Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En epitelal slitasje modell for å studere hornhinnen sår healing

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Her beskrives en protokoll for å skape et sentralt hornhinnen epitelisk slitasjesår i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. Denne hornhinnen sår healing modellen er svært reproduserbar og blir nå brukt til å evaluere kompromittert hornhinnen sår healing i sammenheng med sykdommer.

Abstract

Hornhinnen er kritisk for synet, og står for omtrent to tredjedeler av øyets brytningskraft. Avgjørende for hornhinnens rolle i visjonen er dens gjennomsiktighet. På grunn av sin ytre posisjon er hornhinnen imidlertid svært utsatt for et bredt spekter av skader som kan føre til tap av hornhinnens gjennomsiktighet og eventuell blindhet. Effektiv hornhinnen sår healing som svar på disse skadene er avgjørende for å opprettholde hornhinnen homeostase og bevaring av hornhinnen gjennomsiktighet og brytning evner. I tilfeller av kompromittert hornhinnen sår healing, hornhinnen blir sårbar for infeksjoner, sårdannelser, og arrdannelse. Gitt den grunnleggende betydningen av hornhinnen sår healing til bevaring av hornhinnen åpenhet og syn, en bedre forståelse av den normale hornhinnen sår healing prosessen er en forutsetning for å forstå svekket hornhinnen sår healing forbundet med infeksjon og sykdom. Mot dette målet har murine modeller av hornhinnen sår vist seg nyttig for å fremme vår forståelse av hornhinnen sår healing mekanismer som opererer under normale fysiologiske forhold. Her beskrives en protokoll for å skape en sentral hornhinnen epitelal slitasje i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. I denne modellen brukes en 2 mm diameter sirkulær trefin, sentrert over hornhinnen, til å avgrense sårområdet. Golfklubben spud brukes med forsiktighet til å debride epitelet og skape et sirkulært sår uten å skade hornhinnen epitelial kjellermembran. Den resulterende inflammatoriske responsen fortsetter som en godt karakterisert kaskade av cellulære og molekylære hendelser som er kritiske for effektiv sårheling. Denne enkle hornhinnen sår healing modellen er svært reproduserbar og godt publisert og blir nå brukt til å evaluere kompromittert hornhinnen sår healing i sammenheng med sykdom.

Introduction

Hornhinnen er den gjennomsiktige fremre en tredjedel av øyet. Hornhinnen tjener flere funksjoner, inkludert å beskytte øyets indre strukturer og danne en strukturell barriere som beskytter øyet mot infeksjoner1. Enda viktigere er at hornhinnen er kritisk for synet, og gir omtrent to tredjedeler av øyets brytningskraft 2,3. Avgjørende for hornhinnens rolle i visjonen er dens gjennomsiktighet. På grunn av sin ytre posisjon er hornhinnen imidlertid utsatt for et bredt spekter av skader på daglig basis som kan føre til forstyrrelse av barrierefunksjonen, tap av gjennomsiktighet og eventuell blindhet. Tap av hornhinnen åpenhet er en ledende årsak til synshemming over hele verden 4,5. Hornhinnens slitasje er en vanlig årsak til besøk på akuttmottaket (ER), som står for halvparten av de øyerelaterte tilfellene som presenteres på ER6. Over 1 million individer anslås å lide av øyerelaterte skader årlig i USA7. Effektiv hornhinnen sår healing som svar på disse skadene er avgjørende for å opprettholde hornhinnen homeostase og bevaring av sin åpenhet og brytning evner. I tilfeller av kompromittert hornhinnen sår healing, hornhinnen blir sårbar for infeksjoner, sårdannelser, ogarrdannelse 8,9. Også den økende populariteten til brytning operasjoner plasserer en unik traumatisk utfordring på hornhinnen10. Gitt den grunnleggende betydningen av hornhinnen sår healing til bevaring av hornhinnen åpenhet og syn, en bedre forståelse av den normale hornhinnen sår healing prosessen er en forutsetning for å forstå svekket hornhinnen sår healing forbundet med infeksjon og sykdom.

For det formål har flere dyremodeller av hornhinnen sårheling blitt utviklet 11,12,13,14,15. Murine modeller av hornhinnen sår healing har vist seg nyttig i å fremme vår forståelse av hornhinnen sår healing mekanismer opererer under normale fysiologiske forhold. Ulike typer hornhinnen sår har vært ansatt i å studere hornhinnen sår healing, hver egnet for å undersøke ulike aspekter av sår healing prosessen. De vanligste typene sårmodeller som brukes i hornhinnen sårhelingsstudier er de mekaniske og kjemiske sårmodellene. Kjemiske hornhinnen sår, for det meste involverer etableringen av alkaliske brannskader på hornhinnen, er nyttige for å studere hornhinnen sår, opacification, og neovascularization13. Mekaniske hornhinnen sår involverer debridement (slitasje) sår og keratectomy sår 14,15,16. En intakt eller brutt hornhinnen epitelial kjellermembran definerer henholdsvis debridement og keratectomy sår. I debridement sår forblir den epiteliale kjellermembranen intakt, mens kjellermembranen i keratektomi sår brytes med penetrasjon for det meste inn i det fremre stromaet. Debridement sår er mest nyttige for å studere re-epitelialisering, epitelcelleproliferasjon, immunrespons og nerveregenerering etter hornhinnen sår. Keratectomy sår, derimot, er mest nyttige for å studere hornhinnenarrdannelse 14,15.

Her beskrives en protokoll for å skape et sentralt hornhinnen epitelisk slitasjesår i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. Denne enkle hornhinnen sår healing modellen er svært reproduserbar og godt publisert og blir nå brukt til å evaluere kompromittert hornhinnen sår healing i sammenheng med sykdom17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved University of Houston og Baylor College of Medicine. Retningslinjene som er skissert i Arvo-erklæringen (Association for Research in Vision and Ophthalmology) om bruk av dyr i syn og oftalmisk forskning, ble fulgt i håndtering og bruk av musene.

1. Forberedelse

  1. Fremstilling av fluoresceinoppløsning
    1. Forbered 1% fluoresceinoppløsning ved å oppløse 10 mg natriumfluoresceinsalt i 1 ml steril saltvann eller steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
      MERK: Forbered natriumfluoresceinoppløsning på bruksdagen eller en dag før for å unngå mikrobiell forurensning. Oppbevar fluoresceinoppløsningen ved 4 °C når den tilberedes en dag før bruk, vekk fra lyset. Pakk rørene med aluminiumsfolie for å forhindre fotobleking.
    2. Del løsningen i aliquots egnet for bruk i et enkelt eksperiment. 1-1,5 μL fluoresceinoppløsning brukes per mus per gang. Bruk følgende formel til å beregne volumet av aliquot som passer for ett enkelt eksperiment:
      Equation 1
      MERK: For eksempel, hvis seks mus studeres i et enkelt eksperiment med sårstørrelse overvåket på fem tidspunkter, vil volumet av aliquot egnet for det ene eksperimentet være:
      Equation 2
  2. Tilberedning av ketamin/xylazincocktail for anestesi av mus.
    1. For å tilberede 10 ml cocktail blander du 2,0 ml ketamin (100 mg/ml) med 1,0 ml xylazin (20 mg/ml), og tilsett 7,0 ml steril PBS. Forbered ketamin/xylazincocktail en dag før eller på operasjonsdagen.
      MERK: Alle løsninger skal brukes ved romtemperatur med mindre annet er oppgitt.

2. Anestesi

  1. Vei musen (8-12 uker gamle C57BL/ 6 wildtype mus) for å bestemme riktig mengde bedøvelse å administrere. Bruk den tohånds musebeherskelsesteknikken for å begrense og håndtere mus til injeksjon av bedøvelse18. Administrer ketamin/xylazincocktail intraperitonealt (dvs.) ved en endelig konsentrasjon på 80 mg/kg ketamin og 8 mg/kg xylazin.
  2. Vent til fullstendig anestesi oppnås før du utfører hornhinnen sår på musen. Evaluer dybden av anestesi ved å vurdere pedalrefleksen etter tåklemme. Når tilstrekkelig anestesi oppnås, bør musen ikke bevege seg på tåklemme.
    MERK: Fordi mus raskt mister kroppsvarme under anestesi, er det viktig å gi en varmekilde for mus for å forhindre hypotermi. Plasser mus på en varmekilde (varmepute) under anestesi- og gjenopprettingsstadier.

3. Opprettelse av hornhinnen sår

  1. Sår bare høyre eller venstre øye. Oppretthold konsistens med øyet (dvs. venstre eller høyre) som er såret når du beveger deg fra mus til mus.
    MERK: Fordi slitasje skader hornhinnens nerver og reduserer skarphet, kan såring av begge øynene forårsake betydelig ubehag og svekkelse. Siden smertestillende midler har potensial til å undertrykke inflammatoriske responser, kan deres bruk være en forvirrer i visse eksperimenter med sikte på å forstå hornhinnebetennelse. Unngå smertestillende midler i hornhinnen sår eksperimenter ble godkjent av vår Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
  2. For å skape epitelkornsår
    1. Under et dissekeringsmikroskop bruker du trefin med diameter på 2 mm (se figur 1) til å avgrense midten av hornhinnen, slik at øyet holdes åpent ved hjelp av tommelen og pekefingeren for å holde øyelokkene. Skyv forsiktig trefinen for å gjøre inntrykk på hornhinnen epitel.
      MERK: Det må utvises forsiktighet for ikke å påføre for høyt trykk når du bruker trefinen, da dette kan føre til hornhinnen perforering. Det må også tas hensyn til å plassere trefinen sentralt. Elevene kan brukes som et landemerke for å finne sentrum av hornhinnen.
    2. Under et dissekerende mikroskop holder du den stumpe golfklubben spud (se figur 1) på omtrent 45° fra overflaten av hornhinnen i området avgrenset med trefinen. Skrap epitelet forsiktig og kontinuerlig innenfor det avgrensede området med spydet for å debride epitelet.
      MERK: Ikke bruk overdreven kraft i debridement, da det også kan forårsake hornhinnen perforering. Musens øyne kan tørke opp under sårprosessen, noe som gjør debridement vanskelig. I et slikt tilfelle, bruk steril PBS på okulær overflate for å opprettholde optimal hydrering.

Figure 1
Figur 1: 2 mm trefin og stump golfklubb spud. Trefinen brukes til å avgrense en sirkulær region ved hornhinnesenteret, og golfklubben spud brukes til å fjerne epitelet i den avgrensede regionen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Overvåking av sårlukking og re-epithelialisering

  1. Pipette 1-1,5 μL 1% fluoresceinoppløsning på den sårede overflaten og bilde hornhinnen ved hjelp av et digitalt mikroskop med en blå lyskilde.
  2. Skaff bilder i løpet av det første minuttet av fluorescein løsning tillegg for å unngå spredning til omkringliggende epitel som fører til overestimering av sårstørrelse. Sårede hornhinnen er avbildet på bestemte tidspunkter (dvs. 0 h, 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer) etter såring.
    MERK: Til enhver tid utføres avbildning under anestesi; ketamin/xylazin brukes på tidspunktet for såring mens isofluran brukes ved senere tidspunkter. Mus er plassert individuelt i separate bur for varigheten av sårlukkingsovervåking. Når de er plassert sammen, har mus en tendens til å slikke kullkameratens øyne, en oppførsel som har vist seg å påvirke sårheling i forskjellige vev19,20.
  3. Analyser innspilte bilder, spor sårområde ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Sårområdet for hvert tidspunkt uttrykkes som en prosentandel av det opprinnelige sårområdet ved 0 h.

5. Immunfluorescence avbildning og analyse

  1. Avlive mus ved hjelp av en IACUC-godkjent metode (i dette tilfellet karbondioksidoverdose etterfulgt av cervical dislokasjon) på ønskede tidspunkter etter såring.
  2. Høst øyeeplene ved å trykke forsiktig på lateralkanthus for å fortrenge øyebollet ved hjelp av iris buet saks. Før saksen bak øyebollet for å ta godt tak i synsnerven, og kutt deretter nerven, noe som gjør at øyebollet kan fjernes.
  3. Fest hvert øyeboll i 1 ml 1x PBS som inneholder 2% paraformaldehyd i 1 time ved romtemperatur, og vask deretter tre ganger i 1 ml 1x PBS i 5 minutter hver.
  4. Under et dissekerende mikroskop, bruk et kirurgisk blad for å gjøre et snitt i sclera, ca 500 μm distal til limbus, og deretter kutte gjennom kloden. Bruk tang, fjern forsiktig irismaterialet fra hornhinnen, og trim deretter forsiktig scleralvevet bort, og sørg for å la limbusen være intakt.
  5. Lag fire delvise radiale kutt, hver ca 1 mm i lengde, som strekker seg fra perifer hornhinnen og stopper kort av midten for å la hornhinnen flate ut.
  6. Permeabiliser og blokker hornhinner i 1 ml 2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,01% TritonX -100 i 1x PBS i 15 minutter etterfulgt av blokkering i 2% BSA i 1x PBS i ytterligere 45 minutter ved romtemperatur.
  7. Inkuber hornhinner over natten ved 4 °C i en cocktail av direkte merkede unike fluorokromkonjugerte antistoffer tilberedt i 1x PBS som inneholder 2 % BSA.
    MERK: Antistoffer er rettet mot å merke bestemte celler og vev av interesse. For eksempel er endotel, nøytrofiler og blodplater merket med henholdsvis anti-CD3121,22, anti-Ly-6G23,24 og anti-CD4125,26 antistoffer. 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) legges til antistoffcocktailen for å visualisere kjerner.
  8. Etter inkubasjon, vask hornhinnen tre ganger i 1x PBS i 15 min hver.
  9. Monter hornhinner på et mikroskop lysbilde i en dråpe anti-fade fluorescens montering medium, deksel med en coverlip, og bilde med ønsket forstørrelse (4x til 100x mål) ved hjelp av en fluorescens lys mikroskop. Ta bilder i full tykkelse av hornhinnen på tvers av forskjellige regioner, som vist i figur 2A.
    MERK: Mønsteret for mikroskopisk analyse illustrert i figur 2A brukes til å analysere spesifikke regionale endringer i betennelse og celledeling. Både DAPI- og Ly-6G-farging brukes til å identifisere de ekstravaskulære nøytrofiler. Med DAPI-farging har sfæriske nøytrofiler en distinkt hestesko eller smultringformet kjerne (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Corneal imaging strategi og nøytrofil infiltrasjon etter sentral slitasje. (A) Skjematisk representasjon av en hornhinne helemount viser ni mikroskopiske felt over diameteren av hornhinnen. Det grå området representerer det opprinnelige sårområdet. Bredden på hver region er 500 μm. (B) Legg merke til den distinkte hestesko- eller smultringformen av nøytrofile kjerner med DAPI-farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser en transmisjonselektronmikrograf av et hornhinnesår opprettet med den stumpe golfklubben spud, som viser at epitelets kjellermembran faktisk er intakt etter skade.

Figure 3
Figur 3: Epitelial kjellermembran forblir intakt etter hornhinnens slitasje. Overføring elektronmikrograf av et hornhinnen sår opprettet med den stumpe golfklubb spud. Pilspissene peker mot kjellermembranen under det gjenværende epitelet rundt såret, mens pilene peker mot kjellermembranen i det denuderte området. Dette viser kontinuiteten i kjellermembranen fra de uforbeførte til de slipte delene av hornhinnen, noe som viser at kjellermembranen forlater intakt etter debridement. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne protokollen for hornhinnen sår har blitt brukt til å omfattende karakterisere sår healing dynamikken for en 2 mm epitelal slitasje sår 27,28,29,30,31,32,33. Evnen til å overvåke hastigheten på sårlukking og re-epithelialisering in vivo er en sentral del av denne modellen. Som vist i figur 4A, muliggjør bruk av fluoresceinløsning og et digitalt mikroskop med en blå lyskilde visualisering av sårstørrelsen. I denne modellen utføres overvåking av lukking av sår på tidspunktet for såring (0 t), 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer etter såring. Figur 4B viser kinetikken ved sårlukking over 30 timer. I 8-12 uker gamle C57BL/6 villtype mus er sårlukking og re-epitelialisering vanligvis fullført 24 timer etter såring som illustrert i figur 4B, og en velregulert inflammatorisk respons er grunnleggende for effektiv sårtilheling 34,35,36.

Figure 4
Figur 4: Epitelial sårlukking ble evaluert ved hjelp av fluoresceinfarging. (A) Representative bilder av fluoresceinfarging av hornhinnens sår ved 0 t, 12 timer, 18 timer, 24 timer og 30 timer. I denne modellen er sårlukking vanligvis fullført 24 timer etter såring. Legg merke til mangelen på grønn farging i den sentrale hornhinnen ved 24 timer og 30 h. (B) Sårlukking kinetikk som indikerer fullstendig sårlukking med 24 timer etter sår. Verdi ved hvert tidspunkt uttrykkes som en prosentandel av det opprinnelige sårområdet (dvs. sårområde ved 0 t) (n ≥ 6). Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den inflammatoriske responsen på såring i denne modellen er godt karakterisert. Det epitelale slipesår fremkaller en rask inflammatorisk respons i hornhinnens limbal vaskulatur hovedsakelig preget av vasodilatasjon, blodplate ekstravasasjon begrenset til limbus 37,38,39 og nøytrofil ekstravasasjon med migrasjon mot midten av hornhinnen40. Figur 5 viser den lembale vaskulaturen til en viklet hornhinne med ekstravaskulære nøytrofiler (figur 5A) og en såret hornhinne med ekstravaskulære blodplater og nøytrofiler (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: Inflammatorisk celleavbildning ved limbussen. Fotomikrograf av hornhinnen limbus viser farging for limbal blodårene med anti-CD31 antistoff (vist i rødt), nøytrofiler med anti-Ly-6G antistoff (vist i grønt), og blodplater med anti-CD41 antistoff (vist i blått). (A) ingen slitasje og (B) 30 timer etter slitasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I denne modellen vurderes nøytrofil infiltrasjon i hornhinnen på tvers av fem forskjellige regioner som illustrert i figur 2A. For å bestemme disse forskjellige områdene, blir et bilde av hele hornhinnen hele fjorden fanget, og visualiserer limbal vaskulaturen med anti-CD31 farging. Den innerste kanten av limbalområdet på hvert kronblad er merket med limbal vaskulatur som guide. Avstanden fra den innerste kanten av limbalområdet fra ett kronblad til det andre i horisontal (x) eller vertikal (y) retning måles for hver hornhinne hele. For 8-12 uker gamle C57BL/6 wild-type mus er denne avstanden ~ 3,7 mm. Denne avstanden dekker perifere til eksterne områder. Midten av hornhinnen helmount beregnes deretter som punktet som tilsvarer halvparten av den horisontale eller vertikale diameteren på hele demonteren. Paracentralområdet er 500 μm venstre, høyre, opp eller ned fra det beregnede senteret. De andre feltene er alle 500 μm fra forrige felt. Både DAPI- og Ly-6G-farging brukes til å identifisere de ekstravaskulære nøytrofiler. Nøytrofil teller i hver hornhinneregion fra de fire kvadrantene er i gjennomsnitt og uttrykt som nøytrofiler per felt.

Blodplatevurdering i denne modellen utføres kun på limbus; under hornhinnen sår healing, blodplater ekstravasate og lokalisere til limbus27,37. Totalt antall blodplater på limbussen telles, og tellinger uttrykkes som blodplater/ mm2 av limbalområdet. Tellingene fra de fire kronbladene kan summeres eller beregnes i gjennomsnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hensikten med dette metodepapiret var å beskrive en protokoll for å skape et sentralt hornhinnen epitelisk slitasje sår i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. Denne murinmodellen har blitt brukt til å studere hornhinnebetennelse og dets bidrag til sårheling. Denne typen modell kan brukes til å studere hornhinnen sår healing mekanismer under normale fysiologiske forhold og i patologier 17,28,29,41,42. Modellen har blitt brukt til å undersøke hornhinnen sår healing under patologiske forhold som det fremgår av en studie på svekket hornhinnen sår healing i en mus modell av diett-indusert fedme17. En klar fordel med denne modellen er at den skaper en nøyaktig (2 mm) reproduserbar epitel sårstørrelse med en presis sentral beliggenhet uten å bryte kjellermembranen. Denne modellen av hornhinnen sår er grei og rask å utføre. I tillegg til den stumpe golfklubben spud 29,39,43,44,45, den roterende burr (Algerbrush)38,46,47, og diamantblad 32,37,40,48,49,50,51 kan begge brukes til å lage slipesår i denne modellen. I hendene på en erfaren bruker er det ingen vesentlig forskjell i slipesår skapt av noen av verktøyene. For treningsformål og i hendene på en nybegynner er det ofte lettere å oppnå reproduserbare resultater med den stumpe golfklubben spud sammenlignet med den roterende burr og diamantblad. Den roterende burr (Algerbrush) krever en delikat berøring ellers kan den roterende burr skade epitelial kjellermembranen. Dette er også rapportert av andre etterforskere52,53. På den annen side forlater den stumpe golfklubben spud konsekvent epitelets kjellermembran intakt.

For å lykkes med å reprodusere denne hornhinnen sårprotokollen og observere den etterfølgende re-epithelialisering og betennelsesdynamikk, må samme belastning og aldersgruppe av musen brukes, og sårets størrelse og dybde må opprettes som beskrevet ovenfor. Hornhinnen sår healing dynamikken og tidslinjer beskrevet i denne protokollen er for C57BL/6 musestammen og kan ikke deles hvis en annen stamme av musen brukes. Pal-Ghosh et al.54 rapporterte variasjoner i evnen til C57BL/6 og BALB/c til å helbrede hornhinnen epitelial debridement sår. For samme hornhinnen sår størrelse, hornhinnen sår lukking og re-epitelialisering er langsommere i BALB / c mus. Tidslinjen for ferdigstillelse av sårlukking og den karakteristiske inflammatoriske responsen som er beskrevet her, er for et sirkulært sår med 2 mm diameter størrelse. Det forventes en lengre fullføringstid for sårdiametere som er større enn 2 mm, mens det forventes kortere tid for sårdiametere under 2 mm. Også større hornhinnen sår, spesielt de nærmere limbus, forventes å fremkalle en mer overdrevet inflammatorisk respons, som flere leukocytter rekrutteres inn i hornhinnen16. Enda viktigere, såret bør begrenses til hornhinnen epitel. Sår som bryter epitelial kjellermembranen eller penetrerer hornhinnen stroma tar lengre tid å helbrede. Disse sårene er også forbundet med en endret inflammatorisk respons, neovascularization, myofibroblast formasjon ogarrdannelse 55,56.

Det må utvises forsiktighet i hvert trinn for å forhindre mikrobiell infeksjon i den slipte hornhinnen. Mikrobiell infeksjon endrer den inflammatoriske responsen og kan føre til sårdannelser, arrdannelse og synstap57. For å forhindre mikrobiell infeksjon av såret, bør sterile verktøy og løsninger alltid brukes. Hvis flere mus blir såret om gangen, bør en steril trefin brukes til hver mus. Mellom musene skal golfklubbspud vaskes i steril PBS etterfulgt av desinfeksjon i 70% etanol og vaskes igjen i steril PBS. Hvis sår utføres på flere mus over flere dager, bør det utføres samtidig på dagen. Dette er for å kontrollere den sirkadiske effekten på sårheling og betennelse. I C57BL / 6 mus påvirker tidspunktet på dagen da såret er laget, hastigheten og kvaliteten på hornhinnens sårheling. Raskere sårlukking og større celledeling observeres når mus blir såret om morgenen sammenlignet med sår om ettermiddagen eller kvelden42. Den sirkadiske effekten på sårheling er rapportert i andre vev, inkludert huden 58,59. Sår i denne modellen utføres alltid om morgenen.

Den resulterende inflammatoriske responsen på såring i denne modellen fortsetter som en godt karakterisert kaskade av cellulære og molekylære hendelser som er kritiske for effektiv sårheling. De best karakteriserte cellulære spillerne i den slitasjeinduserte betennelsen i denne modellen er nøytrofiler og blodplater. Nøytrofiler er de første respondere på stedet for hornhinnen slitasje; betydelige nivåer av nøytrofiler oppdages i hornhinnen stroma innen 6 timer etter sår. Nøytrofiler er ansvarlige for rydding av cellerester, en prosess som er iboende i betennelse og sårreparasjon60. I tillegg til deres fagocytiske aktiviteter inneholder nøytrofiler vekstfaktorer som vaskulære endotelvekstfaktorer (VEGF)61. VEGF er en avgjørende nevroregenereringsfaktor for hornhinnens nerver regenerering etter såring62,63 og er også viktig for hornhinnen epitelcelle divisjon45,63. Nøytrofiltrasjon ved limbussen forekommer i to bølger med den første toppen på 18 timer og den andre toppen på 30 timer etter såring40. Ved hjelp av nøytropeniske mus37,40, nøytrofil ekstravasasjon og påfølgende migrasjon til sentrum av hornhinnen har vist seg å være avgjørende for hornhinnen sår healing. Selv om det tradisjonelt er kjent for å være avgjørende for vedlikehold av hemostase og blodpropp, har blodplater også en anerkjent nøkkelrolle i hornhinnen sårheling37. Blodplater inneholder mange mediatorer som bidrar til betennelse og vevsoppløsning64,65. Hos mus med trombocytopeni har denne modellen blitt brukt til å vise at blodplater er viktige for effektiv hornhinnen sårheling37.

Selv om nøytrofiler og blodplater er de best karakteriserte cellene i denne modellen, har immunceller som gamma delta T-celler, naturlige morderceller og dendrittiske celler også vist seg å være involvert i immunresponsen mot såring ved hjelp av denne modellen27,48. Naturlig killer celle ekstravasasjon i stroma28,29 og migrasjon av gamma delta T celler inn i healing epitel27 har blitt rapportert. Denne modellen har også blitt brukt til å identifisere vedheft molekyler nøkkelen til immuncelle ekstravasasjon under hornhinnen sår healing. Lymfocyttfunksjon antigen-1 (LFA-1)32, CD1851 og intercellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1)47,49 har alle vist seg å være avgjørende for nøytrofil ekstravasasjon og effektiv hornhinne sårheling ved hjelp av denne modellen. Epitelial celledeling som svar på sår, noe som er kritisk for epitelial re-stratifisering etter sårlukking vurderes ved hjelp av mititotiske figurer. Kromosomal kondensering i ulike stadier av celledeling gir kjernen et karakteristisk utseende kjent som en mititotisk figur. DAPI-farging av kjernen muliggjør visualisering av disse mititotiske figurene.

Mus hornhinnen slitasje sår modellen har vist seg å være bemerkelsesverdig reproduserbar og gitt betydelig innsikt i cellulære og molekylære mekanismer som bidrar til effektiv sårheling. Det er imidlertid verdt å merke seg at det er begrensninger i modellen med hensyn til dens kliniske anvendbarhet. Modellen og dens resultater gjelder bare for enkle, ikke-gjennomtrengende epitelale slitasje. Som nevnt tidligere, hornhinnen skader som følge av gjennomtrengende sår forårsaket av fysisk eller kjemisk fornærmelse vil fremkalle ulike sår healing kinetikk og utfall, spesielt hvis såret blir smittet som oppstår ofte i tilfelle skader på den menneskelige hornhinnen. Når det er sagt, gir mus hornhinnen slitasje sår modell et utmerket grunnlag for å studere grunnleggende prinsipper for betennelse som modulerer hornhinnen sår healing.

Hornhinnen sår protokollen beskrevet her er grei og lett reprodusert. Det gir et nyttig verktøy for å undersøke grunnleggende spørsmål om hornhinnen sår healing prosessen og dens tilhørende inflammatorisk respons. Dens potensial til å hjelpe til med å forstå hornhinnen patologier forbundet med sårheling komplikasjoner er bare begynnelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støtte: Støttet av: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., og R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) og Sigma Xi Grant i Aid of Research (P.K.A.). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til National Institutes of Health, eller Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Medisin Utgave 178 hornhinnen sårheling slitasje golfklubb spud trefin
En epitelal slitasje modell for å studere hornhinnen sår healing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter