Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Модель истирания эпителия для изучения заживления ран роговицы

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Здесь описан протокол создания центральной эпителиальной абразивной раны роговицы у мыши с помощью трефина и тупой клюшки для гольфа. Эта модель заживления ран роговицы обладает высокой воспроизводимостью и в настоящее время используется для оценки скомпрометированного заживления ран роговицы в контексте заболеваний.

Abstract

Роговица имеет решающее значение для зрения, составляя около двух третей преломляющей силы глаза. Решающее значение для роли роговицы в видении имеет ее прозрачность. Однако из-за своего внешнего положения роговица очень восприимчива к широкому спектру травм, которые могут привести к потере прозрачности роговицы и возможной слепоте. Эффективное заживление ран роговицы в ответ на эти травмы имеет решающее значение для поддержания гомеостаза роговицы и сохранения прозрачности роговицы и преломляющей способности. В случаях скомпрометированного заживления раны роговицы роговица становится уязвимой для инфекций, изъязвлений и рубцевания. Учитывая фундаментальную важность заживления ран роговицы для сохранения прозрачности и зрения роговицы, лучшее понимание нормального процесса заживления ран роговицы является необходимым условием для понимания нарушения заживления ран роговицы, связанного с инфекцией и болезнями. Для достижения этой цели мышиные модели ранения роговицы оказались полезными для дальнейшего понимания механизмов заживления ран роговицы, работающих в нормальных физиологических условиях. Здесь описан протокол создания центрального эпителия роговицы у мыши с помощью трефина и тупого клюшки для гольфа. В этой модели круглый трефин диаметром 2 мм, центрированный над роговицей, используется для разграничения области раны. Клюшка для гольфа используется с осторожностью для дебриции эпителия и создания круговой раны, не повреждая эпителиальную базальную мембрану роговицы. Результирующая воспалительная реакция протекает как хорошо охарактеризованный каскад клеточных и молекулярных событий, которые имеют решающее значение для эффективного заживления ран. Эта простая модель заживления ран роговицы обладает высокой воспроизводимостью и хорошо публикуется и в настоящее время используется для оценки скомпрометированного заживления ран роговицы в контексте заболевания.

Introduction

Роговица представляет собой прозрачную переднюю треть глаза. Роговица выполняет несколько функций, включая защиту внутренних структур глаза и формирование структурного барьера, который защищает глаз от инфекций1. Что еще более важно, роговица имеет решающее значение для зрения, обеспечивая около двух третей преломляющей силы глаза 2,3. Решающее значение для роли роговицы в видении имеет ее прозрачность. Однако из-за своего внешнего положения роговица ежедневно подвергается широкому спектру травм, которые могут привести к нарушению ее барьерной функции, потере прозрачности и возможной слепоте. Потеря прозрачности роговицы является основной причиной нарушения зрения во всем мире 4,5. Ссадины роговицы являются распространенной причиной посещений отделения неотложной помощи (ER), на которые приходится половина случаев, связанных с глазами, представленных в ER6. По оценкам, более 1 миллиона человек ежегодно страдают от травм глаз в Соединенных Штатах7. Эффективное заживление ран роговицы в ответ на эти травмы имеет решающее значение для поддержания гомеостаза роговицы и сохранения ее прозрачности и преломляющих способностей. В случае скомпрометированного заживления раны роговицы роговица становится уязвимой для инфекций, изъязвлений и рубцевания 8,9. Кроме того, растущая популярность рефракционных операций ставит уникальную травматическую проблему на роговицу10. Учитывая фундаментальную важность заживления ран роговицы для сохранения прозрачности и зрения роговицы, лучшее понимание нормального процесса заживления ран роговицы является необходимым условием для понимания нарушения заживления ран роговицы, связанного с инфекцией и болезнями.

С этой целью было разработано несколько животных моделей заживления ран роговицы 11,12,13,14,15. Мышиные модели заживления ран роговицы оказались полезными в дальнейшем понимании механизмов заживления ран роговицы, работающих в нормальных физиологических условиях. Различные типы ран роговицы были использованы при изучении заживления ран роговицы, каждый из которых подходит для изучения различных аспектов процесса заживления ран. Наиболее распространенными типами моделей ран, используемых в исследованиях заживления ран роговицы, являются механические и химические модели ран. Химические раны роговицы, в основном связанные с созданием щелочных ожогов на роговице, полезны для изучения язв роговицы, помутнения и неоваскуляризации13. Механические раны роговицы включают санацию (истирание) ран и кератэктомию ран 14,15,16. Неповрежденная или нарушенная эпителиальная базальная мембрана роговицы определяет санацию и кератэктомию ран соответственно. В санационных ранах эпителиальная базальная мембрана остается неповрежденной, в то время как при кератэктомии раны базальная мембрана нарушается с проникновением в основном в переднюю строму. Раны санации наиболее полезны для изучения реэпителизации, пролиферации эпителиальных клеток, иммунного ответа и регенерации нервов после ранения роговицы. Раны кератэктомии, с другой стороны, наиболее полезны для изучения рубцевания роговицы14,15.

Здесь описан протокол создания центральной эпителиальной абразивной раны роговицы у мыши с помощью трефина и тупой клюшки для гольфа. Эта простая модель заживления ран роговицы обладает высокой воспроизводимостью и хорошо публикуется и в настоящее время используется для оценки скомпрометированного заживления ран роговицы в контексте заболевания17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы для животных были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию в Университете Хьюстона и Медицинском колледже Бейлора. Руководящие принципы, изложенные в заявлении Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в зрении и офтальмологических исследованиях, были соблюдены при обращении и использовании мышей.

1. Подготовка

  1. Приготовление раствора флуоресцеина
    1. Готовят 1% раствор флуоресцеина, растворяя 10 мг натриевой флуоресцеиновой соли в 1 мл стерильного физиологического раствора или стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор флуоресцеина натрия в день использования или за день до этого, чтобы избежать микробного загрязнения. При приготовлении за день до использования храните раствор флуоресцеина на расстоянии 4 °C от света. Оберните тубы алюминиевой фольгой для предотвращения фотоотбеливания.
    2. Разделите раствор на аликвоты, пригодные для использования в одном эксперименте. 1-1,5 мкл раствора флуоресцеина используется на мышь в каждый момент времени. Используйте следующую формулу для вычисления объема аликвоты, подходящего для одного эксперимента:
      Equation 1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если шесть мышей изучаются в одном эксперименте с размером раны, контролируемым в пяти временных точках, объем аликвоты, подходящий для этого единственного эксперимента, будет составлять:
      Equation 2
  2. Приготовление коктейля кетамин/ксилазин для анестезии мышей.
    1. Чтобы приготовить 10 мл коктейля, смешайте 2,0 мл кетамина (100 мг/мл) с 1,0 мл ксилазина (20 мг/мл) и добавьте 7,0 мл стерильного PBS. Приготовьте коктейль кетамин/ксилазин за день до или в день операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы следует использовать при комнатной температуре, если не указано иное.

2. Анестезия

  1. Взвесьте мышь (8-12-недельные мыши дикого типа C57BL/6), чтобы определить соответствующее количество анестетика для введения. Используйте технику удержания двуручных мышей для удержания и обработки мышей для инъекции анестетика18. Вводят коктейль кетамин/ксилазин внутрибрюшинно (т..) в конечной концентрации 80 мг/кг кетамина и 8 мг/кг ксилазина.
  2. Подождите, пока не будет достигнута полная анестезия, прежде чем выполнять ранение роговицы на мыши. Оцените глубину анестезии, оценив рефлекс педали после защемления пальца ноги. Когда достигается адекватная анестезия, мышь не должна двигаться по пальцу ноги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мыши быстро теряют тепло тела во время анестезии, важно обеспечить источник тепла для мышей, чтобы предотвратить переохлаждение. Поместите мышей на источник тепла (грелку) во время анестезии и восстановления.

3. Создание раны роговицы

  1. Раните только правый или левый глаз. Поддерживайте согласованность с глазом (т.е. левым или правым), который ранен при переходе от мыши к мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ссадины повреждают нервы роговицы и снижают остроту, ранение обоих глаз может вызвать значительный дискомфорт и ухудшение. Поскольку анальгетики обладают потенциалом для подавления воспалительных реакций, их использование может быть путаницей в определенных экспериментах, направленных на понимание воспаления роговицы. Отказ от анальгетиков в экспериментах с ранами роговицы был одобрен нашим Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
  2. Для создания эпителиальной раны роговицы
    1. Под рассекающим микроскопом используйте трефин диаметром 2 мм (см. Рисунок 1) для разграничения центра роговицы, сохраняя глаз широко открытым, используя большой и указательный пальцы, чтобы удерживать веки. Аккуратно закрутите трефин, чтобы произвести впечатление на эпителий роговицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не оказывать чрезмерного давления при использовании трефина, так как это может привести к перфорации роговицы. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность, чтобы расположить трефин в центре. Зрачки могут быть использованы в качестве ориентира для определения центра роговицы.
    2. Под рассекающим микроскопом держите тупой клюшку для гольфа (см. Рисунок 1) примерно на 45° от поверхности роговицы в области, разграниченной трефином. Осторожно и непрерывно соскребайте эпителий в пределах разграниченной области с помощью шипа, чтобы оштрафовать эпителий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикладывайте чрезмерного усилия при санации, так как это также может вызвать перфорацию роговицы. Глаза мышей могут пересыхать во время процесса ранирования, что затрудняет санацию. В таком случае нанесите стерильный PBS на глазную поверхность для поддержания оптимального увлажнения.

Figure 1
Рисунок 1: Трефин 2 мм и тупая клюшка для гольфа. Трефин используется для демаркации круглой области в центре роговицы, а плетение клюшки для гольфа используется для удаления эпителия в демаркированной области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Мониторинг закрытия раны и реэпителизации

  1. Пипетка 1-1,5 мкл 1% раствора флуоресцеина на раненую поверхность и изображение роговицы с помощью цифрового микроскопа с источником синего света.
  2. Получайте изображения в течение первой минуты добавления раствора флуоресцеина, чтобы избежать распространения на окружающий эпителий, что приводит к переоценке размера раны. Раненые роговицы визуализируются в определенное время (т.е. через 0 ч, 12 ч, 18 ч, 24 ч и 30 ч) после ранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во все моменты времени визуализация проводится под наркозом; кетамин/ксилазин используется во время ранения, в то время как изофлуран используется в последующие моменты времени. Мышей размещают индивидуально в отдельных клетках на время мониторинга закрытия раны. При совместном размещении мыши, как правило, облизывают глаза однопометника, поведение, которое, как было показано, влияет на заживление ран в разных тканях19,20.
  3. Анализируйте захваченные изображения, отслеживая область раны с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Площадь раны для каждой точки времени выражается в процентах от исходной площади раны через 0 ч.

5. Иммунофлуоресцентная визуализация и анализ

  1. Усыпляйте мышей одобренным IACUC методом (в данном случае передозировка углекислого газа с последующим вывихом шейки матки) в желаемые моменты времени после ранения.
  2. Соберите глазные яблоки, осторожно надавливая на боковую кантус, чтобы сместить глазное яблоко с помощью изогнутых ножниц радужной оболочки. Направьте ножницы за глазное яблоко, чтобы прочно захватить зрительный нерв, а затем перережьте нерв, что позволяет удалить глазное яблоко.
  3. Зафиксируйте каждое глазное яблоко в 1 мл 1x PBS, содержащего 2% параформальдегида, в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем промыть три раза в 1 мл 1x PBS в течение 5 мин каждый.
  4. Под рассекающим микроскопом используйте хирургическое лезвие, чтобы сделать разрез в склере, около 500 мкм дистально от лимбуса, а затем разрезать земной шар. Используя щипцы, аккуратно удалите вещество радужной оболочки из роговицы, а затем аккуратно обрежьте склеральную ткань, убедившись, что лимб остается нетронутым.
  5. Сделайте четыре частичных радиальных разреза, каждый примерно 1 мм в длину, которые простираются от периферической роговицы и останавливаются недалеко от центра, чтобы позволить роговице сплющиться.
  6. Пермеабилизируют и блокируют роговицу в 1 мл 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,01% TritonX -100 в 1x PBS в течение 15 мин с последующим блокированием 2% BSA в 1x PBS в течение дополнительных 45 мин при комнатной температуре.
  7. Инкубировать роговицу в течение ночи при 4 °C в коктейле из непосредственно меченых уникальных фторхромовых конъюгированных антител, приготовленных в 1x PBS, содержащем 2% BSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела нацелены на маркировку специфических клеток и тканей, представляющих интерес. Например, эндотелий, нейтрофилы и тромбоциты помечены анти-CD3121,22, анти-Ly-6G23,24 и анти-CD4125,26 антителами соответственно. 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) добавляют в коктейль антител для визуализации ядер.
  8. После инкубации промыть роговицу три раза по 1x PBS в течение 15 мин каждая.
  9. Установите роговицы на предметное стекло микроскопа в капле антивялой флуоресцентной монтажной среды, накройте крышкой и изображение с нужным увеличением (объектив от 4x до 100x) с помощью флуоресцентного светового микроскопа. Сделайте полноразмерные снимки роговицы в разных регионах, как показано на рисунке 2А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схема микроскопического анализа, проиллюстрированная на рисунке 2А, используется для анализа специфических региональных изменений воспаления и деления клеток. Окрашивание DAPI и Ly-6G используется для идентификации внесосудистых нейтрофилов. При окрашивании DAPI сферические нейтрофилы имеют отчетливое ядро в форме подковы или пончика (рисунок 2B).

Figure 2
Рисунок 2: Стратегия визуализации роговицы и инфильтрация нейтрофилов после центрального истирания. (А) Схематическое изображение цельной роговицы, показывающее девять микроскопических полей по всему диаметру роговицы. Серая область представляет собой исходную область раны. Ширина каждой области составляет 500 мкм. (B) Обратите внимание на отчетливую форму подковы или пончика ядер нейтрофилов с окрашиванием DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 3 показана просвечивающая электронная микрофотография раны роговицы, созданная тупым клубком для гольфа, демонстрирующая, что эпителиальная базальная мембрана действительно неповреждена после травмы.

Figure 3
Рисунок 3: Эпителиальная базальная мембрана остается неповрежденной после истирания роговицы. Просвечивающая электронная микрофотография раны роговицы, созданная с помощью тупого клюшки для гольфа. Наконечники стрел указывают на базальную мембрану под оставшимся эпителием, окружающим рану, в то время как стрелки указывают на базальную мембрану в оголенной области. Это показывает непрерывность базальной мембраны от неибраженных до истираемых участков роговицы, демонстрируя, что базальная мембрана остается нетронутой после санации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Этот протокол для ранения роговицы был использован для широкой характеристики динамики заживления раны для 2 мм эпителиальной истираемой раны 27,28,29,30,31,32,33. Возможность контролировать скорость закрытия раны и реэпителизации in vivo является центральной частью этой модели. Как показано на рисунке 4А, использование флуоресцеинового раствора и цифрового микроскопа с синим источником света позволяет визуализировать размер раны. В этой модели мониторинг закрытия раны выполняется в момент ранения (0 ч), 12 ч, 18 ч, 24 ч и 30 ч после ранения. На рисунке 4В показана кинетика закрытия раны за 30 ч. У 8-12-недельных мышей C57BL/6 дикого типа закрытие раны и реэпителизация обычно завершаются через 24 ч после ранения, как показано на рисунке 4B, и хорошо регулируемая воспалительная реакция имеет основополагающее значение для эффективного заживления ран 34,35,36.

Figure 4
Рисунок 4: Закрытие эпителиальной раны оценивали с использованием флуоресцеинового окрашивания. (A) Репрезентативные изображения флуоресцеинового окрашивания раны роговицы через 0 ч, 12 ч, 18 ч, 24 ч и 30 ч. В этой модели закрытие раны обычно завершается через 24 часа после ранения. Обратите внимание на отсутствие зеленого окрашивания в центральной роговице через 24 ч и 30 ч. (Б) Кинетика закрытия раны указывает на полное закрытие раны через 24 ч после ранения. Значение в каждый момент времени выражается в процентах от исходной площади раны (т.е. площади раны через 0 ч) (n ≥ 6). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Воспалительная реакция на ранение в данной модели хорошо охарактеризована. Эпителиальная абразивная рана вызывает быструю воспалительную реакцию в сосудистой системе лимбовицы роговицы, в основном характеризующуюся вазодилатацией, экстравазацией тромбоцитов, ограниченной лимбом 37,38,39 и экстравазацией нейтрофилов с миграцией к центру роговицы40. На рисунке 5 показана лимбальная сосудистая система неперемотанной роговицы с внесосудистыми нейтрофилами (рисунок 5А) и раненой роговицы с внесосудистыми тромбоцитами и нейтрофилами (рисунок 5В).

Figure 5
Рисунок 5: Визуализация воспалительных клеток в лимбе. Микрофотография лимбуса роговицы, показывающая окрашивание лимбальных кровеносных сосудов антителом против CD31 (показано красным цветом), нейтрофилами с антителом против Ly-6G (показано зеленым) и тромбоцитами с анти-CD41 антителом (показано синим). (A) отсутствие истирания и (B) 30 ч после истирания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этой модели инфильтрация нейтрофилов в роговицу оценивается в пяти различных областях, как показано на рисунке 2A. Чтобы определить эти отдельные области, захватывается изображение всей роговицы, визуализируя лимбальную сосудистую систему с окрашиванием анти-CD31. Самый внутренний край лимбальной области на каждом лепестке отмечается с использованием лимбальной сосудистой системы в качестве ориентира. Расстояние от самого внутреннего края лимбальной области от одного лепестка до другого в горизонтальном (x) или вертикальном (y) направлении измеряется для каждой цельной горы роговицы. Для 8-12-недельных мышей дикого типа C57BL/6 это расстояние составляет ~3,7 мм. Это расстояние охватывает периферийные области. Затем центр цельного роговицы вычисляется как точка, соответствующая половине горизонтального или вертикального диаметра всего маунта. Парацентральная область находится на расстоянии 500 мкм влево, вправо, вверх или вниз от вычисляемого центра. Остальные поля находятся на расстоянии 500 мкм от предыдущего поля. Окрашивание DAPI и Ly-6G используется для идентификации внесосудистых нейтрофилов. Количество нейтрофилов в каждой области роговицы из четырех квадрантов усредняется и выражается в виде нейтрофилов на поле.

Оценка тромбоцитов в этой модели проводится только на лимбусе; во время заживления раны роговицы тромбоциты экстравазируются и локализуются влимбусе 27,37. Общее количество тромбоцитов в лимбусе подсчитывается, и количество выражается в виде тромбоцитов/мм2 лимбальной области. Количество из четырех лепестков может быть суммированным или усредненным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Целью данной работы по методам было описание протокола создания центральной эпителиальной абразивной раны роговицы у мыши с использованием трефина и тупой клюшки для гольфа. Эта мышиная модель была использована для изучения воспаления роговицы и его вклада в заживление ран. Данный тип модели может быть использован для изучения механизмов заживления ран роговицы при нормальных физиологических условиях и при патологиях 17,28,29,41,42. Модель была использована для исследования заживления ран роговицы при патологических состояниях, о чем свидетельствует исследование нарушения заживления ран роговицы на мышиной модели ожирения, вызванного диетой17. Явным преимуществом этой модели является то, что она создает точный (2 мм) воспроизводимый размер эпителиальной раны с точным центральным расположением без нарушения базальной мембраны. Эта модель намоталивания роговицы проста и быстра в исполнении. Помимо тупой клюшки для гольфа 29,39,43,44,45, вращающегося заусенца (Algerbrush)38,46,47 и алмазного лезвия 32,37,40,48,49,50,51 могут быть использованы для создания абразивной раны в этой модели. В руках опытного пользователя нет существенной разницы в истираемой ране, создаваемой любым инструментом. Для тренировочных целей и в руках новичка часто легче добиться воспроизводимых результатов с помощью тупого клюшки для гольфа по сравнению с вращающимся заусенцем и алмазным лезвием. Вращающийся заусенец (Algerbrush) требует тонкого прикосновения, иначе вращающийся заусенец может повредить эпителиальную базальную мембрану. Об этом также сообщили другие следователи52,53. С другой стороны, тупая клюшка для гольфа последовательно оставляет эпителиальную базальную мембрану нетронутой.

Чтобы успешно воспроизвести этот протокол раны роговицы и наблюдать последующую переэпителизацию и динамику воспаления, необходимо использовать тот же штамм и возрастной диапазон мыши, а размер и глубину раны должны быть созданы, как описано выше. Динамика заживления ран роговицы и сроки, описанные в этом протоколе, относятся к штамму мыши C57BL/6 и могут не использоваться, если используется другой штамм мыши. Pal-Ghosh et al.54 сообщили об изменениях в способности C57BL/6 и BALB/c заживлять раны эпителия роговицы. При том же размере раны роговицы закрытие раны роговицы и повторная эпителизация медленнее у мышей BALB/c. График завершения закрытия раны и характерной воспалительной реакции, описанной здесь, относится к круглой ране диаметром 2 мм. Ожидается более длительное время завершения закрытия раны для ран диаметром более 2 мм, в то время как более короткое время ожидается для диаметров ран менее 2 мм. Кроме того, ожидается, что более крупные раны роговицы, особенно те, которые находятся ближе к лимбу, вызовут более преувеличенную воспалительную реакцию, поскольку вроговицу 16 набирается больше лейкоцитов. Что еще более важно, рана должна быть ограничена эпителием роговицы. Раны, нарушающие эпителиальную базальную мембрану или проникающие в строму роговицы, заживают дольше. Эти раны также связаны с измененной воспалительной реакцией, неоваскуляризацией, образованием миофибробластов и рубцеванием55,56.

Необходимо соблюдать осторожность на каждом шагу, чтобы предотвратить микробную инфекцию истираемой роговицы. Микробная инфекция изменяет воспалительную реакцию и может привести к изъязвлениям, рубцам и потере зрения57. Для предотвращения микробной инфекции раны всегда следует использовать стерильные инструменты и растворы. Если несколько мышей получают ранения одновременно, для каждой мыши следует использовать стерильный трефин. В промежутках между мышами клюшку для гольфа следует промыть в стерильном PBS с последующей дезинфекцией в 70% этаноле и снова промыть в стерильном PBS. Если ранение проводится на дополнительных мышах в течение нескольких дней, оно должно выполняться в одно и то же время суток. Это делается для контроля циркадного воздействия на заживление ран и воспаление. У мышей C57BL/6 время суток, когда делается рана, влияет на скорость и качество заживления ран роговицы. Более быстрое закрытие раны и большее деление клеток наблюдаются, когда мыши ранены утром по сравнению с ранением во второй половине дня или вечером42. Циркадное влияние на заживление ран было зарегистрировано в других тканях, включая кожу58,59. Ранение в этой модели всегда выполняется утром.

Результирующая воспалительная реакция на раны в этой модели протекает как хорошо охарактеризованный каскад клеточных и молекулярных событий, которые имеют решающее значение для эффективного заживления ран. Наиболее характерными клеточными игроками в истираемом воспалении в этой модели являются нейтрофилы и тромбоциты. Нейтрофилы первыми реагируют на место истирания роговицы; значительные уровни нейтрофилов обнаруживаются в строме роговицы в течение 6 ч после ранения. Нейтрофилы отвечают за очистку клеточного мусора, процесс, присущий воспалению и заживлению ран60. В дополнение к своей фагоцитарной активности, нейтрофилы содержат факторы роста, такие как факторы роста эндотелия сосудов (VEGF)61. VEGF является решающим нейрорегенеративным фактором для регенерации нервов роговицы после ранения62,63, а также важен для деления эпителиальных клеток роговицы 45,63. Нейтрофильная инфильтрация в лимбе происходит в две волны с первым пиком в 18 ч и вторым пиком через 30 ч после ранения40. Было показано, что при использовании нейтропенических мышей37,40 экстравазация нейтрофилов и последующая миграция в центр роговицы имеют решающее значение для заживления ран роговицы. Хотя традиционно известно, что тромбоциты играют ключевую роль в поддержании гемостаза и свертывания крови, тромбоциты также играют признанную ключевую роль в заживлении ран роговицы37. Тромбоциты содержат многочисленные медиаторы, которые способствуют воспалению и разрешению тканей64,65. У мышей с тромбоцитопенией эта модель была использована, чтобы показать, что тромбоциты важны для эффективного заживления ран роговицы37.

Хотя нейтрофилы и тромбоциты являются наиболее характеризуемыми клетками в этой модели, иммунные клетки, такие как гамма-дельта-Т-клетки, естественные клетки-киллеры и дендритные клетки, также участвуют в иммунном ответе на ранение с использованием этой модели27,48. Сообщалось об экстравазации естественных клеток-киллеров встроме 28,29 и миграции гамма-дельта-Т-клеток в целебный эпителий27. Эта модель также использовалась для идентификации молекул адгезии, ключей к экстравазации иммунных клеток во время заживления ран роговицы. Было показано, что антиген функции лимфоцитов-1 (LFA-1)32,CD18 51 и молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1)47,49 имеют решающее значение для экстравазации нейтрофилов и эффективного заживления ран роговицы с использованием этой модели. Деление эпителиальных клеток в ответ на ранение, которое имеет решающее значение для повторной стратификации эпителия после закрытия раны, оценивается с использованием митотических цифр. Хромосомная конденсация на разных стадиях деления клеток придает ядрам характерный вид, известный как митотическая фигура. Окрашивание ядра DAPI позволяет визуализировать эти митотические фигуры.

Модель истираемой раны роговицы мыши оказалась удивительно воспроизводимой и дала значительное представление о клеточных и молекулярных механизмах, которые способствуют эффективному заживлению ран. Однако стоит отметить, что у модели существуют ограничения в отношении ее клинической применимости. Модель и ее результаты применимы только к простым, непроникающим эпителиальным ссадинам. Как отмечалось ранее, травмы роговицы в результате проникающих ран, вызванных физическим или химическим оскорблением, вызовут различные кинетические и исходы заживления ран, особенно если рана инфицируется, как это часто происходит в случае травм роговицы человека. При этом модель истирания роговицы мыши обеспечивает отличную основу для изучения фундаментальных принципов воспаления, которые модулируют заживление ран роговицы.

Протокол ранения роговицы, описанный здесь, прост и легко воспроизводится. Он предоставляет полезный инструмент для изучения фундаментальных вопросов о процессе заживления раны роговицы и связанной с ним воспалительной реакции. Его потенциал помочь в понимании патологий роговицы, связанных с осложнениями заживления ран, - это только начало.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Финансирование: При поддержке: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. и R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) и Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Медицина выпуск 178 роговица заживление ран абразив клюшка для гольфа трефин
Модель истирания эпителия для изучения заживления ран роговицы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter