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Medicine

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

Abstract

La cornea è fondamentale per la visione, rappresentando circa i due terzi del potere rifrattivo dell'occhio. Cruciale per il ruolo della cornea nella visione è la sua trasparenza. Tuttavia, a causa della sua posizione esterna, la cornea è altamente suscettibile a un'ampia varietà di lesioni che possono portare alla perdita di trasparenza corneale e all'eventuale cecità. Un'efficiente guarigione delle ferite corneali in risposta a queste lesioni è fondamentale per mantenere l'omeostasi corneale e la conservazione della trasparenza corneale e delle capacità di rifrazione. In caso di compromissione della guarigione delle ferite corneali, la cornea diventa vulnerabile a infezioni, ulcerazioni e cicatrici. Data l'importanza fondamentale della guarigione delle ferite corneali per la conservazione della trasparenza e della visione corneale, una migliore comprensione del normale processo di guarigione delle ferite corneali è un prerequisito per comprendere la compromissione della guarigione delle ferite corneali associata a infezioni e malattie. Verso questo obiettivo, i modelli murini di ferite corneali si sono dimostrati utili per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi di guarigione delle ferite corneali che operano in condizioni fisiologiche normali. Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di un'abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. In questo modello, una trefina circolare di 2 mm di diametro, centrata sulla cornea, viene utilizzata per delimitare l'area della ferita. Lo spud della mazza da golf viene utilizzato con cura per sbrigliare l'epitelio e creare una ferita circolare senza danneggiare la membrana basale epiteliale corneale. La risposta infiammatoria risultante procede come una cascata ben caratterizzata di eventi cellulari e molecolari che sono fondamentali per una guarigione efficiente delle ferite. Questo semplice modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e ben pubblicato e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto della malattia.

Introduction

La cornea è il trasparente anteriore un terzo dell'occhio. La cornea svolge diverse funzioni tra cui la protezione delle strutture interne dell'occhio e la formazione di una barriera strutturale che protegge l'occhio dalle infezioni1. Ancora più importante, la cornea è fondamentale per la visione, fornendo circa i due terzi del potere di rifrazione dell'occhio 2,3. Cruciale per il ruolo della cornea nella visione è la sua trasparenza. Tuttavia, a causa della sua posizione verso l'esterno, la cornea è esposta a un'ampia varietà di lesioni su base giornaliera che possono portare all'interruzione della sua funzione di barriera, perdita di trasparenza ed eventuale cecità. La perdita di trasparenza corneale è una delle principali cause di disabilità visiva in tutto il mondo 4,5. Le abrasioni corneali sono un motivo comune per le visite al pronto soccorso (ER), rappresentando la metà dei casi correlati agli occhi presentati al ER6. Si stima che oltre 1 milione di persone soffrano di lesioni oculari ogni anno negli Stati Uniti7. Un'efficiente guarigione delle ferite corneali in risposta a queste lesioni è fondamentale per mantenere l'omeostasi corneale e preservare la sua trasparenza e le sue capacità di rifrazione. In caso di compromissione della guarigione delle ferite corneali, la cornea diventa vulnerabile a infezioni, ulcerazioni e cicatrici 8,9. Inoltre, la crescente popolarità degli interventi chirurgici refrattivi pone una sfida traumatica unica sulla cornea10. Data l'importanza fondamentale della guarigione delle ferite corneali per la conservazione della trasparenza e della visione corneale, una migliore comprensione del normale processo di guarigione delle ferite corneali è un prerequisito per comprendere la compromissione della guarigione delle ferite corneali associata a infezioni e malattie.

A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli animali di guarigione delle ferite corneali 11,12,13,14,15. I modelli murini di guarigione delle ferite corneali si sono dimostrati utili per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi di guarigione delle ferite corneali che operano in normali condizioni fisiologiche. Diversi tipi di ferite corneali sono stati impiegati nello studio della guarigione delle ferite corneali, ognuno adatto per indagare diversi aspetti del processo di guarigione delle ferite. I tipi più comuni di modelli di ferite utilizzati negli studi di guarigione delle ferite corneali sono i modelli di ferite meccaniche e chimiche. Le ferite corneali chimiche, che coinvolgono principalmente la creazione di ustioni alcaline sulla cornea, sono utili per studiare le ulcere corneali, l'opacizzazione e la neovascolarizzazione13. Le ferite corneali meccaniche comportano ferite da debridement (abrasione) e ferite da cheratectomia 14,15,16. Una membrana basale epiteliale corneale intatta o violata definisce rispettivamente le ferite da debridement e cheratectomia. Nelle ferite da debridement, la membrana basale epiteliale rimane intatta, mentre nelle ferite da cheratectomia, la membrana basale viene violata con la penetrazione principalmente nello stroma anteriore. Le ferite da debridement sono più utili per studiare la riepitelizzazione, la proliferazione delle cellule epiteliali, la risposta immunitaria e la rigenerazione nervosa dopo la ferita corneale. Le ferite da cheratectomia, d'altra parte, sono più utili per studiare le cicatrici corneali14,15.

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo semplice modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e ben pubblicato e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto della malattia17.

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Protocol

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Houston e il Baylor College of Medicine. Le linee guida delineate nella dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) sull'uso degli animali nella visione e nella ricerca oftalmica sono state seguite nella gestione e nell'uso dei topi.

1. Preparazione

  1. Preparazione della soluzione di fluoresceina
    1. Preparare la soluzione di fluoresceina all'1% sciogliendo 10 mg di sale di fluoresceina sodica in 1 mL di soluzione salina sterile o sterile 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: Preparare la soluzione di fluoresceina sodica il giorno dell'uso o un giorno prima per evitare la contaminazione microbica. Se preparato un giorno prima dell'uso, conservare la soluzione di fluoresceina a 4 °C al riparo dalla luce. Avvolgere i tubi con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento.
    2. Dividere la soluzione in aliquote adatte all'uso in un singolo esperimento. 1-1,5 μL di soluzione di fluoresceina viene utilizzato per topo per punto temporale. Utilizzare la seguente formula per calcolare il volume di aliquota appropriato per un singolo esperimento:
      Equation 1
      NOTA: Ad esempio, se sei topi vengono studiati in un singolo esperimento con la dimensione della ferita monitorata in cinque punti temporali, il volume di aliquota adatto per quel singolo esperimento sarebbe:
      Equation 2
  2. Preparazione di cocktail ketamina / xilazina per anestesia di topi.
    1. Per preparare 10 mL di cocktail, mescolare 2,0 mL di ketamina (100 mg/mL) con 1,0 mL di xilazina (20 mg/mL) e aggiungere 7,0 mL di PBS sterile. Preparare il cocktail ketamina / xilazina un giorno prima o il giorno dell'intervento.
      NOTA: tutte le soluzioni devono essere utilizzate a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.

2. Anestesia

  1. Pesare il topo (topi C57BL/6 wildtype di 8-12 settimane) per determinare la quantità appropriata di anestetico da somministrare. Utilizzare la tecnica di ritenuta del mouse a due mani per trattenere e maneggiare i topi per l'iniezione dell'anestetico18. Somministrare ketamina/xilazina cocktail per via intraperitoneale (i.p.) ad una concentrazione finale di 80 mg/kg di ketamina e 8 mg/kg di xilazina.
  2. Attendere fino al raggiungimento dell'anestesia completa prima di eseguire ferite corneali sul topo. Valutare la profondità dell'anestesia valutando il riflesso del pedale dopo il pizzicamento delle dita dei piedi. Quando si ottiene un'anestesia adeguata, il mouse non deve muoversi sul pizzico della punta.
    NOTA: Poiché i topi perdono rapidamente calore corporeo durante l'anestesia, è importante fornire una fonte di calore per i topi per prevenire l'ipotermia. Posizionare i topi su una fonte di calore (piastra riscaldante) durante l'anestesia e le fasi di recupero.

3. Creazione della ferita corneale

  1. Ferire solo l'occhio destro o sinistro. Mantenere la coerenza con l'occhio (cioè sinistro o destro) che viene ferito quando si passa da un mouse all'altro.
    NOTA: Poiché le abrasioni danneggiano i nervi corneali e riducono l'acuità, ferire entrambi gli occhi può causare disagio e compromissione significativi. Poiché gli analgesici hanno il potenziale per sopprimere le risposte infiammatorie, il loro uso può essere un fattore confondente in alcuni esperimenti volti a comprendere l'infiammazione corneale. Evitare gli analgesici negli esperimenti sulle ferite corneali è stato approvato dal nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).
  2. Per creare la ferita corneale epiteliale
    1. Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare la trefina di 2 mm di diametro (vedi Figura 1) per delimitare il centro della cornea, tenendo l'occhio spalancato usando il pollice e l'indice per tenere le palpebre. Ruotare delicatamente la trefina per fare impressione sull'epitelio corneale.
      NOTA: Bisogna fare attenzione a non applicare una pressione eccessiva quando si utilizza la trefina in quanto ciò può causare perforazione corneale. Inoltre, bisogna fare attenzione a posizionare la trefina centralmente. Le pupille possono essere utilizzate come punto di riferimento per individuare il centro della cornea.
    2. Sotto un microscopio sezionante, tenere la mazza da golf smussata spud (vedi Figura 1) a circa 45 ° dalla superficie della cornea all'interno dell'area delimitata con la trefina. Raschiare con cura e continuamente l'epitelio all'interno dell'area delimitata con lo spud per sbrigliare l'epitelio.
      NOTA: Non applicare una forza eccessiva nello sbrigliamento in quanto ciò può anche causare perforazione corneale. Gli occhi dei topi possono asciugarsi durante il processo di ferita, rendendo difficile lo sbrigliamento. In tal caso, applicare PBS sterile sulla superficie oculare per mantenere un'idratazione ottimale.

Figure 1
Figura 1: trefina da 2 mm e spud smussato della mazza da golf. La trefina viene utilizzata per delimitare una regione circolare al centro della cornea e lo spud della mazza da golf viene utilizzato per rimuovere l'epitelio all'interno della regione delimitata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Monitoraggio della chiusura e della riepitelizzazione delle ferite

  1. Pipettare 1-1,5 μL di soluzione di fluoresceina all'1% sulla superficie ferita e visualizzare la cornea utilizzando un microscopio digitale con una sorgente di luce blu.
  2. Acquisire immagini entro il primo minuto di aggiunta di soluzione di fluoresceina per evitare la diffusione all'epitelio circostante che porta a una sovrastima delle dimensioni della ferita. Le cornee ferite vengono fotografate in momenti specifici (cioè 0 h, 12 h, 18 h, 24 h e 30 h) dopo la ferita.
    NOTA: in tutti i momenti, l'imaging viene eseguito in anestesia; ketamina/xilazina viene utilizzato al momento della ferita mentre l'isoflurano viene utilizzato nei punti temporali successivi. I topi sono alloggiati individualmente in gabbie separate per la durata del monitoraggio della chiusura della ferita. Quando alloggiati insieme, i topi tendono a leccare gli occhi del cucciolato, un comportamento che ha dimostrato di influenzare la guarigione delle ferite in diversi tessuti19,20.
  3. Analizza le immagini catturate, tracciando l'area della ferita utilizzando un software di analisi delle immagini. L'area della ferita per ogni punto temporale è espressa come percentuale dell'area della ferita originale a 0 h.

5. Imaging e analisi a immunofluorescenza

  1. Eutanasia dei topi con un metodo approvato dalla IACUC (in questo caso, sovradosaggio di anidride carbonica seguito da lussazione cervicale) nei punti temporali desiderati dopo la ferita.
  2. Raccogli i bulbi oculari premendo delicatamente sul canto laterale per spostare il bulbo oculare usando la forbice curva dell'iride. Guidare le forbici dietro il bulbo oculare per afferrare saldamente il nervo ottico, quindi tagliare il nervo, che consente di rimuovere il bulbo oculare.
  3. Fissare ogni bulbo oculare in 1 mL di 1x PBS contenente il 2% di paraformaldeide per 1 ora a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte in 1 mL di 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
  4. Sotto un microscopio sezionante, utilizzare una lama chirurgica per fare un'incisione nella sclera, circa 500 μm distale al limbus, e quindi tagliare il globo. Usando la pinza, rimuovere delicatamente la materia dell'iride dalla cornea, quindi tagliare con cura il tessuto sclerale, assicurandosi di lasciare intatto il limbus.
  5. Effettuare quattro tagli radiali parziali, ciascuno di circa 1 mm di lunghezza, che si estendono dalla cornea periferica e si fermano a breve distanza dal centro per consentire alla cornea di appiattirsi.
  6. Permeabilizzare e bloccare le cornee in 1 mL di albumina sierica bovina al 2% (BSA) e 0,01% TritonX -100 in 1x PBS per 15 minuti, seguita dal blocco nel 2% di BSA in 1x PBS per ulteriori 45 minuti a temperatura ambiente.
  7. Incubare le cornee durante la notte a 4 °C in un cocktail di anticorpi coniugati con fluorocromo unico direttamente etichettati preparati in 1x PBS contenente il 2% di BSA.
    NOTA: gli anticorpi sono mirati a etichettare cellule e tessuti specifici di interesse. Ad esempio, endotelio, neutrofili e piastrine sono etichettati con anticorpi anti-CD3121,22, anti-Ly-6G 23,24 e anti-CD4125,26, rispettivamente. Il 4',6-diamidino-2-fenilide (DAPI) viene aggiunto al cocktail di anticorpi per visualizzare i nuclei.
  8. Dopo l'incubazione, lavare le cornee tre volte in 1x PBS per 15 minuti ciascuna.
  9. Montare le cornee su un vetrino del microscopio in una goccia di mezzo di montaggio a fluorescenza anti-dissolvenza, coprire con un coperchio e l'immagine con l'ingrandimento desiderato (obiettivo da 4x a 100x) utilizzando un microscopio a luce fluorescenza. Scatta immagini a tutto spessore della cornea in diverse regioni come illustrato nella Figura 2A.
    NOTA: Il modello di analisi microscopica illustrato nella Figura 2A viene utilizzato per analizzare specifici cambiamenti regionali nell'infiammazione e nella divisione cellulare. Sia la colorazione DAPI che Ly-6G vengono utilizzate per identificare i neutrofili extravascolari. Con la colorazione DAPI, i neutrofili sferici hanno un nucleo distinto a forma di ferro di cavallo o ciambella (Figura 2B).

Figure 2
Figura 2: Strategia di imaging corneale e infiltrazione di neutrofili dopo abrasione centrale. (A) Rappresentazione schematica di una cornea integrale che mostra nove campi microscopici attraverso il diametro della cornea. L'area grigia rappresenta l'area della ferita originale. La larghezza di ogni regione è di 500 μm. (B) Si noti la distinta forma a ferro di cavallo o ciambella dei nuclei neutrofili con colorazione DAPI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

La Figura 3 mostra una micrografia elettronica a trasmissione di una ferita corneale creata con lo spud smussato della mazza da golf, dimostrando che la membrana basale epiteliale è effettivamente intatta dopo la lesione.

Figure 3
Figura 3: La membrana basale epiteliale rimane intatta dopo l'abrasione corneale. Micrografia elettronica a trasmissione di una ferita corneale creata con lo spud smussato della mazza da golf. Le punte di freccia puntano alla membrana basale sotto l'epitelio rimanente che circonda la ferita, mentre le frecce puntano alla membrana basale nell'area denudata. Questo mostra la continuità della membrana basale dalle porzioni non abrase a quelle abrase della cornea, dimostrando che la membrana basale viene lasciata intatta dopo lo sbrigliamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo per la ferita corneale è stato utilizzato per caratterizzare ampiamente le dinamiche di guarigione della ferita per una ferita da abrasione epiteliale di 2 mm 27,28,29,30,31,32,33. La capacità di monitorare il tasso di chiusura della ferita e di riepitelizzazione in vivo è una parte centrale di questo modello. Come mostrato nella Figura 4A, l'uso della soluzione di fluoresceina e di un microscopio digitale con una sorgente di luce blu consente la visualizzazione delle dimensioni della ferita. In questo modello, il monitoraggio della chiusura della ferita viene eseguito al momento dell'avvolgimento (0 h), 12 h, 18 h, 24 h e 30 h dopo l'avvolgimento. La figura 4B mostra la cinetica della chiusura della ferita oltre 30 ore. Nei topi C57BL/6 wild-type di 8-12 settimane, la chiusura della ferita e la riepitelizzazione sono in genere complete 24 ore dopo la ferita, come illustrato nella Figura 4B e una risposta infiammatoria ben regolata è fondamentale per una guarigione efficiente delle ferite 34,35,36.

Figure 4
Figura 4: La chiusura della ferita epiteliale è stata valutata utilizzando la colorazione con fluoresceina. (A) Immagini rappresentative della colorazione con fluoresceina della ferita corneale a 0 h, 12 h, 18 h, 24 h e 30 h. In questo modello, la chiusura della ferita è in genere completa 24 ore dopo la ferita. Si noti la mancanza di colorazione verde nella cornea centrale a 24 ore e 30 ore. (B) Cinetica di chiusura della ferita che indica la chiusura completa della ferita entro 24 ore dopo la ferita. Il valore in ogni punto temporale è espresso come percentuale dell'area della ferita originale (cioè l'area della ferita a 0 h) (n ≥ 6). Dati presentati come deviazione media ± standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La risposta infiammatoria alle ferite in questo modello è ben caratterizzata. La ferita da abrasione epiteliale provoca una rapida risposta infiammatoria nella vascolarizzazione limbare corneale caratterizzata principalmente da vasodilatazione, stravaso piastrinico confinato al limbus 37,38,39 e stravaso neutrofilo con migrazione verso il centro della cornea 40. La Figura 5 mostra la vascolarizzazione limbare di una cornea non avvolta con neutrofili extravascolari (Figura 5A) e una cornea ferita con piastrine extravascolari e neutrofili (Figura 5B).

Figure 5
Figura 5: Imaging delle cellule infiammatorie al limbus. Fotomicrografia del limbus corneale che mostra la colorazione per i vasi sanguigni limbari con anticorpo anti-CD31 (mostrato in rosso), neutrofili con anticorpo anti-Ly-6G (mostrato in verde) e piastrine con anticorpo anti-CD41 (mostrato in blu). (A) nessuna abrasione e (B) 30 ore dopo l'abrasione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo modello, l'infiltrazione di neutrofili nella cornea viene valutata in cinque regioni distinte, come illustrato nella Figura 2A. Per determinare queste regioni distinte, viene catturata un'immagine dell'intero monte corneale completo, visualizzando la vascolarizzazione limbare con colorazione anti-CD31. Il bordo più interno della regione limbare su ciascun petalo è contrassegnato usando la vascolarizzazione limbare come guida. La distanza dal bordo più interno della regione limbare da un petalo all'altro nella direzione orizzontale (x) o verticale (y) viene misurata per ogni cornea intera. Per i topi wild-type C57BL/6 di 8-12 settimane, questa distanza è di ~ 3,7 mm. Questa distanza copre le regioni periferiche-periferiche. Il centro dell'intero supporto corneale viene quindi calcolato come il punto corrispondente alla metà del diametro orizzontale o verticale dell'intero monte. La regione paracentrale è 500 μm a sinistra, a destra, su o giù dal centro calcolato. Gli altri campi sono tutti a 500 μm dal campo precedente. Sia la colorazione DAPI che Ly-6G vengono utilizzate per identificare i neutrofili extravascolari. La conta dei neutrofili in ogni regione corneale dei quattro quadranti è mediata ed espressa come neutrofili per campo.

La valutazione piastrinica in questo modello viene eseguita solo al limbus; durante la guarigione delle ferite corneali, le piastrine si estravano e si localizzano al limbus27,37. Il numero totale di piastrine al limbus viene contato e i conteggi sono espressi come piastrine/mm2 dell'area limbare. I conteggi dei quattro petali possono essere totalizzati o mediati.

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Discussion

Lo scopo di questo documento di metodi era quello di descrivere un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello murino è stato utilizzato per studiare l'infiammazione corneale e il suo contributo alla guarigione delle ferite. Questo tipo di modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi di guarigione delle ferite corneali in condizioni fisiologiche normali e in patologie 17,28,29,41,42. Il modello è stato utilizzato per studiare la guarigione delle ferite corneali in condizioni patologiche, come evidenziato da uno studio sulla compromissione della guarigione delle ferite corneali in un modello murino di obesità indotta dalla dieta17. Un netto vantaggio di questo modello è che crea una dimensione esatta (2 mm) riproducibile della ferita epiteliale con una posizione centrale precisa senza violare la membrana basale. Questo modello di ferita corneale è semplice e veloce da eseguire. Oltre alla mazza da golf smussata spud 29,39,43,44,45, alla bava rotante (Algerbrush)38,46,47 e al disco diamantato 32,37,40,48,49,50,51 possono essere utilizzati entrambi per creare la ferita da abrasione in questo modello. Nelle mani di un utente esperto, non vi è alcuna differenza sostanziale nella ferita da abrasione creata da entrambi gli strumenti. Ai fini dell'allenamento e nelle mani di un principiante, è spesso più facile ottenere risultati riproducibili con lo spud smussato della mazza da golf rispetto alla bava rotante e alla lama diamantata. La bava rotante (Algerbrush) richiede un tocco delicato altrimenti la bava rotante può danneggiare la membrana basale epiteliale. Questo è stato riportato anche da altri investigatori 52,53. D'altra parte, lo spud smussato della mazza da golf lascia costantemente intatta la membrana basale epiteliale.

Per riprodurre con successo questo protocollo di ferimento corneale e osservare la successiva riepitelizzazione e dinamica infiammatoria, è necessario utilizzare lo stesso ceppo e la stessa fascia di età del topo e le dimensioni e la profondità della ferita devono essere create come descritto sopra. Le dinamiche e le tempistiche di guarigione delle ferite corneali descritte in questo protocollo sono per il ceppo di topo C57BL /6 e potrebbero non essere condivise se viene utilizzato un ceppo diverso di topo. Pal-Ghosh et al.54 hanno riportato variazioni nella capacità di C57BL/6 e BALB/c di guarire le ferite da debridement epiteliale corneale. Per le stesse dimensioni della ferita corneale, la chiusura della ferita corneale e la riepitelizzazione sono più lente nei topi BALB/c. La tempistica per il completamento della chiusura della ferita e la caratteristica risposta infiammatoria qui descritta sono per una ferita circolare di 2 mm di diametro. Un tempo di completamento della chiusura della ferita più lungo è previsto per i diametri della ferita superiori a 2 mm, mentre un tempo più breve è previsto per i diametri della ferita inferiori a 2 mm. Inoltre, le ferite corneali più grandi, in particolare quelle più vicine al limbus, dovrebbero suscitare una risposta infiammatoria più esagerata, poiché più leucociti vengono reclutati nella cornea16. Ancora più importante, la ferita dovrebbe essere limitata all'epitelio corneale. Le ferite che violano la membrana basale epiteliale o penetrano nello stroma corneale richiedono più tempo per guarire. Queste ferite sono anche associate a una risposta infiammatoria alterata, neovascolarizzazione, formazione di miofibroblasti e cicatrici55,56.

Bisogna fare attenzione in ogni fase per prevenire l'infezione microbica della cornea abrasa. L'infezione microbica altera la risposta infiammatoria e può portare a ulcerazioni, cicatrici e perdita della vista57. Per prevenire l'infezione microbica della ferita, è necessario utilizzare sempre strumenti e soluzioni sterili. Se più topi vengono feriti alla volta, una trefina sterile deve essere usata per ogni topo. Tra un topo e l'altro, lo spud della mazza da golf deve essere lavato in PBS sterile seguito da disinfezione in etanolo al 70% e lavato di nuovo in PBS sterile. Se la ferita viene eseguita su topi aggiuntivi per più giorni, deve essere eseguita alla stessa ora del giorno. Questo per controllare l'effetto circadiano sulla guarigione delle ferite e sull'infiammazione. Nei topi C57BL/6, l'ora del giorno in cui viene prodotta la ferita influisce sul tasso e sulla qualità della guarigione della ferita corneale. Una chiusura più rapida della ferita e una maggiore divisione cellulare si osservano quando i topi sono feriti al mattino rispetto alla ferita nel pomeriggio o nella sera42. L'effetto circadiano sulla guarigione delle ferite è stato riportato in altri tessuti tra cui la pelle58,59. La ferita in questo modello viene sempre eseguita al mattino.

La risposta infiammatoria risultante alle ferite in questo modello procede come una cascata ben caratterizzata di eventi cellulari e molecolari che sono fondamentali per un'efficiente guarigione delle ferite. I giocatori cellulari meglio caratterizzati nell'infiammazione indotta dall'abrasione in questo modello sono neutrofili e piastrine. I neutrofili sono i primi soccorritori al sito di abrasione corneale; livelli significativi di neutrofili vengono rilevati nello stroma corneale entro 6 ore dalla ferita. I neutrofili sono responsabili della rimozione dei detriti cellulari, un processo intrinseco all'infiammazione e alla riparazione delle ferite60. Oltre alle loro attività fagocitiche, i neutrofili contengono fattori di crescita come i fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF)61. Il VEGF è un fattore neuro-rigenerativo cruciale per la rigenerazione dei nervi corneali dopo la ferita 62,63 ed è anche importante per la divisione delle cellule epiteliali corneali45,63. L'infiltrazione dei neutrofili al limbus avviene in due onde con il primo picco a 18 h e il secondo picco a 30 h dopo aver ferito40. Utilizzando topi neutropenici37,40, lo stravaso neutrofilo e la successiva migrazione al centro della cornea hanno dimostrato di essere cruciali per la guarigione delle ferite corneali. Sebbene tradizionalmente noto per essere fondamentale nel mantenimento dell'emostasi e della coagulazione del sangue, le piastrine hanno anche un ruolo chiave riconosciuto nella guarigione delle ferite corneali37. Le piastrine contengono numerosi mediatori che contribuiscono all'infiammazione e alla risoluzione dei tessuti64,65. Nei topi con trombocitopenia, questo modello è stato utilizzato per dimostrare che le piastrine sono importanti per un'efficiente guarigione delle ferite corneali37.

Sebbene i neutrofili e le piastrine siano le cellule meglio caratterizzate in questo modello, anche le cellule immunitarie come le cellule T gamma delta, le cellule natural killer e le cellule dendritiche hanno dimostrato di essere coinvolte nella risposta immunitaria alle ferite utilizzando questo modello27,48. Sono stati riportati stravasi di cellule natural killer nello stroma 28,29 e migrazione delle cellule T gamma delta nell'epitelio di guarigione27. Questo modello è stato utilizzato anche per identificare le molecole di adesione chiave per lo stravaso delle cellule immunitarie durante la guarigione delle ferite corneali. L'antigene-1 della funzione linfocitaria (LFA-1)32, CD1851 e la molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1)47,49 hanno tutti dimostrato di essere cruciali per lo stravaso dei neutrofili e l'efficiente guarigione delle ferite corneali utilizzando questo modello. La divisione cellulare epiteliale in risposta alla ferita, che è fondamentale per la ri-stratificazione epiteliale dopo la chiusura della ferita, viene valutata utilizzando figure mitotiche. La condensazione cromosomica durante le diverse fasi della divisione cellulare conferisce ai nuclei un aspetto caratteristico noto come figura mitotica. La colorazione DAPI del nucleo consente la visualizzazione di queste figure mitotiche.

Il modello di ferita da abrasione corneale del topo ha dimostrato di essere notevolmente riproducibile e ha fornito una notevole comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che contribuiscono a un'efficiente guarigione delle ferite. Tuttavia, vale la pena notare che ci sono limitazioni al modello per quanto riguarda la sua applicabilità clinica. Il modello e i suoi risultati sono applicabili solo alle abrasioni epiteliali semplici e non penetranti. Come notato in precedenza, le lesioni corneali derivanti da ferite penetranti causate da insulti fisici o chimici provocheranno diverse cinetiche e risultati di guarigione della ferita, in particolare se la ferita viene infettata come accade spesso nel caso di lesioni alla cornea umana. Detto questo, il modello di ferita da abrasione corneale del topo fornisce una base eccellente per lo studio dei principi fondamentali dell'infiammazione che modulano la guarigione delle ferite corneali.

Il protocollo di ferimento corneale qui descritto è semplice e facilmente riproducibile. Fornisce uno strumento utile per indagare domande fondamentali sul processo di guarigione delle ferite corneali e sulla sua risposta infiammatoria associata. Il suo potenziale per aiutare a comprendere le patologie corneali associate alle complicanze della guarigione delle ferite è solo l'inizio.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Finanziamento: Supportato da: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. e R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) e Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o di Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

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Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali
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Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

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