Summary
Denne protokol er designet til at give instruktionsinformation til klonisk formering af Cannabis sativa L. ved at implementere aeroponiske systemer. Den metode, der er beskrevet her, omfatter alle nødvendige forsyninger og protokoller for med succes at reproducere ønskelige morfologiske og kemiske egenskaber i slægten Cannabis.
Abstract
Denne protokol beskriver standardisering af en effektiv klonisk formering teknik af hamp ved hjælp af aeroponiske systemer. Primære skyde stiklinger blev fjernet fra to hamp sorter, opkaldt "Cherry Wine" og "Red Robin" (17-20% w / w CBD), der tjente som 'moderplante'. En auxin forløber (indol-3-butyrsyre) blev anvendt til at stimulere rodudviklingen i den basale del af de udskårne stiklinger forud for placering i systemet. Stiklinger blev let misted med næringsstof tåge løsning hver tredje dag til at yde ernæringsmæssig støtte som løsningen indeholder de væsentlige makronæringsstoffer, herunder kvælstof, fosfor, og kalium. Aeroponisk systemvandreservoire fastholdt et pH-interval mellem 5,0-6,0 og en vandtemperatur mellem 20-22 °C. En undervandsvandpumpe blev brugt til at levere vand til stiklinger. Skydespids stiklinger blev forsynet med 24 timers lys om dagen i 10 dage, indtil rodudviklingen fandt sted, hvorpå de rodfæstede stiklinger blev transplanteret til forskningsformål. Disse aeroponiske systemer har vist sig at generere ønskelige resultater for cannabis formering. Den metode, der er beskrevet her, lindrer potentielle tidsbegrænsninger, der opstår fra traditionelle metoder for at give mulighed for et mere effektivt middel til aseksuel formering af cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. er en årlig, dioecious, blomstrende plante klassificeret i familien Cannabaceae. Cannabinoider, der hovedsagelig produceres inden for kirteltrichomes placeret på det ydre epidermale lag af bractvæv på kvindelige blomsterstande1, bliver et stadig mere populært forskningsemne, primært på grund af deres gradvist anerkendte medicinske egenskaber. Cannabidiol (CBD) er den næstmest fremtrædende cannabinoid, der findes i Cannabis efter Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) og tilskrives et væld af medicinske fordele, herunder smertestillende egenskaber2, anti-beslaglæggelsesegenskaber3, antidepressive egenskaber4, hvilket reducerer risikoen for diabetes5 og behandling af forskellige søvnforstyrrelser6. På grund af de mange sundhedsmæssige fordele forbundet med metabolitter af Cannabis planten, der er en stigende efterspørgsel efter sin kommercielle skala produktion7. For at imødekomme denne efterspørgsel forbedres dyrkningsmetoder konstant og genopfindes for løbende at levere konsekvent plantemateriale af høj kvalitet til den nye cannabisindustri.
Udbredelsen af cannabis kan lettes på to måder: seksuel eller aseksuel reproduktion. Et eksempel på seksuel reproduktion er bestøvning af en kvindelig ægløsning med pollen fra en mands støvdrager resulterer i et frø, der kan spires. Frøspirering er en pålidelig dyrkningsmetode, der er blevet brugt til avls- og dyrkningsformål, hvor ønskelige fænotypiske træk vælges i forældrenes linjer for at forbedre kvaliteten af afkommet Cannabisplanter, herunder træk som tørketolerance, insektresistens, øget udbytte og øget styrke8 . Imidlertid er utilsigtet krydsbestøvning en iboende risiko, når man udfører seksuel reproduktion, hvilket forårsager uønskede afkom, hvilket fører til det potentielle tab af ønskelige træk eller en indførelse af uønskede træk. Et eksempel på denne utilsigtede bestøvning fremhæves af hampavlere, der modtager hampefrø bestøvet med THC-producerende pollen, hvilket resulterer i betydelige økonomiske tab på grund af de ikke-kompatible planter (>0,3% i alt THC w / w) 9. Derudover skal et feminiseret frø sås i stedet for et ikke-feminiseret frø, for at generere en afgrøde, der kun består af kvinder, hvilket kan føre til hermafroditisme og andre uønskede træk, der fører til økonomisk tab. For at overvinde begrænsningen af seksuel reproduktion af cannabis er aseksuel reproduktion blevet udbredt i kommercielle produktionsmodeller af Cannabis-industrien10.
Aseksuel reproduktion af cannabis kræver kun en enkelt plante, hvilket giver mulighed for multiplikation af en enkelt genotype, der giver mulighed for kommerciel produktion af planter, der bærer ønskelige agronomiske og farmaceutiske træk. En almindelig form for aseksuel Cannabis reproduktion er at skære og indsætte små portioner af en kvindelig plante i et jordløst substrat11, som er dækket af en fugtighed kuppel for at fremkalde roddannelse. Selvom denne metode har vist sig at være vellykket, er en fælles ulempe akkumuleringen af et højt fugtighedsniveau (normalt 80% eller højere) inde i kuplen, hvilket giver et ideelt vækstmiljø for svampepatogener, som kan være skadelige for nye, følsomme stiklinger. En anden form for aseksuel formering er mikropropagation ved hjælp af vævskultur, hvor sterile teknikker giver mulighed for formering af insekt, mikrobe og virusfrit Cannabis plantemateriale i begrænset rum12. Denne proces er imidlertid dyr, tidskrævende og kræver uddannede laboranter, som generelt er utilgængelige for store Cannabis-faciliteter.
Meget få offentliggjorte forskningsrapporter findes om kloning af cannabis. For at skabe grundlag for forståelsen af aseksuel reproduktion af cannabis til forskningsformål og industriel produktion havde denne undersøgelse til formål at påvise, at det var let og tilgængeligheden af at anvende aeroponiske systemer til klonisk formering af cannabis. Aeroponiske systemer er ideelle til aseksuel formering af cannabis, der konsekvent leverer næringsrigt vand til stiklinger, fremkalder tidlig roddannelse rettidigt og giver mulighed for at opretholde en plante på ubestemt tid, hvis det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af en moderplante til kloning
- Vælg en sund, kvindelig moderplante, der udviser ønskelige morfologiske og kemiske egenskaber, der er specifikke for den tilsigtede anvendelse.
- Lad moderplanten nå den passende størrelse (ca. 25 modne skud) til kloning (dvs. stiklinger).
- Tillad moderplanterne at forblive i det vegetative vækststadium (lys: mørk = 18 h:6 h) for at fremme skydevækst til fremtidig formering.
2. Konstruktion og forberedelse af aeroponisk system
- Begynd med at placere låget oven på beholderen (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Bor det ønskede antal huller i låget, samtidig med at der er tilstrækkelig plads (helst 3 cm) mellem hver.
- Placer vandpumpen (Materialetabel) i midten af beholderen.
- Hæld 7-8 L destilleret vand i beholderen, så pumpedysen forbliver ca. 2,5 cm over vandlinjen.
BEMÆRK: Dette sikrer, at den dykkede vandpumpe (Materialetabel) er i stand til at skubbe vand med tilstrækkelig kraft til at sprede sig over beholderlåget. Destilleret vand anbefales; Der kan dog også anvendes almindeligt postevand. - Sæt den passende mængde Rockwool terninger (3,81 cm) (Tabel over materialer) eller medier terninger valg i hver slot. Tænd pumpen og lad den køre i 24 timer.
BEMÆRK: Rockwool terninger foretrækkes på grund af deres "forankring" evne på de nyligt rodfæstede stiklinger, der hjælper med at holde planterne oprejst efter transplantation.
3. Valg og udslidning af passende skud
- Saml skud i nærheden af den apikale meristem ved hjælp af en steriliseret skalpel eller saks. Stiklinger er ~ 10 cm i længden, ideelt med flere knuder.
BEMÆRK: Klip stilken i en vinkel på 45°. Skæring i en 45 ° vinkel øger overfladearealet af den basale del af skæringen, hvilket giver mere plads til rodudvikling. Det er valgfrit at lave en lille slids (1-2 cm) i midten af 45° snittet for yderligere at øge overfladearealet. - Fjern alle blade undtagen blade til stede på de tre øverste noder.
- Dyp den nyligt udskårne skæring i rodeopløsningen, der indeholder indol-3-butyrsyre (IBA) (Materialetabel) ~ 2-5 cm op fra bunden af stammen til ~ 5 s.
- Sæt skæringen ind i midten af en Rockwool terning placeret i det aeroponiske system.
BEMÆRK: Skæredybden skal forblive ~1-2 cm fra bunden af Rockwool-kuben. - Spray de uforrodede stiklinger med næringsstoftågenopløsningen (Materialetabel) hver 3. dag.
- Skærlinger vokser med 18-24 timers lys om dagen med en fotosyntetisk fotonfluxtæthed (PPFD) på 100 μmol/m2/s ved 24-29 °C og 40-60% relativ luftfugtighed.
4. Vedligeholdelse af aeroponiske systemer og propagulesundhed
- Genopfyld systemet med vand ved en pH mellem 5,0- 6,0 hver 2-5 dag.
- Stiklinger (en tåge pr. skæring) let med næringstågenopløsningen (Materialetabel) hver 3. dag.
- Tilsæt 5 mL af hver næringsopløsning (Materialetabel) til reservoiret hver 3-5. dag.
BEMÆRK: Tilsætning af næringsstoffer får vandet til at være brunt og grumset. - Tilsæt 15 mL af alge- og bakterierensningsopløsningen, der indeholder hypochlorsyre (0,028%) pr. 10 L vand hver femte dag (Materialetabel).
5. Transplantation af propagule
- Vælg stiklinger med lange, hvide, fibrøse rødder.
BEMÆRK: Undgå stiklinger med brune, slimede og korte rodsystemer, da dette er en indikator for tilstedeværelsen af rodrot og normalt vil tage længere tid at akklimatere sig til det nye vækstmedium og kan bringe uønskede sygdomme. - Fjern forsigtigt Rockwool-terningen ud af systemet og udrede rødderne.
- Transplanter Cannabis propagules til 4 L planteskole pot fyldt med en nærende jord mix (Tabel over materialer).
BEMÆRK: Vanding anbefales straks for at forhindre, at rødderne tørrer ud.
6. Rengøring og opbevaring af aeroponisk system
- Når systemet ikke længere er i brug, vaskes med vand og rengøres med 70% ethanol eller et andet desinfektionsmiddel.
- Fjern filteret fra vandpumpen og skyl med vand for at fjerne snavs.
- Tør systemet ved at tørre det ned med papirhåndklæder eller en vaskeklud.
- Placer pumpen inde i karret med låget på og opbevar den, indtil det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at validere effektiviteten af det beskrevne aeroponiske system blev der fjernet i alt 10 og 12 sunde 14 cm lange skud fra henholdsvis moderplanterne, »Cherry Wine« og »Red Robin« (figur 1A, B). Efter at være dyppet i rodede induktionsmedier blev klonerne placeret i systemet (Figur 2A). Konstruktion og drift af et aeroponisk system vises som et skemadiagram i figur 2A.
Efter 2 dages akklimatation begyndte alle kloner at udvikle rødder i 3-7 dage og fuldt udviklede rødder 37 cm lange efter 10-14 dage på systemet, hvilket var tilstrækkeligt til at blive plantet til en jordfyldt gryde (Figur 2B,D). Figur 3 viser den gennemsnitlige længde af skud og rødder af hver sort. Skudlængden og rodlængden blev målt, før den blev overført til jorden. Den gennemsnitlige længde af skud og rødder var 24,8 cm ± 2,4 cm og 37,8 cm ± 2,5 cm for 'Cherry Wine' og 21,4 cm ± 2,1 cm og 39,7 cm ± 5,9 cm for henholdsvis 'Red Robin'. (figur 3A, B). Forskellene mellem de to sorter blev analyseret af tovejs ANOVA, efterfulgt af Tukeys multiple compassions test, der ikke viser nogen signifikante forskelle i skud- og rodlængder mellem de to sorter (n = 10-12, p < 0,05).
Figur 1: En sund moderplante, der genererer flere skud til kloningsudbredelse. (A) Modne moderplanter, "Cherry Wine" (forrest) og "Red Robin" (tilbage) på ~ 4 måneders vegetativ vækst, der udviser mange skud ideel til formering. (B) Omtrentlig længde (14 cm) for korrekt skyde excision for kloning Cannabis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Etablering af det aeroponiske system for formering af cannabisklonaler. (A) Skemadiagram, der illustrerer komponenterne i det aeroponiske system (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). B) Aeroponisk system, der er fuldt besat af kloner af "Cherry Wine". (C) Inde i aeroponiske system med kloner udviser rodvækst. (D) Sund rodvækst i Rockwool terning efter 10 dage i aeroponiske system. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skud og rodlængde målinger for "Cherry Wine" og "Red Robin" efter 10 dage i aeroponiske kloning system. A) En søjlegraf og (B) tabel, der repræsenterer længden af skydning og rod i de to hampsorter. Forskellene i skyde / rod længder mellem to sorter blev analyseret af to-vejs ANOVA, efterfulgt af Tukey's flere sammenligninger test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den stigende efterspørgsel efter cannabisplanter med konsekvent cannabinoidindhold er forskellige kloniske formeringsmetoder blevet udnyttet i Cannabisindustrien . Den aseksuel formering viser flere fordele i forhold til seksuelle metoder til storstilet, konsekvent produktion. En aeroponisk formering system er en modificeret version af en hydroponisk system, der udnytter en luftet næringsrige vand tåge til at give hurtig rod udvikling. Det beskrevne aeroponiske system består af tre kritiske trin, 1) generering af en sund kvindelig Cannabis 'mor' plante som en genetisk kilde til en ønsket fysisk / kemisk træk, 2) skære skud (apikale meristems) og behandling med rod induktion medier, der indeholder auxin forløber, IBA, og 3) akklimatisering af propagule i den ønskede planteskole pot.
Aeroponiske formering system tillader effektiv produktion af hamp kloner med klare fordele i forhold til forskellige formeringsmetoder. Det omfatter 1) tid og omkostningsbesparelser gennem mindre arbejdsfremkaldende sund, moden roddannelse så snart som 5 dage; 2) genetisk homogenitet - gør det muligt at producere genetisk identiske kloner, bortset fra genetiske variationer, for at imødekomme reproducerbare cannabisforskning og industriapplikationer; 3) ensartethed i store operationer; og 4) mindre sårbarhed over for mikrobielle patogener - opretholde et relativt lavt fugtighedsniveau i planternes øverste baldakin end det fugtighedsniveau, der er bygget inde i beholderen, hvor rodudviklingen forekommer.
Selv om aeroponiske system tilbyder en række fordele, der er et par begrænsninger, der bør behandles omhyggeligt under praksis. For det første, da alle næringsstoffer leveres hydroponisk, kan det let forurenes med alge-, svampe- og virale (f.eks. hop latent viroid) patogener, der fører til misdannelse af rodsystemet, som afbødes gennem regelmæssig behandling af antimikrobielt / svampe / viralt middel (r). For det andet kan den udbredte brug af en enlig moderfabrik være problematisk for produktionsanlæg. At have en enkelt genotypeklolinje som den eneste plante i en produktionsanlæg fører til risiko for hele afgrødetab, hvis denne genotype er modtagelig for et givet skadedyr eller patogen, der er til stede i dyrkningsfaciliteten. Det anbefales derfor at opretholde flere moderplanter fra forskellige slægter, der bruges til at udbrede produktionskloner med dette aeroponiske kloningssystem for at begrænse økonomisk tab fra et givet skadedyr eller patogen13. Det anbefales kun vegetativt at dyrke en moderplante i højst 6 måneder, før kloning af en ny moderplante til brug som fremtidig kilde til produktionskloner. Dette forhindrer tilgroede rødder, der kan føre til usunde moderplanter og lavere kloningssucceser samt tilgroede baldakiner, der kan huse skadedyr og patogener, som kan overføres til de formerede kloner.
Aeroponic-systemet er industrielt skalerbart på en omkostningseffektiv måde. Figur 1 viser, at mindst 20 plantematerialer kan anbringes i en enkelt beholder (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Systemet kan let skaleres op til at holde mere end 50 planter pr enhed uden at øge omkostningerne på vand, næringsstoffer og elektricitet. De fordele, der er beskrevet her for den nuværende metode, giver en grund til at implementere det aeroponiske kloningssystem i industripraksis og forskningslaboratorier til tidseffektiv og ensartet udbredelse af cannabis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Institute of Cannabis Research på Colorado State University-Pueblo og Ministeriet for Videnskab og IKT (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon by (Hemp R &D og industrialisering, 2020-2021), Forfatterne ønsker også at takke Justin Henderson på Summit CBD for den generøse donation til "Cherry Wine" frø.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
