריפוי פצעי קרנית לקויים במודל עכברי של השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה17. יתרון מובהק של מודל זה הוא שהוא יוצר גודל מדויק (2 מ"מ) של פצע אפיתל הניתן לשחזור עם מיקום מרכזי מדויק מבלי לפרוץ את קרום המרתף. מודל זה של פציעת הקרנית הוא פשוט ומהיר לביצוע. בנוסף למועדון הגולף הבוטה spud 29,39,43,44,44,45, הבור המסתובב (Algerbrush)38,46,47, ולהב היהלום 32,37,40,48,49,50,51 ניתן להשתמש בשניהם כדי ליצור את פצע השחיקה במודל זה. בידיו של משתמש מנוסה, אין הבדל מהותי בפצע השחיקה שנוצר על ידי אף אחד מהכלים. למטרות אימון ובידיו של טירון, לעתים קרובות קל יותר להשיג תוצאות ניתנות לשחזור עם ספוד מועדון הגולף הבוטה בהשוואה לבור המסתובב וללהב היהלום. הבור המסתובב (Algerbrush) דורש מגע עדין אחרת הבור המסתובב עלול לפגוע בקרום המרתף האפיתליאלי. כך דווח גם על ידי חוקרים אחרים52,53. מצד שני, מועדון הגולף הבוטה ספוד משאיר בעקביות את קרום מרתף האפיתל ללא פגע.

כדי לשחזר בהצלחה את פרוטוקול פציעת הקרנית הזה ולהתבונן בדינמיקה שלאחר מכן של אפיתליזציה ודלקת, יש להשתמש באותו זן וטווח גילאים של העכבר, וליצור את הגודל והעומק של הפצע כמתואר לעיל. הדינמיקה של ריפוי פצעי הקרנית וצירי הזמן המתוארים בפרוטוקול זה מיועדים לזן העכבר C57BL/6 וייתכן שלא ישתתפו אם נעשה שימוש בזן עכבר אחר. Pal-Ghosh et al.54 דיווחו על הבדלים ביכולתם של C57BL/6 ו-BALB/c לרפא פצעי אפיתל בקרנית. עבור אותו גודל של פצע הקרנית, סגירת פצע הקרנית ואפיתליזציה מחדש איטיות יותר בעכברי BALB/c. ציר הזמן להשלמת סגירת הפצע והתגובה הדלקתית האופיינית המתוארת כאן הם עבור פצע מעגלי בקוטר 2 מ"מ. זמן סיום ארוך יותר של סגירת הפצע צפוי עבור קוטרי פצעים הגדולים מ-2 מ"מ, בעוד שזמן קצר יותר צפוי לקוטרי פצעים הנמוכים מ-2 מ"מ. כמו כן, פצעי קרנית גדולים יותר, במיוחד אלה הקרובים יותר ללימבוס, צפויים לעורר תגובה דלקתית מוגזמת יותר, ככל שיותר לויקוציטים מגויסים לקרנית16. חשוב מכך, הפצע צריך להיות מוגבל לאפיתל הקרנית. לפצעים שחודרים למרתף האפיתל או חודרים לסטרומה הקרנית לוקח זמן רב יותר להחלים. פצעים אלה קשורים גם לשינוי בתגובה דלקתית, ניאו-וסקולריזציה, היווצרות מיופיברובלסט וצלקותשל 55,56.

יש להקפיד על כל צעד כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי של הקרנית המקולקלת. זיהום מיקרוביאלי משנה את התגובה הדלקתית ועלול להוביל לכיבים, הצטלקות ואובדן ראייה57. כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי של הפצע, כלים סטריליים ופתרונות יש להשתמש תמיד. אם מספר עכברים נפצעים בכל פעם, יש להשתמש בטרפין סטרילי עבור כל עכבר. בין העכברים, יש לשטוף את הספוד של מועדון הגולף ב-PBS סטרילי ולאחר מכן לבצע חיטוי ב-70% אתנול ולשטוף אותו שוב ב-PBS סטרילי. אם הפציעה מבוצעת בעכברים נוספים במשך מספר ימים, יש לבצע אותה באותה שעה ביום. זאת כדי לשלוט בהשפעה הצירקדיאנית על ריפוי פצעים ודלקת. בעכברי C57BL/6, השעה ביום שבה נוצר הפצע משפיעה על קצב ואיכות הריפוי של פצע הקרנית. סגירת פצעים מהירה יותר וחלוקת תאים גדולה יותר נצפות כאשר עכברים נפצעים בבוקר בהשוואה לפציעה בשעות אחר הצהריים או בערב42. ההשפעה הצירקדיאנית על ריפוי פצעים דווחה ברקמות אחרות, כולל העור58,59. פציעה במודל זה מבוצעת תמיד בבוקר.

התגובה הדלקתית לפציעה המתקבלת כתוצאה מכך במודל זה מתנהלת כמפל מאופיין היטב של אירועים תאיים ומולקולריים שהם קריטיים לריפוי פצעים יעיל. השחקנים התאיים המאופיינים בצורה הטובה ביותר בדלקת הנגרמת על ידי שחיקה במודל זה הם נויטרופילים וטסיות דם. נויטרופילים הם המגיבים הראשונים לאתר שחיקת הקרנית; רמות משמעותיות של נויטרופילים מזוהות בסטרומה הקרנית תוך 6 שעות מהפציעה. נויטרופילים אחראים לפינוי פסולת תאים, תהליך מהותי לדלקת ולתיקון פצעים60. בנוסף לפעילות הפאגוציטית שלהם, נויטרופילים מכילים גורמי גדילה כגון גורמי גדילה אנדותליאליים וסקולריים (VEGF)61. VEGF הוא גורם נוירו-רגנרטיבי חיוני להתחדשות עצבי הקרנית לאחר פציעהשל 62,63, והוא חשוב גם לחלוקת תאי אפיתל הקרנית45,63. חדירת נויטרופילים ללימבוס מתרחשת בשני גלים כאשר השיא הראשון הוא 18 שעות והשיא השני הוא 30 שעות לאחר פציעהשל 40. באמצעות שימוש בעכברים נויטרופניים37,40, ראוותנות נויטרופילים ונדידה לאחר מכן למרכז הקרנית הוכחו כחיוניים לריפוי פצעי הקרנית. למרות שבאופן מסורתי ידוע כגורם מרכזי בשמירה על המוסטזיס וקרישת דם, לטסיות הדם יש גם תפקיד מפתח מוכר בריפוי פצעי הקרנית37. טסיות הדם מכילות מתווכים רבים התורמים לדלקת ולרזולוציהשל רקמות 64,65. בעכברים עם טרומבוציטופניה, נעשה שימוש במודל זה כדי להראות כי טסיות דם חשובות לריפוי יעיל של פצעי הקרנית37.

אף על פי שנויטרופילים וטסיות דם הם התאים המאופיינים בצורה הטובה ביותר במודל זה, הודגם כי תאים חיסוניים כגון תאי T של גמא דלתא, תאי הרג טבעיים ותאים דנדריטיים מעורבים גם הם בתגובה החיסונית לפציעה באמצעות מודל זה27,48. דווח על ראוותנות של תאי הרג טבעיים בסטרומה28,29 והגירה של תאי T של גמא דלתא לתוך אפיתל הריפוי27. מודל זה שימש גם לזיהוי מולקולות הידבקות המפתח לפזרנות תאי מערכת החיסון במהלך ריפוי פצעי הקרנית. אנטיגן תפקוד לימפוציטים-1 (LFA-1)32, CD1851, ומולקולת הידבקות בין-תאית-1 (ICAM-1)47,49 הוכחו כולם כחיוניים לאקסטרווגציה של נויטרופילים ולריפוי יעיל של פצעי הקרנית באמצעות מודל זה. חלוקת תאי אפיתל בתגובה לפציעה, שהיא קריטית לריבוד מחדש של אפיתל לאחר סגירת הפצע, נבחנת באמצעות דמויות מיטוטיות. עיבוי כרומוזומלי בשלבים שונים של חלוקת תאים מעניק לגרעינים מראה אופייני המכונה דמות מיטוטית. צביעת DAPI של הגרעין מאפשרת הדמיה של דמויות מיטוטיות אלה.

מודל פצעי השחיקה של הקרנית בעכבר הוכח כניתן לשחזור יוצא דופן וסיפק תובנות רבות על המנגנונים התאיים והמולקולריים התורמים לריפוי פצעים יעיל. עם זאת, ראוי לציין כי ישנן מגבלות למודל ביחס לתחולתו הקלינית. המודל ותוצאותיו חלים רק על שחיקות אפיתל פשוטות שאינן חודרות. כפי שצוין קודם לכן, פציעות קרנית הנובעות מפצעים חודרים הנגרמים על ידי עלבון פיזי או כימי יעוררו קינטיקה ותוצאות שונות של ריפוי פצעים, במיוחד אם הפצע מזדהם כפי שקורה לעתים קרובות במקרה של פגיעות בקרנית האנושית. עם זאת, מודל פצעי השחיקה של הקרנית בעכבר מספק בסיס מצוין לחקר עקרונות בסיסיים של דלקת המווסתים את ריפוי פצעי הקרנית.

פרוטוקול פציעת הקרנית המתואר כאן הוא פשוט וקל לשחזור. הוא מספק כלי שימושי כדי לחקור שאלות בסיסיות על תהליך ריפוי פצע הקרנית ועל התגובה הדלקתית הקשורה אליו. הפוטנציאל שלה לסייע בהבנת פתולוגיות של הקרנית הקשורות לסיבוכי ריפוי פצעים היא רק ההתחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מימון: נתמך על ידי: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., ו- R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), ומענק סיגמא שי בסיוע למחקר (P.K.A.). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות, או סיגמא שי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

רפואה גיליון 178 קרנית ריפוי פצעים שחיקה ספוד במועדון גולף טרפין
מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter