Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kornea yara iyileşmesi modeli yüksek oranda tekrarlanabilir ve şimdi hastalıklar bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Abstract

Kornea görme için kritik öneme sahiptir ve gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini oluşturur. Korneanın vizyondaki rolü için çok önemli olan şey şeffaflığıdır. Bununla birlikte, dış pozisyonu nedeniyle, kornea, kornea şeffaflığının kaybına ve nihai körlüğe yol açabilecek çok çeşitli yaralanmalara karşı oldukça hassastır. Bu yaralanmalara yanıt olarak etkili kornea yarasının iyileşmesi, kornea homeostazının korunmasında ve kornea saydamlığının ve kırma yeteneklerinin korunmasında çok önemlidir. Tehlikeye giren kornea yarası iyileşmesi durumunda, kornea enfeksiyonlara, ülserasyonlara ve yara izlerine karşı savunmasız hale gelir. Kornea yaralanması iyileşmesinin kornea şeffaflığının ve görmenin korunmasındaki temel önemi göz önüne alındığında, normal kornea yarası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması, enfeksiyon ve hastalıkla ilişkili bozulmuş kornea yarasının iyileşmesini anlamak için bir ön koşuldur. Bu amaç doğrultusunda, kornea yaralanmasının murin modellerinin, normal fizyolojik koşullar altında çalışan kornea yarası iyileşme mekanizmalarını daha iyi anlamamızda yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitel aşınması oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu modelde, yara bölgesini ayırmak için kornea üzerinde ortalanmış 2 mm çapında dairesel bir trefin kullanılır. Golf sıçrayışı, epiteli debride etmek ve kornea epitel bazal membranına zarar vermeden dairesel bir yara oluşturmak için özenle kullanılır. Ortaya çıkan enflamatuar yanıt, etkili yara iyileşmesi için kritik olan iyi karakterize edilmiş hücresel ve moleküler olayların bir kaskadı olarak ilerler. Bu basit kornea yara iyileşmesi modeli oldukça tekrarlanabilir ve iyi yayınlanmıştır ve şimdi hastalık bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Introduction

Kornea gözün üçte birinin saydam ön kısmıdır. Kornea gözün iç yapılarını korumak ve gözü enfeksiyonlara karşı koruyan yapısal bir bariyer oluşturmak da dahil olmak üzere çeşitli işlevlere hizmet eder1. Daha da önemlisi, kornea görme için kritik öneme sahiptir ve gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini sağlar 2,3. Korneanın vizyondaki rolü için çok önemli olan şey şeffaflığıdır. Bununla birlikte, dışa doğru pozisyonu nedeniyle, kornea günlük olarak bariyer fonksiyonunun bozulmasına, şeffaflık kaybına ve nihai körlüğe yol açabilecek çok çeşitli yaralanmalara maruz kalmaktadır. Kornea saydamlık kaybı tüm dünyada görme bozukluğunun önde gelen nedenlerinden biridir 4,5. Kornea sıyrıkları, acil servise (ER) yapılan ziyaretlerin yaygın bir nedenidir ve ER6'da sunulan gözle ilgili vakaların yarısını oluşturur. Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 1 milyondan fazla kişinin gözle ilgili yaralanmalardan muzdarip olduğu tahmin edilmektedir7. Bu yaralanmalara yanıt olarak etkili kornea yarasının iyileşmesi, kornea homeostazının korunması, şeffaflığının ve kırma yeteneklerinin korunması için çok önemlidir. Tehlikeye giren kornea yarasının iyileşmesi durumunda, kornea enfeksiyonlara, ülserasyonlara ve yara izlerine karşı savunmasız hale gelir 8,9. Ayrıca, refraktif ameliyatların artan popülaritesi, kornea10'a benzersiz bir travmatik zorluk getirmektedir. Kornea yaralanması iyileşmesinin kornea şeffaflığının ve görmenin korunmasındaki temel önemi göz önüne alındığında, normal kornea yarası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması, enfeksiyon ve hastalıkla ilişkili bozulmuş kornea yarasının iyileşmesini anlamak için bir ön koşuldur.

Bu amaçla, kornea yara iyileşmesinin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir11,12,13,14,15. Kornea yarasının iyileşmesinin murin modellerinin, normal fizyolojik koşullar altında çalışan kornea yarası iyileşme mekanizmalarını anlamamızı sağlamada yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Kornea yarasının iyileşmesini incelemek için her biri yara iyileşme sürecinin farklı yönlerini araştırmak için uygun olan farklı kornea yaraları türleri kullanılmıştır. Kornea yara iyileşmesi çalışmalarında kullanılan en yaygın yara modeli tipleri mekanik ve kimyasal yara modelleridir. Çoğunlukla korneada alkali yanıkların oluşumunu içeren kimyasal kornea yaraları, kornea ülserlerini, opaklaşmayı ve neovaskülarizasyonu incelemek için yararlıdır13. Mekanik kornea yaraları debridman (aşınma) yaralarını ve keratektomi yaralarını içerir14,15,16. Sağlam veya kırılmış kornea epitel bazal membranı sırasıyla debridman ve keratektomi yaralarını tanımlar. Debridman yaralarında epitel bazal membranı sağlam kalırken, keratektomi yaralarında çoğunlukla anterior stromaya penetrasyon ile bazal membran kırılır. Debridman yaraları, kornea yaralanmasını takiben yeniden epitelizasyon, epitel hücre proliferasyonu, immün yanıt ve sinir rejenerasyonunu incelemek için en yararlı olanlardır. Keratektomi yaraları ise kornea skarlaşmasının incelenmesinde en yararlı olanıdır14,15.

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu basit kornea yara iyileşmesi modeli oldukça tekrarlanabilir ve iyi yayınlanmıştır ve şimdi hastalık bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri, Houston Üniversitesi ve Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) bildirisinde özetlenen ve hayvanların görme ve oftalmik araştırmalarda kullanımına ilişkin kılavuzlar, farelerin ele alınmasında ve kullanılmasında takip edilmiştir.

1. Hazırlık

  1. Floresein çözeltisinin hazırlanması
    1. 10 mg sodyum floresein tuzunu 1 mL steril salin veya steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek% 1 floresein çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için sodyum floresein çözeltisini kullanım gününde veya bir gün önce hazırlayın. Kullanımdan bir gün önce hazırlandığında, floresein çözeltisini ışıktan 4 ° C'de saklayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile sarın.
    2. Çözeltiyi tek bir deneyde kullanıma uygun alikotlara bölün. Zaman noktası başına fare başına 1-1,5 μL floresein çözeltisi kullanılır. Tek bir denemeye uygun aliquot hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      Equation 1
      NOT: Örneğin, beş zaman noktasında izlenen yara büyüklüğüne sahip tek bir deneyde altı fare incelenirse, bu tek deney için uygun olan aliquot hacmi şöyle olacaktır:
      Equation 2
  2. Farelerin anestezisi için ketamin / ksilazin kokteylinin hazırlanması.
    1. 10 mL kokteyl hazırlamak için, 2.0 mL ketamin (100 mg / mL) ile 1.0 mL ksilazin (20 mg / mL) karıştırın ve 7.0 mL steril PBS ekleyin. Ketamin / ksilazin kokteylini ameliyattan bir gün önce veya ameliyat günü hazırlayın.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm çözeltiler oda sıcaklığında kullanılmalıdır.

2. Anestezi

  1. Uygulanacak uygun anestezik miktarını belirlemek için fareyi (8-12 haftalık C57BL/6 vahşi tip fareler) tartın. Anestezik18'in enjeksiyonu için fareleri kısıtlamak ve işlemek için iki elli fare kısıtlama tekniğini kullanın. Ketamin / ksilazin kokteylini intraperitoneal olarak (i.p.) 80 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin nihai konsantrasyonunda uygulayın.
  2. Fareye kornea yaralaması yapmadan önce tam anestezi elde edilene kadar bekleyin. Ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra pedal refleksini değerlendirerek anestezi derinliğini değerlendirin. Yeterli anestezi sağlandığında, fare ayak parmağını sıkıştırmak için hareket etmemelidir.
    NOT: Fareler anestezi sırasında vücut ısısını hızla kaybettiğinden, hipotermiyi önlemek için farelere bir sıcaklık kaynağı sağlamak önemlidir. Anestezi ve iyileşme aşamalarında fareleri bir ısı kaynağına (ısıtma yastığı) yerleştirin.

3. Kornea yarası oluşumu

  1. Sadece sağ veya sol gözü yaralayın. Fareden fareye geçerken yaralanan gözle (yani sol veya sağ) tutarlılığı koruyun.
    NOT: Aşınmalar kornea sinirlerine zarar verdiğinden ve keskinliği azalttığından, her iki gözün yaralanması önemli rahatsızlıklara ve bozulmalara neden olabilir. Analjezikler enflamatuar yanıtları baskılama potansiyeline sahip olduklarından, kullanımları kornea iltihabını anlamayı amaçlayan bazı deneylerde kafa karıştırıcı olabilir. Kornea yarası deneylerinde analjeziklerden kaçınmak, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitemiz (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
  2. Epitel kornea yarası oluşturmak için
    1. Diseksiyon mikroskobu altında, korneanın merkezini ayırmak için 2 mm çapında trefin kullanın (bkz. Şekil 1), göz kapaklarını tutmak için baş parmak ve işaret parmağını kullanarak gözü geniş tutun. Kornea epiteli üzerinde bir izlenim bırakmak için trefin'i yavaşça döndürün.
      NOT: Trefin kullanırken aşırı basınç uygulanmamasına dikkat edilmelidir, çünkü bu kornea perforasyonuna neden olabilir. Ayrıca, trefinin merkezi olarak konumlandırılmasına özen gösterilmelidir. Öğrenciler korneanın merkezini bulmak için bir dönüm noktası olarak kullanılabilir.
    2. Diseksiyon yapan bir mikroskop altında, künt golf spodu (bkz. Şekil 1), trefin ile sınırlandırılmış alan içinde kornea yüzeyinden yaklaşık 45 ° 'de tutun. Epiteli debride debride etmek için sınırlanmış bölgedeki epiteli dikkatlice ve sürekli olarak pud ile kazıyın.
      NOT: Debridmanda aşırı kuvvet uygulamayın, çünkü bu da kornea perforasyonuna neden olabilir. Farelerin gözleri yaralama işlemi sırasında kuruyabilir ve bu da debridmanı zorlaştırır. Böyle bir durumda, optimum hidrasyonu sağlamak için oküler yüzeye steril PBS uygulayın.

Figure 1
Resim 1: 2 mm trefin ve künt golf sopası spud. Trefin, kornea merkezinde dairesel bir bölgeyi sınırlamak için kullanılır ve golf kulübü spud'u, sınırlandırılmış bölgedeki epiteli çıkarmak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Yara kapanmasının izlenmesi ve yeniden epitelizasyonun izlenmesi

  1. Pipet 1-1.5 μL% 1 floresein çözeltisi mavi ışık kaynaklı dijital bir mikroskop kullanarak yaralı yüzey ve görüntü korneası üzerine.
  2. Yara boyutunun abartılmasına yol açan çevredeki epitellere yayılmasını önlemek için floresan çözeltisinin ilk dakikasında görüntüler elde edin. Yaralı kornealar, yaralanmadan sonra belirli zamanlarda (yani, 0 saat, 12 saat, 18 saat, 24 saat ve 30 saat) görüntülenir.
    NOT: Tüm zaman noktalarında, görüntüleme anestezi altında yapılır; ketamin / ksilazin yaralama sırasında kullanılırken, izofluran sonraki zaman noktalarında kullanılır. Fareler, yara kapanma izleme süresi boyunca ayrı kafeslerde ayrı ayrı tutulur. Birlikte barındırıldığında, fareler çöp arkadaşının gözlerini yalama eğilimindedir, bu da farklı dokularda yara iyileşmesini etkilediği gösterilen bir davranış19,20.
  3. Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak yara alanını izleyerek yakalanan görüntüleri analiz edin. Her zaman noktası için yara alanı, 0 saatte orijinal yara alanının yüzdesi olarak ifade edilir.

5. İmmünofloresan görüntüleme ve analizi

  1. IACUC onaylı bir yöntemle (bu durumda, karbondioksit doz aşımı ve ardından servikal çıkık) fareleri, yaralamadan sonra istenen zaman noktalarında ötenazileştirin.
  2. İris kavisli makas kullanarak göz küresini yerinden etmek için yanal canthus'a hafifçe bastırarak göz kürelerini toplayın. Optik siniri sıkıca kavramak için makası göz küresinin arkasına yönlendirin ve ardından göz küresinin çıkarılmasını sağlayan siniri kesin.
  3. Her bir göz küresini, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 2 paraformaldehit içeren 1 mL'lik 1x PBS'ye sabitleyin ve ardından her biri 5 dakika boyunca 1 mL'lik 1x PBS'de üç kez yıkayın.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında, sklerada bir kesi yapmak için bir cerrahi bıçak kullanın, limbusa yaklaşık 500 μm distal ve daha sonra dünyayı kesin. Forseps kullanarak, iris maddesini korneadan nazikçe çıkarın ve daha sonra limbus'u sağlam bıraktığınızdan emin olarak skleral dokuyu dikkatlice kesin.
  5. Her biri yaklaşık 1 mm uzunluğunda, periferik korneadan uzanan ve korneanın düzleşmesine izin vermek için merkezden kısa duran dört kısmi radyal kesim yapın.
  6. Korneaları 15 dakika boyunca 1 mL% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.01 TritonX -100'de 1x PBS'de% 0.01 TritonX -100'de geçirgenleştirin ve bloke edin, ardından oda sıcaklığında 45 dakika daha 1x PBS'de% 2 BSA'da bloke edin.
  7. Korneaları% 2 BSA içeren 1x PBS'de hazırlanan doğrudan etiketlenmiş benzersiz florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir kokteylde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    NOT: Antikorlar, ilgilenilen belirli hücreleri ve dokuları etiketlemek için hedeflenir. Örneğin, endotel, nötrofiller ve trombositler sırasıyla anti-CD31 21,22, anti-Ly-6G 23,24 ve anti-CD41 25,26 antikorları ile etiketlenmiştir. Çekirdekleri görselleştirmek için antikor kokteyline 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) eklenir.
  8. Kuluçkadan sonra, korneaları her biri 15 dakika boyunca 1x PBS'de üç kez yıkayın.
  9. Korneaları mikroskop üzerine bir damla solma önleyici floresan montaj ortamına monte edin, bir kapak kayması ile örtün ve bir floresan ışık mikroskobu kullanarak istenen büyütme (4x ila 100x objektif) ile görüntü. Şekil 2A'da gösterildiği gibi korneanın farklı bölgelerdeki tam kalınlıkta görüntülerini alın.
    NOT: Şekil 2A'da gösterilen mikroskobik analiz paterni, inflamasyon ve hücre bölünmesindeki spesifik bölgesel değişiklikleri analiz etmek için kullanılır. Hem DAPI hem de Ly-6G boyama, ekstravasküler nötrofilleri tanımlamak için kullanılır. DAPI boyama ile, küresel nötrofiller farklı bir at nalı veya çörek şeklinde çekirdeğe sahiptir (Şekil 2B).

Figure 2
Şekil 2: Kornea görüntüleme stratejisi ve merkezi aşınma sonrası nötrofil infiltrasyonu . (A) Kornea çapı boyunca dokuz mikroskobik alan gösteren bir kornea bütününün şematik gösterimi. Gri alan orijinal yara alanını temsil eder. Her bölgenin genişliği 500 μm'dir. (B) DAPI boyaması ile nötrofil çekirdeklerinin farklı at nalı veya çörek şeklini not edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 3 , künt golf sopası spud'u ile oluşturulan bir kornea yarasının iletim elektron mikrografını göstererek, epitel bazal membranının yaralanmadan sonra gerçekten sağlam olduğunu göstermektedir.

Figure 3
Şekil 3: Epitelyal bazal membran kornea aşınmasından sonra bozulmadan kalır. Künt golf sopası spud'u ile oluşturulan bir kornea yarasının iletim elektron mikrografisi. Ok uçları, yarayı çevreleyen kalan epitelin altındaki bazal zarı işaret ederken, oklar inkar edilen bölgedeki bazal zarı işaret eder. Bu, bazal membranın aşınmamıştan korneanın aşınmış kısımlarına kadar sürekliliğini göstererek, bazal membranın debridmandan sonra bozulmadan kaldığını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kornea yaralanması için bu protokol, 2 mm'lik bir epitelyal aşınma yarası 27,28,29,30,31,32,33 için yara iyileşme dinamiklerini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılmıştır. Yara kapanma ve reepitelizasyon oranını in vivo olarak izleme yeteneği bu modelin merkezi bir parçasıdır. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, floresein çözeltisi ve mavi ışık kaynağına sahip dijital mikroskop kullanımı, yara boyutunun görselleştirilmesini sağlar. Bu modelde yara kapanma takibi yaralanma anında (0 saat), yaralama sırasında 12 saat, 18 saat, 24 saat ve yaralanmadan 30 saat sonra yapılır. Şekil 4B, 30 saatin üzerindeki yara kapanmasının kinetiğini göstermektedir. 8-12 haftalık C57BL/6 vahşi tip farelerde, yara kapanması ve yeniden epitelizasyon, Şekil 4B'de gösterildiği gibi yaralamadan 24 saat sonra tipik olarak tamamlanır ve iyi düzenlenmiş bir enflamatuar yanıt, etkili yara iyileşmesi için temeldir34,35,36.

Figure 4
Şekil 4: Epitel yarasının kapatılması floresein boyama kullanılarak değerlendirildi . (A) Kornea yarasının 0 saat, 12 saat, 18 saat, 24 saat ve 30 saatte floresein boyanmasının temsili görüntüleri. Bu modelde, yara kapanması tipik olarak yaralamadan 24 saat sonra tamamlanır. Merkezi korneada 24 saat ve 30 saatte yeşil lekelenme eksikliğine dikkat edin. (B) Yara kapanma kinetiği, yaralamadan sonra 24 saat boyunca tam yara kapanmasını gösterir. Her zaman noktasındaki değer, orijinal yara alanının yüzdesi olarak ifade edilir (yani, 0 saatte yara alanı) (n ≥ 6). Ortalama ± standart sapma olarak sunulan veriler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu modelde yaralanmaya enflamatuar yanıt iyi karakterize edilmiştir. Epitelyal aşınma yarası kornea limbal vaskülatüründe esas olarak vazodilatasyon, limbus37,38,39 ile sınırlı trombosit ekstravazasyonu ve kornea merkezine doğru migrasyon ile nötrofil ekstravazasyonu ile karakterize hızlı inflamatuar yanıt ortaya çıkarır40. Şekil 5'te ekstravasküler nötrofillere sahip yaralanmamış bir korneanın limbal vaskülatürü (Şekil 5A) ve ekstravasküler trombositler ve nötrofiller içeren yaralı bir korneanın (Şekil 5B) görülmektedir.

Figure 5
Şekil 5: Limüste inflamatuar hücre görüntüleme. Kornea limbusunun fotomikrografisi, anti-CD31 antikoru (kırmızı ile gösterilmiştir), anti-Ly-6G antikoru olan nötrofiller (yeşil ile gösterilmiştir) ve anti-CD41 antikoru olan trombositler (mavi ile gösterilmiştir) ile limbal kan damarları için boyanmayı göstermektedir. (A) aşınma olmaz ve (B) aşınmadan 30 saat sonra. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu modelde, korneaya nötrofil infiltrasyonu, Şekil 2A'da gösterildiği gibi beş ayrı bölgede değerlendirilmiştir. Bu farklı bölgeleri belirlemek için, tam kornea bütününün bir görüntüsü yakalanır ve limbal vaskülatürü anti-CD31 boyama ile görselleştirir. Her bir yapraktaki limbal bölgenin en iç kenarı, limbal vaskülatür kılavuz olarak kullanılarak işaretlenir. Limbal bölgenin en iç kenarından yatay (x) veya dikey (y) yönde bir yapraktan diğerine olan mesafe, her kornea bütün montajı için ölçülür. 8-12 haftalık C57BL/6 vahşi tip fareler için bu mesafe ~3,7 mm'dir. Bu mesafe çevre biriminden çevreye bölgeleri kapsar. Kornea bütün montajının merkezi daha sonra tüm montajın yatay veya dikey çapının yarısına karşılık gelen nokta olarak hesaplanır. Parasantral bölge, hesaplanan merkezden 500 μm sol, sağ, yukarı veya aşağıdır. Diğer alanların tümü önceki alandan 500 μm uzaklıktadır. Hem DAPI hem de Ly-6G boyama, ekstravasküler nötrofilleri tanımlamak için kullanılır. Dört kadrandan her kornea bölgesindeki nötrofil sayımlarının ortalaması alınır ve alan başına nötrofil olarak ifade edilir.

Bu modelde trombosit değerlendirmesi sadece limbusta yapılır; kornea yarasının iyileşmesi sırasında trombositler ekstravaza olur ve limbus27,37'ye lokalize olur. Limbüsteki toplam trombosit sayısı sayılır ve sayımlar limbal alanın trombositleri /mm2'si olarak ifade edilir. Dört yapraktan gelen sayımlar toplanabilir veya ortalaması alınabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntem makalesinin amacı, bir trefin ve künt bir golf sopası tükürüğü kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokolü tanımlamaktı. Bu murin modeli, kornea iltihabını ve yara iyileşmesine katkısını incelemek için kullanılmıştır. Bu tip bir model, normal fizyolojik koşullar altında vepatolojilerde kornea yarası iyileşme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir 17,28,29,41,42. Model, diyete bağlı obezitenin fare modelinde bozulmuş kornea yarası iyileşmesi üzerine yapılan bir çalışmada kanıtlandığı gibi, patolojik koşullar altında kornea yara iyileşmesini araştırmak için kullanılmıştır17. Bu modelin belirgin bir avantajı, bazal membranı ihlal etmeden hassas bir merkezi konuma sahip tam (2 mm) tekrarlanabilir bir epitel yara boyutu oluşturmasıdır. Bu kornea yaralama modeli basit ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilir. Künt golf kulübü spud 29,39,43,44,45, döner çapak (Algerbrush)38,46,47 ve elmas bıçak 32,37,40,48,49,50,51 ek olarak her ikisi de bu modelde aşınma yarasını oluşturmak için kullanılabilir. Deneyimli bir kullanıcının elinde, her iki aletin de yarattığı aşınma yarasında önemli bir fark yoktur. Eğitim amaçlı ve bir aceminin elinde, künt golf sopası ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek, dönen çapak ve elmas bıçağa kıyasla genellikle daha kolaydır. Dönen çapak (Algerbrush) hassas bir dokunuş gerektirir, aksi takdirde dönen çapak epitel bazal membranına zarar verebilir. Bu, diğer araştırmacılar tarafından da bildirilmiştir52,53. Öte yandan, künt golf kulübü spud sürekli olarak epitel bazal membranını sağlam bırakır.

Bu kornea yaralama protokolünü başarılı bir şekilde yeniden üretmek ve sonraki yeniden epitelizasyon ve inflamasyon dinamiklerini gözlemlemek için, farenin aynı suşu ve yaş aralığı kullanılmalı ve yaranın boyutu ve derinliği yukarıda açıklandığı gibi oluşturulmalıdır. Bu protokolde açıklanan kornea yara iyileşmesi dinamikleri ve zaman çizelgeleri C57BL/6 fare suşu içindir ve farklı bir fare suşu kullanılırsa paylaşılmayabilir. Pal-Ghosh ve ark.54, C57BL / 6 ve BALB / c'nin kornea epitel debridman yaralarını iyileştirme yeteneğinde değişiklikler olduğunu bildirmiştir. Aynı kornea yarası büyüklüğü için, BALB / c farelerde kornea yarasının kapatılması ve yeniden epitelizasyon daha yavaştır. Yara kapanmasının tamamlanması için zaman çizelgesi ve burada açıklanan karakteristik inflamatuar yanıt, 2 mm çapında dairesel bir yara içindir. 2 mm'den büyük yara çapları için daha uzun bir yara kapatma tamamlanma süresi, 2 mm'den küçük yara çapları için daha kısa bir süre beklenir. Ayrıca, daha büyük kornea yaralarının, özellikle limbus'a daha yakın olanların, kornea16'ya daha fazla lökosit alındığı için daha abartılı bir enflamatuar yanıt ortaya çıkarması beklenir. Daha da önemlisi, yara kornea epiteli ile sınırlandırılmalıdır. Epitel bazal membranını ihlal eden veya kornea stromasına nüfuz eden yaraların iyileşmesi daha uzun zaman alır. Bu yaralar ayrıca değişmiş inflamatuar yanıt, neovaskülarizasyon, miyofibroblast oluşumu ve skar55,56 ile ilişkilidir.

Aşınmış korneanın mikrobiyal enfeksiyonunu önlemek için her adımda dikkatli olunmalıdır. Mikrobiyal enfeksiyon enflamatuar yanıtı değiştirir ve ülserasyonlara, skarlaşmaya ve görme kaybına yol açabilir57. Yaranın mikrobiyal enfeksiyonunu önlemek için her zaman steril aletler ve solüsyonlar kullanılmalıdır. Aynı anda birden fazla fare yaralanıyorsa, her fare için steril bir trefin kullanılmalıdır. Fareler arasında, golf sopası pud steril PBS'de yıkanmalı, ardından% 70 etanol içinde dezenfeksiyon yapılmalı ve steril PBS'de tekrar yıkanmalıdır. Yaralama birkaç gün boyunca ek farelerde yapılırsa, günün aynı saatinde yapılmalıdır. Bu, yara iyileşmesi ve iltihabı üzerindeki sirkadiyen etkiyi kontrol etmek içindir. C57BL/6 farelerde, yaranın yapıldığı günün saati, kornea yarasının iyileşme hızını ve kalitesini etkiler. Fareler sabah yaralandığında, öğleden sonra veya akşam42'deki yaralanmaya kıyasla daha hızlı yara kapanması ve daha fazla hücre bölünmesi gözlenir. Yara iyileşmesi üzerine sirkadiyen etki deri de dahil olmak üzere diğer dokularda bildirilmiştir58,59. Bu modelde yaralama her zaman sabahları yapılır.

Bu modelde yaralanmaya karşı ortaya çıkan enflamatuar yanıt, etkili yara iyileşmesi için kritik olan hücresel ve moleküler olayların iyi karakterize edilmiş bir kaskadı olarak ilerler. Bu modelde aşınmaya bağlı inflamasyonda en iyi karakterize edilen hücresel oyuncular nötrofiller ve trombositlerdir. Nötrofiller, kornea aşınması bölgesine ilk müdahale edenlerdir; Yaralamadan sonraki 6 saat içinde kornea stromasında önemli düzeyde nötrofil tespit edilir. Nötrofiller, inflamasyona ve yara onarımına özgü bir süreç olan hücre kalıntılarının temizlenmesinden sorumludur60. Fagositik aktivitelerine ek olarak, nötrofiller vasküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF)61 gibi büyüme faktörleri içerir. VEGF, 62,63 yaralanmasını takiben kornea sinirlerinin rejenerasyonu için çok önemli bir nöro-rejeneratif faktördür ve ayrıca kornea epitel hücre bölünmesi 45,63 için de önemlidir. Limbusta nötrofil infiltrasyonu,40 saat yaralandıktan sonra ilk zirve 18 saatte ve ikinci tepe 30 saatte olmak üzere iki dalga halinde meydana gelir. Nötropenik fareler 37,40 kullanılarak, nötrofil ekstravazasyonu ve ardından kornea merkezine göçün kornea yarasının iyileşmesi için çok önemli olduğu gösterilmiştir. Geleneksel olarak hemostaz ve kan pıhtılaşmasının sürdürülmesinde çok önemli olduğu bilinmesine rağmen, trombositlerin kornea yarasının iyileşmesinde de önemli bir rolü vardır37. Trombositler, inflamasyona ve doku rezolüsyonuna katkıda bulunan çok sayıda mediatör içerir64,65. Trombositopenili farelerde, trombositlerin etkili kornea yara iyileşmesi için önemli olduğunu göstermek için bu model kullanılmıştır37.

Nötrofiller ve trombositler bu modelde en iyi karakterize edilen hücreler olmasına rağmen, gama delta T hücreleri, doğal öldürücü hücreler ve dendritik hücreler gibi bağışıklık hücrelerinin de bu model27,48 kullanılarak yaralanmaya karşı bağışıklık tepkisinde rol oynadığı gösterilmiştir. Stroma28,29'da doğal öldürücü hücre ekstravazasyonu ve gama delta T hücrelerinin iyileştirici epitel27'ye göçü bildirilmiştir. Bu model aynı zamanda kornea yarasının iyileşmesi sırasında immün hücre ekstravazasyonunun anahtarı olan adezyon moleküllerini tanımlamak için de kullanılmıştır. Lenfosit fonksiyonlu antijen-1 (LFA-1)32, CD1851 ve hücreler arası adezyon molekülü-1 (ICAM-1)47,49'un nötrofil ekstravazasyonu ve etkili kornea yarası iyileşmesi için çok önemli olduğu bu model kullanılarak gösterilmiştir. Yara kapandıktan sonra epitel retabakalaşması için kritik olan yaralanmaya yanıt olarak epitel hücre bölünmesi mitotik rakamlar kullanılarak değerlendirilir. Hücre bölünmesinin farklı aşamalarında kromozomal yoğunlaşma, çekirdeklere mitotik bir figür olarak bilinen karakteristik bir görünüm verir. Çekirdeğin DAPI boyaması, bu mitotik figürlerin görselleştirilmesini sağlar.

Fare kornea aşındırma yara modelinin dikkat çekici bir şekilde tekrarlanabilir olduğu kanıtlanmıştır ve etkili yara iyileşmesine katkıda bulunan hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, modelin klinik uygulanabilirliği ile ilgili sınırlamaları olduğunu belirtmek gerekir. Model ve sonuçları sadece basit, nüfuz etmeyen epitel sıyrıklarına uygulanabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, fiziksel veya kimyasal hakaretin neden olduğu nüfuz edici yaralardan kaynaklanan kornea yaralanmaları, özellikle yara insan korneasında yaralanma durumunda sıklıkla meydana geldiği gibi enfekte olursa, farklı yara iyileştirici kinetiği ve sonuçları ortaya çıkaracaktır. Bununla birlikte, fare kornea aşınma yara modeli, kornea yarasının iyileşmesini modüle eden inflamasyonun temel prensiplerini incelemek için mükemmel bir temel sağlar.

Burada açıklanan kornea yaralama protokolü basittir ve kolayca çoğaltılabilir. Kornea yarası iyileşme süreci ve ilişkili inflamatuar yanıt hakkındaki temel soruları araştırmak için yararlı bir araç sağlar. Yara iyileşmesi komplikasyonları ile ilişkili kornea patolojilerini anlamada yardımcı olma potansiyeli sadece bir başlangıçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Finansman: Destekleyen: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. ve R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) ve Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Sigma Xi'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Tıp Sayı 178 kornea yara iyileşmesi aşınma golf kulübü spud trefin
Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter