Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Abstract

Het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en is goed voor ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de externe positie is het hoornvlies echter zeer gevoelig voor een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot het verlies van corneatransparantie en uiteindelijke blindheid. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van corneatransparantie en brekingsvermogen. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte. In de richting van dit doel zijn murinemodellen van hoornvlieswonden nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de genezingsmechanismen van de hoornvlieswond die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Hier wordt een protocol beschreven voor het creëren van een centrale cornea-epitheliale slijtage bij muizen met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. In dit model wordt een cirkelvormige trephine met een diameter van 2 mm, gecentreerd over het hoornvlies, gebruikt om het wondgebied af te bakenen. De golfclubspud wordt met zorg gebruikt om het epitheel te debriden en een cirkelvormige wond te creëren zonder het hoornvliesepitheelkelmembraan te beschadigen. De resulterende ontstekingsreactie verloopt als een goed gekarakteriseerde cascade van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die van cruciaal belang zijn voor efficiënte wondgenezing. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekte te evalueren.

Introduction

Het hoornvlies is het transparante voorste een derde van het oog. Het hoornvlies heeft verschillende functies, waaronder het beschermen van de binnenste structuren van het oog en het vormen van een structurele barrière die het oog beschermt tegen infecties1. Wat nog belangrijker is, het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en levert ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog 2,3. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de naar buiten gerichte positie wordt het hoornvlies echter dagelijks blootgesteld aan een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot verstoring van de barrièrefunctie, verlies van transparantie en uiteindelijke blindheid. Verlies van hoornvliestransparantie is wereldwijd een belangrijke oorzaak van slechtziendheid 4,5. Cornea-schaafwonden zijn een veel voorkomende reden voor bezoeken aan de eerste hulp (ER), goed voor de helft van de ooggerelateerde gevallen die op de ER6 worden gepresenteerd. Meer dan 1 miljoen mensen lijden naar schatting jaarlijks aan ooggerelateerd letsel in de Verenigde Staten7. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van de transparantie en refractieve mogelijkheden. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens 8,9. Ook de toenemende populariteit van refractieve operaties plaatst een unieke traumatische uitdaging op het hoornvlies10. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte.

Daartoe zijn verschillende diermodellen van hoornvlieswondgenezing ontwikkeld 11,12,13,14,15. Murine-modellen van hoornvlieswondgenezing zijn nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de hoornvlieswondgenezingsmechanismen die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Verschillende soorten hoornvlieswonden zijn gebruikt bij het bestuderen van hoornvlieswondgenezing, elk geschikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van het wondgenezingsproces. De meest voorkomende soorten wondmodellen die worden gebruikt in hoornvlieswondgenezingsstudies zijn de mechanische en chemische wondmodellen. Chemische hoornvlieswonden, meestal met betrekking tot het creëren van alkalische brandwonden op het hoornvlies, zijn nuttig voor het bestuderen van hoornvlieszweren, opacificatie en neovascularisatie13. Mechanische hoornvlieswonden omvatten debridement (slijtage) wonden en keratectomiewonden 14,15,16. Een intact of gebroken cornea-epitheelkelkelmembraan definieert respectievelijk debridement- en keratectomiewonden. Bij debridementwonden blijft het epitheliale keldermembraan intact, terwijl bij keratectomiewonden het keldermembraan wordt doorbroken met penetratie meestal in het voorste stroma. Debridementwonden zijn het meest nuttig voor het bestuderen van re-epithelisatie, epitheelcelproliferatie, immuunrespons en zenuwregeneratie na hoornvlieswonden. Keratectomie wonden, aan de andere kant, zijn het meest nuttig voor het bestuderen van cornea littekens14,15.

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing te evalueren in de context van ziekte17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de Universiteit van Houston en Baylor College of Medicine. De richtlijnen die zijn uiteengezet in de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) over het gebruik van dieren in visie en oogheelkundig onderzoek werden gevolgd bij het hanteren en gebruiken van de muizen.

1. Voorbereiding

  1. Bereiding van fluoresceïne-oplossing
    1. Bereid 1% fluoresceïneoplossing door 10 mg natriumfluoresceïnezout op te lossen in 1 ml steriele zoutoplossing of steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Bereid natriumfluoresceïne-oplossing op de dag van gebruik of een dag ervoor om microbiële besmetting te voorkomen. Wanneer fluoresceïneoplossing een dag voor gebruik wordt bereid, bewaren bij 4 °C uit de buurt van licht. Wikkel buizen met aluminiumfolie om fotobleken te voorkomen.
    2. Verdeel de oplossing in aliquots die geschikt zijn voor gebruik in één experiment. Per muis per tijdstip wordt 1-1,5 μL fluoresceïneoplossing gebruikt. Gebruik de volgende formule om het aliquotvolume te berekenen dat geschikt is voor één experiment:
      Equation 1
      OPMERKING: Als bijvoorbeeld zes muizen worden bestudeerd in een enkel experiment met wondgrootte die op vijf tijdstippen wordt gecontroleerd, zou het volume aliquot dat geschikt is voor dat ene experiment zijn:
      Equation 2
  2. Bereiding van ketamine / xylazine cocktail voor anesthesie van muizen.
    1. Om 10 ml cocktail te bereiden, mengt u 2,0 ml ketamine (100 mg / ml) met 1,0 ml xylazine (20 mg / ml) en voegt u 7,0 ml steriel PBS toe. Bereid ketamine / xylazine cocktail een dag voor of op de dag van de operatie.
      OPMERKING: Alle oplossingen moeten bij kamertemperatuur worden gebruikt, tenzij anders vermeld.

2. Anesthesie

  1. Weeg de muis (8-12 weken oude C57BL/6 wildtype muizen) om de juiste hoeveelheid verdoving te bepalen om toe te dienen. Gebruik de tweehandige muisvergrendelingstechniek om muizen in bedwang te houden en te hanteren voor de injectie van het verdovingsmiddel18. Ketamine/xylazinecocktail intraperitoneaal (i.p.) toedienen in een eindconcentratie van 80 mg/kg ketamine en 8 mg/kg xylazine.
  2. Wacht tot volledige anesthesie is bereikt voordat u hoornvlieswonden op de muis uitvoert. Evalueer de diepte van de anesthesie door de pedaalreflex na het knijpen van de teen te beoordelen. Wanneer adequate anesthesie is bereikt, mag de muis niet bewegen bij het knijpen van de teen.
    OPMERKING: Omdat muizen snel lichaamswarmte verliezen tijdens anesthesie, is het belangrijk om een bron van warmte voor muizen te bieden om onderkoeling te voorkomen. Plaats muizen op een warmtebron (verwarmingskussen) tijdens anesthesie- en herstelfasen.

3. Creatie van hoornvlieswonden

  1. Wond alleen het rechter- of linkeroog. Zorg voor consistentie met het oog (d.w.z. links of rechts) dat gewond is bij het verplaatsen van muis naar muis.
    OPMERKING: Omdat schaafwonden de zenuwen van het hoornvlies beschadigen en de scherpte verminderen, kan het verwonden van beide ogen aanzienlijk ongemak en aantasting veroorzaken. Omdat pijnstillers het potentieel hebben om ontstekingsreacties te onderdrukken, kan het gebruik ervan een confounder zijn in bepaalde experimenten gericht op het begrijpen van hoornvliesontsteking. Het vermijden van pijnstillers in hoornvlieswondexperimenten werd goedgekeurd door onze Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
  2. Om de epitheliale hoornvlieswond te creëren
    1. Gebruik onder een ontleedmicroscoop de trephine met een diameter van 2 mm (zie figuur 1) om het midden van het hoornvlies af te bakenen, waarbij u het oog wijd open houdt met de duim en wijsvinger om de oogleden vast te houden. Draai de trephine voorzichtig om indruk te maken op het hoornvliesepitheel.
      OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat er geen overmatige druk wordt uitgeoefend bij het gebruik van de trephine, omdat dit kan leiden tot perforatie van het hoornvlies. Ook moet ervoor worden gezorgd dat de trephine centraal wordt geplaatst. De pupillen kunnen worden gebruikt als een oriëntatiepunt om het midden van het hoornvlies te lokaliseren.
    2. Houd onder een ontleedmicroscoop de stompe golfclubspud (zie figuur 1) op ongeveer 45° van het oppervlak van het hoornvlies binnen het gebied afgebakend met de trephine. Schraap het epitheel zorgvuldig en voortdurend binnen het afgebakende gebied met de spud om het epitheel te debrideren.
      OPMERKING: Oefen geen overmatige kracht toe in debridement, omdat dit ook corneaperforatie kan veroorzaken. De ogen van muizen kunnen tijdens het verwondingsproces opdrogen, waardoor debridement moeilijk wordt. Breng in een dergelijk geval steriel PBS aan op het oogoppervlak om een optimale hydratatie te behouden.

Figure 1
Figuur 1: 2 mm trephine en stompe golfclub spud. De trephine wordt gebruikt om een cirkelvormig gebied in het centrum van het hoornvlies af te bakenen en de golfclubspud wordt gebruikt om het epitheel binnen het afgebakende gebied te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Monitoring van wondsluiting en herepitheelvorming

  1. Pipetteer 1-1,5 μL 1% fluoresceïneoplossing op het gewonde oppervlak en beeld hoornvlies in met behulp van een digitale microscoop met een blauwe lichtbron.
  2. Verkrijg beelden binnen de eerste minuut van toevoeging van fluoresceïne-oplossing om verspreiding naar het omliggende epitheel te voorkomen, wat leidt tot overschatting van de wondgrootte. Gewonde hoornvliezen worden op specifieke tijdstippen (d.w.z. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h en 30 h) na verwonding in beeld gebracht.
    OPMERKING: Op alle tijdstippen wordt beeldvorming uitgevoerd onder anesthesie; ketamine/xylazine wordt gebruikt op het moment van verwonden, terwijl isofluraan op latere tijdstippen wordt gebruikt. Muizen worden individueel gehuisvest in afzonderlijke kooien voor de duur van de wondsluitingsmonitoring. Wanneer ze samen worden gehuisvest, hebben muizen de neiging om de ogen van de nestgenoot te likken, een gedrag waarvan is aangetoond dat het de wondgenezing in verschillende weefsels beïnvloedt19,20.
  3. Analyseer vastgelegde beelden, traceer het wondgebied met behulp van een beeldanalysesoftware. Het wondgebied voor elk tijdstip wordt uitgedrukt als een percentage van het oorspronkelijke wondgebied op 0 uur.

5. Immunofluorescentie beeldvorming en analyse

  1. Euthanaseer muizen door een IACUC-goedgekeurde methode (in dit geval een overdosis koolstofdioxide gevolgd door cervicale dislocatie) op de gewenste tijdstippen na het verwonden.
  2. Oogst oogbollen door zachtjes op de laterale canthus te drukken om de oogbol te verplaatsen met behulp van een irisgebogen schaar. Leid de schaar achter de oogbol om de oogzenuw stevig vast te pakken en knip vervolgens de zenuw door, waardoor de oogbol kan worden verwijderd.
  3. Bevestig elke oogbol in 1 ml 1x PBS met 2% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer in 1 ml 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
  4. Gebruik onder een ontleedmicroscoop een chirurgisch mes om een incisie te maken in de sclera, ongeveer 500 μm distale naar de limbus, en snijd vervolgens door de wereldbol. Verwijder met een tang voorzichtig de irisstof uit het hoornvlies en snijd vervolgens voorzichtig het sclerale weefsel weg, zorg ervoor dat de limbus intact blijft.
  5. Maak vier gedeeltelijke radiale sneden, elk ongeveer 1 mm lang, die zich uitstrekken van het perifere hoornvlies en kort van het midden stoppen om het hoornvlies af te vlakken.
  6. Permeabiliseren en blokkeren cornea's in 1 ml 2% runderserumalbumine (BSA) en 0,01% TritonX -100 in 1x PBS gedurende 15 minuten gevolgd door blokkering in 2% BSA in 1x PBS gedurende nog eens 45 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Incubeer hoornvliezen 's nachts bij 4 °C in een cocktail van direct gelabelde unieke fluorochroom geconjugeerde antilichamen bereid in 1x PBS met 2% BSA.
    OPMERKING: Antilichamen zijn gericht op het labelen van specifieke cellen en weefsels van belang. Endotheel, neutrofielen en bloedplaatjes zijn bijvoorbeeld gelabeld met respectievelijk anti-CD3121,22, anti-Ly-6G 23,24 en anti-CD41 25,26 antilichamen. 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) wordt toegevoegd aan de antilichaamcocktail om kernen te visualiseren.
  8. Was na de incubatie de hoornvliezen driemaal in 1x PBS gedurende 15 minuten elk.
  9. Monteer hoornvliezen op een microscoopglaasje in een druppel anti-fade fluorescentie montagemedium, bedek met een coverslip en beeld met de gewenste vergroting (4x tot 100x objectief) met behulp van een fluorescentielichtmicroscoop. Maak afbeeldingen van volledige dikte van het hoornvlies in verschillende regio's, zoals geïllustreerd in figuur 2A.
    OPMERKING: Het patroon van microscopische analyse geïllustreerd in figuur 2A wordt gebruikt voor het analyseren van specifieke regionale veranderingen in ontsteking en celdeling. Zowel DAPI- als Ly-6G-kleuring worden gebruikt om de extravasculaire neutrofielen te identificeren. Bij DAPI-kleuring hebben bolvormige neutrofielen een duidelijke hoefijzer- of donutvormige kern (figuur 2B).

Figure 2
Figuur 2: Corneabeeldvormingsstrategie en neutrofiele infiltratie na centrale slijtage. (A) Schematische weergave van een hoornvlies wholemount met negen microscopische velden over de diameter van het hoornvlies. Het grijze gebied vertegenwoordigt het oorspronkelijke wondgebied. De breedte van elk gebied is 500 μm. (B) Let op de verschillende hoefijzer- of donutvorm van neutrofiele kernen met DAPI-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 3 toont een transmissie-elektronenmicrograaf van een hoornvlieswond gemaakt met de stompe golfclubspud, waaruit blijkt dat het epitheliale keldermembraan inderdaad intact is na letsel.

Figure 3
Figuur 3: Epitheliaal keldermembraan blijft intact na cornea-abrasie. Transmissie-elektronenmicrograaf van een hoornvlieswond gemaakt met de stompe golfclubspud. De pijlpunten wijzen naar het keldermembraan onder het resterende epitheel rond de wond, terwijl de pijlen wijzen naar het keldermembraan in het ontdekte gebied. Dit toont de continuïteit van het keldermembraan van de niet-geasfalteerde delen van het hoornvlies, wat aantoont dat het keldermembraan intact blijft na debridement. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit protocol voor hoornvlieswonden is gebruikt om de wondgenezingsdynamiek uitgebreid te karakteriseren voor een 2 mm epitheliale schuurwond 27,28,29,30,31,32,33. Het vermogen om de snelheid van wondsluiting en re-epithelisatie in vivo te volgen, is een centraal onderdeel van dit model. Zoals weergegeven in figuur 4A, maakt het gebruik van fluoresceïneoplossing en een digitale microscoop met een blauwe lichtbron visualisatie van de wondgrootte mogelijk. In dit model wordt wondsluitingscontrole uitgevoerd op het moment van verwonding (0 uur), 12 uur, 18 uur, 24 uur en 30 uur na verwonding. Figuur 4B toont de kinetiek van wondsluiting gedurende 30 uur. Bij 8-12 weken oude C57BL/6 wild-type muizen zijn wondsluiting en herepitheelvorming meestal 24 uur na verwonding voltooid, zoals geïllustreerd in figuur 4B en een goed gereguleerde ontstekingsreactie is van fundamenteel belang voor efficiënte wondgenezing 34,35,36.

Figure 4
Figuur 4: Epitheliale wondsluiting werd geëvalueerd met behulp van fluoresceïnekleuring. (A) Representatieve beelden van fluoresceïnekleuring van de hoornvlieswond bij 0 h, 12 h, 18 h, 24 h en 30 h. In dit model is de wondsluiting meestal 24 uur na het verwonden voltooid. Let op het ontbreken van groene vlekken in het centrale hoornvlies bij 24 uur en 30 uur. (B) Wondsluitingskitiek die wijst op volledige wondsluiting met 24 uur na verwonding. De waarde op elk tijdstip wordt uitgedrukt als een percentage van het oorspronkelijke wondgebied (d.w.z. wondgebied bij 0 uur) (n ≥ 6). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De ontstekingsreactie op verwonding in dit model is goed gekarakteriseerd. De epitheliale schuurwond lokt een snelle ontstekingsreactie uit in de cornea limbale vasculatuur, voornamelijk gekenmerkt door vasodilatatie, bloedplaatjesexvasatie beperkt tot de limbus 37,38,39 en neutrofiele extravasatie met migratie naar het centrum van het hoornvlies 40. Figuur 5 toont de limbale vasculatuur van een niet-afgewikkeld hoornvlies met extravasculaire neutrofielen (figuur 5A) en een gewond hoornvlies met extravasculaire bloedplaatjes en neutrofielen (figuur 5B).

Figure 5
Figuur 5: Inflammatoire celbeeldvorming bij de limbus. Fotomicrografie van de cornea limbus toont kleuring voor de limbale bloedvaten met anti-CD31-antilichaam (weergegeven in rood), neutrofielen met anti-Ly-6G-antilichaam (weergegeven in groen) en bloedplaatjes met anti-CD41-antilichaam (weergegeven in blauw). (A) geen slijtage en (B) 30 uur na slijtage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In dit model wordt neutrofiele infiltratie in het hoornvlies beoordeeld in vijf verschillende regio's, zoals geïllustreerd in figuur 2A. Om deze verschillende regio's te bepalen, wordt een beeld van het volledige hoornvlies wholemount vastgelegd, waarbij de limbale vasculatuur met anti-CD31-kleuring wordt gevisualiseerd. De binnenste rand van het limbale gebied op elk bloemblad wordt gemarkeerd met behulp van de limbale vasculatuur als leidraad. De afstand van de binnenste rand van het limbale gebied van het ene bloemblad tot het andere in de horizontale (x) of verticale (y) richting wordt gemeten voor elke hoornvlies hele berg. Voor 8-12 weken oude C57BL/6 wild-type muizen is deze afstand ~3,7 mm. Deze afstand bestrijkt de perifere tot perifere regio's. Het midden van het hoornvlies wordt dan berekend als het punt dat overeenkomt met de helft van de horizontale of verticale diameter van de hele berg. Het paracentrale gebied is 500 μm links, rechts, omhoog of omlaag van het berekende midden. De andere velden zijn allemaal 500 μm van het voorgaande veld. Zowel DAPI- als Ly-6G-kleuring worden gebruikt om de extravasculaire neutrofielen te identificeren. Neutrofielentellingen in elk hoornvliesgebied uit de vier kwadranten worden gemiddeld en uitgedrukt als neutrofielen per veld.

Bloedplaatjesbeoordeling in dit model wordt alleen uitgevoerd bij de limbus; tijdens de genezing van de hoornvlieswond extravaseren en lokaliseren bloedplaatjes naar de limbus27,37. Het totale aantal bloedplaatjes aan de limbus wordt geteld en de tellingen worden uitgedrukt als bloedplaatjes/mm2 van het limbale gebied. De tellingen van de vier bloemblaadjes kunnen worden opgeteld of gemiddeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het doel van dit methodedocument was om een protocol te beschrijven voor het maken van een centrale cornea-epitheliale schuurwond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit muizenmodel is gebruikt om hoornvliesontsteking en de bijdrage ervan aan wondgenezing te bestuderen. Dit type model kan worden gebruikt om hoornvlieswondgenezingsmechanismen te bestuderen onder normale fysiologische omstandigheden en bij pathologieën 17,28,29,41,42. Het model is gebruikt om hoornvlieswondgenezing onder pathologische omstandigheden te onderzoeken, zoals blijkt uit een onderzoek naar verminderde cornea wondgenezing in een muismodel van door voeding geïnduceerde obesitas17. Een duidelijk voordeel van dit model is dat het een exacte (2 mm) reproduceerbare epitheliale wondgrootte creëert met een precieze centrale locatie zonder het keldermembraan te doorbreken. Dit model van hoornvlieswonden is eenvoudig en snel uit te voeren. Naast de stompe golfclub spud 29,39,43,44,45, de roterende braam (Algerbrush)38,46,47, en diamantblad 32,37,40,48,49,50,51 kunnen beide worden gebruikt om de schuurwond in dit model te maken. In de handen van een ervaren gebruiker is er geen wezenlijk verschil in de schuurwond die door beide gereedschappen wordt gecreëerd. Voor trainingsdoeleinden en in de handen van een beginner is het vaak gemakkelijker om reproduceerbare resultaten te bereiken met de stompe golfclubspud in vergelijking met de roterende braam en het diamantblad. De roterende braam (Algerbrush) vereist een delicate aanraking anders kan de roterende braam het epitheliale keldermembraan beschadigen. Dit is ook gemeld door andere onderzoekers52,53. Aan de andere kant laat de stompe golfclubspud consequent het epitheliale keldermembraan intact.

Om dit hoornvliesbewondenprotocol met succes te reproduceren en de daaropvolgende re-epithelisatie- en ontstekingsdynamiek te observeren, moeten dezelfde stam en leeftijdscategorie van de muis worden gebruikt en moeten de grootte en de diepte van de wond worden gecreëerd zoals hierboven beschreven. De cornea wondgenezingsdynamiek en tijdlijnen die in dit protocol worden beschreven, zijn voor de C57BL/6-muizenstam en worden mogelijk niet gedeeld als een andere muizenstam wordt gebruikt. Pal-Ghosh et al.54 rapporteerden variaties in het vermogen van C57BL/6 en BALB/c om cornea-epitheliale debridementwonden te genezen. Voor dezelfde hoornvlieswondgrootte zijn de sluiting van de hoornvlieswond en de re-epithelisatie langzamer bij BALB / c-muizen. De tijdlijn voor de voltooiing van de wondsluiting en de karakteristieke ontstekingsreactie die hier wordt beschreven, zijn voor een cirkelvormige wond met een diameter van 2 mm. Een langere voltooiingstijd van de wondsluiting wordt verwacht voor wonddiameters van meer dan 2 mm, terwijl een kortere tijd wordt verwacht voor wonddiameters van minder dan 2 mm. Ook wordt verwacht dat grotere hoornvlieswonden, vooral die dichter bij de limbus, een meer overdreven ontstekingsreactie zullen uitlokken, omdat er meer leukocyten in het hoornvlies worden gerekruteerd16. Wat nog belangrijker is, de wond moet worden beperkt tot het hoornvliesepitheel. Wonden die het epitheliale keldermembraan doorbreken of het hoornvliesstroma binnendringen, hebben meer tijd nodig om te genezen. Deze wonden worden ook geassocieerd met een veranderde ontstekingsreactie, neovascularisatie, myofibroblastvorming en littekenvorming55,56.

Bij elke stap moet voorzichtigheid worden betracht om microbiële infectie van het geschuurde hoornvlies te voorkomen. Microbiële infectie verandert de ontstekingsreactie en kan leiden tot ulceraties, littekens en verlies vanhet gezichtsvermogen 57. Om microbiële infectie van de wond te voorkomen, moeten altijd steriele hulpmiddelen en oplossingen worden gebruikt. Als er meerdere muizen tegelijk gewond raken, moet voor elke muis een steriele trephine worden gebruikt. Tussen de muizen door moet de golfclubspud worden gewassen in steriel PBS, gevolgd door desinfectie in 70% ethanol en opnieuw worden gewassen in steriel PBS. Als verwonding wordt uitgevoerd op extra muizen gedurende meerdere dagen, moet dit op hetzelfde tijdstip van de dag worden uitgevoerd. Dit is om het circadiane effect op wondgenezing en ontsteking te beheersen. Bij C57BL/6-muizen beïnvloedt het tijdstip waarop de wond wordt gemaakt de snelheid en kwaliteit van de genezing van hoornvlieswonden. Snellere wondsluiting en grotere celdeling worden waargenomen wanneer muizen 's ochtends gewond raken in vergelijking met verwondingen in de middag of avond42. Het circadiane effect op wondgenezing is gemeld in andere weefsels, waaronder de huid58,59. Verwonden in dit model wordt altijd 's ochtends uitgevoerd.

De resulterende ontstekingsreactie op wonden in dit model verloopt als een goed gekarakteriseerde cascade van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die van cruciaal belang zijn voor efficiënte wondgenezing. De best gekarakteriseerde cellulaire spelers in de door slijtage geïnduceerde ontsteking in dit model zijn neutrofielen en bloedplaatjes. Neutrofielen zijn de eerste responders op de plaats van cornea-slijtage; significante niveaus van neutrofielen worden gedetecteerd in het corneastroma binnen 6 uur na verwonding. Neutrofielen zijn verantwoordelijk voor het opruimen van celresten, een proces dat inherent is aan ontsteking en wondherstel60. Naast hun fagocytische activiteiten bevatten neutrofielen groeifactoren zoals vasculaire endotheelgroeifactoren (VEGF)61. VEGF is een cruciale neuroregeneratieve factor voor regeneratie van hoornvlieszenuwen naverwonding 62,63 en is ook belangrijk voor cornea-epitheelceldeling45,63. Neutrofiele infiltratie aan de limbus vindt plaats in twee golven met de eerste piek om 18 uur en de tweede piek om 30 uur na het verwonden van40. Met behulp van neutropene muizen37,40 is aangetoond dat neutrofiele extravasatie en daaropvolgende migratie naar het centrum van het hoornvlies cruciaal zijn voor de genezing van hoornvlieswonden. Hoewel traditioneel bekend is dat ze cruciaal zijn in het onderhoud van hemostase en bloedstolling, hebben bloedplaatjes ook een erkende sleutelrol bij de genezing van hoornvlieswonden37. Bloedplaatjes bevatten tal van mediatoren die bijdragen aan ontsteking en weefselafwikkeling64,65. Bij muizen met trombocytopenie is dit model gebruikt om aan te tonen dat bloedplaatjes belangrijk zijn voor een efficiënte genezing van de hoornvlieswond37.

Hoewel neutrofielen en bloedplaatjes de best gekarakteriseerde cellen in dit model zijn, is ook aangetoond dat immuuncellen zoals gamma delta T-cellen, natural killer-cellen en dendritische cellen betrokken zijn bij de immuunrespons op verwonding met behulp van dit model27,48. Natural killer cell extravasatie in het stroma 28,29 en migratie van gamma delta T cellen naar het helende epitheel27 zijn gemeld. Dit model is ook gebruikt om adhesiemoleculen te identificeren die essentieel zijn voor extravasatie van immuuncellen tijdens de genezing van hoornvlieswonden. Lymfocytenfunctie antigeen-1 (LFA-1)32, CD1851 en intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1)47,49 zijn allemaal cruciaal gebleken voor neutrofiele extravasatie en efficiënte hoornvlieswondgenezing met behulp van dit model. Epitheelceldeling als reactie op verwonding, wat van cruciaal belang is voor epitheliale herstratificatie na wondsluiting, wordt beoordeeld met behulp van mitotische cijfers. Chromosomale condensatie tijdens verschillende stadia van celdeling geeft de kernen een karakteristiek uiterlijk dat bekend staat als een mitotische figuur. DAPI-kleuring van de kern maakt visualisatie van deze mitotische figuren mogelijk.

Het hoornvliesslijtage wondmodel van muizen heeft bewezen opmerkelijk reproduceerbaar te zijn en heeft veel inzicht gegeven in de cellulaire en moleculaire mechanismen die bijdragen aan efficiënte wondgenezing. Het is echter vermeldenswaard dat er beperkingen zijn aan het model met betrekking tot de klinische toepasbaarheid ervan. Het model en de uitkomsten ervan zijn alleen van toepassing op eenvoudige, niet-penetrerende epitheliale schaafwonden. Zoals eerder opgemerkt, zullen hoornvliesletsels als gevolg van doordringende wonden veroorzaakt door fysieke of chemische belediging verschillende wondgenezingskitiek en -resultaten uitlokken, vooral als de wond geïnfecteerd raakt, zoals vaak voorkomt in het geval van verwondingen aan het menselijke hoornvlies. Dat gezegd hebbende, biedt het hoornvliesslijtagewondmodel van de muis een uitstekende basis voor het bestuderen van fundamentele ontstekingsprincipes die de genezing van hoornvlieswonden moduleren.

Het hier beschreven hoornvlieswondenprotocol is eenvoudig en gemakkelijk te reproduceren. Het biedt een nuttig hulpmiddel om fundamentele vragen over het hoornvlieswondgenezingsproces en de bijbehorende ontstekingsreactie te onderzoeken. Het potentieel om te helpen bij het begrijpen van hoornvliespathologieën geassocieerd met wondgenezingscomplicaties is nog maar het begin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiering: Ondersteund door: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., en R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), en Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health, of Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat's licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), Pt 2 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Geneeskunde Nummer 178 hoornvlies wondgenezing slijtage golfclub spud trephine
Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akowuah, P. K., De La Cruz, A.,… More

Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter