Summary
Protokollen beskriver fremstillingen av cellemembran affinitet kromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserte cellemembranfragmenter som inneholder funksjonelle transmembrane tropomyosin kinase reseptor B-proteiner. Bruken av CMAC-kolonner i identifisering av spesialiserte plantemetabolitter som samhandler med disse reseptorene og tilstede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.
Abstract
Kjemikalier syntetisert av planter, sopp, bakterier og marine hvirvelløse dyr har vært en rik kilde til nye narkotika treff og fører. Legemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, som vanligvis brukes i medisinsk praksis, har først blitt identifisert og isolert fra naturlige produkter. Imidlertid er identifisering og isolasjon av biologisk aktive spesialiserte metabolitter fra naturlige kilder en utfordrende og tidkrevende prosess. Tradisjonelt er individuelle metabolitter isolert og renset fra komplekse blandinger, etter utvinning av biomasse. Deretter testes de isolerte molekylene i funksjonelle analyser for å verifisere deres biologiske aktivitet. Her presenterer vi bruken av cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner for å identifisere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner tillater identifisering av forbindelser som samhandler med immobiliserte funksjonelle transmembranproteiner (TMPer) innebygd i deres opprinnelige fosfolipid bilayermiljø. Dette er en målrettet tilnærming, som krever å kjenne TMP hvis aktivitet man har til hensikt å modulere med den nylig identifiserte lille molekylmedisinkandidaten. I denne protokollen presenterer vi en tilnærming for å forberede CMAC-kolonner med immobilisert tropomyosin kinase reseptor B (TrkB), som har dukket opp som et levedyktig mål for narkotikaoppdagelse for mange nervesystemforstyrrelser. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for å montere CMAC-kolonnen med immobiliserte TrkB-reseptorer ved hjelp av nevroblastomcellelinjer som overekspresserer TrkB-reseptorer. Vi presenterer videre tilnærmingen til å undersøke funksjonaliteten til kolonnen og dens bruk i identifisering av spesialiserte plantemetabolitter som samhandler med TrkB-reseptorer.
Introduction
Botaniske blandinger er rike på farmakologisk aktive forbindelser1, og tjener som en god kilde for identifisering av nye legemiddeltreff og fører 2,3,4,5. Oppdagelsen av nye medisiner fra naturlige produkter har vært en fruktbar tilnærming, og mange for tiden godkjente legemidler stammer fra forbindelser som først ble identifisert i naturen. Det kjemiske mangfoldet av naturlige forbindelser er vanskelig å bli matchet av menneskeskapte biblioteker av kjemisk syntetiserte molekyler. Mange naturlige forbindelser samhandler med og modulerer menneskelige proteinmål og kan betraktes som evolusjonært optimaliserte legemiddellignende molekyler6. Disse naturlige forbindelsene er spesielt godt egnet for legemiddelledningsidentifikasjon til bruk i nevrologiske lidelser6. To av de for tiden FDA-godkjente legemidlene for håndtering av Alzheimers sykdom (AD) er avledet fra naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat av physostigmine)6. L-DOPA, for tiden det mest foreskrevne stoffet for Parkinsons sykdom, ble først identifisert fra den brede bønnen (Vicia faba L.) 7. Pergolide og lisurid, dopaminerge reseptoragonister er derivater av naturlige ergot alkaloider fra den parasittiske soppen Claviceps purpurea8. Reserpin, en alkaloid isolert fra indisk snakeroot (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var en av de første antipsykotika9. Nylig har dysregulert immunrespons og systemisk betennelse vært knyttet til utviklingen av mange nevrologiske plager, for eksempel stor depressiv lidelse eller nevrodegenerative sykdommer10. Et plantebasert kosthold sammen med andre livsstilsintervensjoner har vist seg å forbedre kognitive og funksjonelle evner hos eldre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler som tilhører triterpener og polyfenoler har vist seg å modulere inflammatoriske responser i både in vitro- og in vivo-modeller 12. For eksempel naturlige forbindelser som inneholder α,β-umettet karbonyl (f.eks. curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. sulforaphane) forstyrrer tolllignende reseptor-4 (TLR4) dimerisering som hemmer nedstrøms syntesen av proinflammatoriske cytokiner i en murin interleukin-3 avhengig pro-B cellelinje12,22 . Epidemiologiske bevis peker sterkt på at kostholdsfytokjemikalier, tilstede i komplekse matmatriser, også kan utgjøre en levedyktig kilde til nye legemiddelledninger6.
En av de største hindringene for identifisering av biologisk aktive molekyler tilstede i planteekstrakter, inkludert plantebasert mat, er kompleksiteten til de undersøkte prøvene. Tradisjonelt er de enkelte forbindelsene isolert, renset og deretter testet for biologisk aktivitet. Denne tilnærmingen fører vanligvis til identifisering av de mest tallrike og godt karakteriserte forbindelsene. Fenotypisk legemiddeloppdagelse nærmer seg uten et definert molekylært mål, avhengig av biostyrt fraksjonering av komplekse blandinger23. I denne tilnærmingen er et ekstrakt fraksjonert i mindre komplekse underfraksjoner som senere testes i fenotypiske analyser. Isolering og rensing av aktive forbindelser styres av biologisk aktivitet verifisert i analysen. Kunnskapen om identiteten til et bestemt legemiddelmål kan øke hastigheten på identifiseringen av farmakologisk aktive forbindelser som finnes i komplekse blandinger. Disse tilnærmingene er vanligvis basert på immobilisering av det molekylære målet, for eksempel et enzym, på en solid overflate, som magnetiske perler23. De immobiliserte målene brukes deretter i screeningforsøkene, noe som resulterer i isolering av forbindelser som samhandler med målet. Selv om denne tilnærmingen har blitt mye brukt i identifisering av forbindelser rettet mot cytosoliske proteiner, har den blitt mindre vanlig brukt i identifisering av kjemikalier som samhandler med transmembranproteiner (TMPer)23. En ekstra utfordring i immobiliseringen av TMPer stammer fra det faktum at proteinets aktivitet avhenger av samspillet med cellemembranfolipider og andre molekyler i bilayeren som kolesterol23,24. Det er viktig å bevare disse subtile interaksjonene mellom proteiner og deres innfødte fosfolipid bilayermiljø når de prøver å immobilisere transmembranmålet.
I cellulær membran affinitet kromatografi (CMAC) cellemembran fragmenter, og ikke renset proteiner, er immobilisert på kunstig membran (IAM) stasjonære fase partikler23. IAM stasjonære faser fremstilles ved å binde fosfatidylkolinanaloger kovalent på silika. Nylig er det utviklet nye klasser av IAM stasjonære faser der gratis amin- og silanolgrupper er end-capped (IAM. Pc. DD2 partikler). Under CMAC kolonner forberedelse cellemembran fragmenter er immobilisert på overflaten av IAM partikler gjennom adsorpsjon.
CMAC-kolonner har blitt brukt til å immobilisere forskjellige klasser av TMPer, inkludert ionkanaler (f.eks. nikotinreseptorer), GPCR-er (f.eks. opioidreseptorer), proteintransportører (f.eks. p-glykoprotein), etc.24. De immobiliserte proteinmålene har blitt brukt i karakteriseringen av farmakodynamikk (f.eks. dissosiasjonskonstant, Kd) eller å bestemme bindende kinetikk (kpå og koff) av små molekylligander som samhandler med målet, samt i prosessen med identifisering av potensielle nye legemiddelledninger tilstede i komplekse matriser24 . Her presenterer vi utarbeidelsen av CMAC-kolonner med den immobiliserte tropomyosin kinase reseptoren B (TrkB), som har dukket opp som et levedyktig mål for narkotikaoppdagelse for mange nervesystemforstyrrelser.
Tidligere studier viste at aktiveringen av den hjerneavledede nevrotrofiske faktoren (BDNF)/TrkB-banen er forbundet med forbedring av visse nevrologiske plager, som AD eller stor depressiv lidelse 25,26,27,28. Det ble rapportert at BDNF nivåer og dens reseptor TrkB uttrykk nedgang i AD, og lignende reduksjoner svekke hippocampal funksjon i dyremodeller av29 e.Kr. Reduserte nivåer av BDNF ble rapportert i serum og hjerne hos AD-pasienter 30,31,32. Tau overekspressjon eller hyperfosforylering ble funnet å nedregulere BDNF-uttrykk i primære nevroner og AD-dyremodeller 33,34,35. I tillegg ble BDNF rapportert å ha beskyttende effekter på β-amyloid indusert nevrotoksisitet in vitro og in vivo36. Direkte BDNF-administrasjon i rottehjernen ble vist å øke læring og hukommelse hos kognitivt svekkede dyr37. BDNF/TrkB fremstod som et gyldig mål for å forbedre nevrologiske og psykiatriske lidelser, inkludert28,38 e.Kr. Å målrette BDNF/TrkB-signalveien for utvikling av terapier i AD vil potensielt forbedre vår forståelse av sykdommen39. Dessverre kan BDNF selv ikke brukes som behandling på grunn av sine dårlige farmakokinetiske egenskaper og bivirkninger40. Små molekylaktivatorer av TrkB/BDNF-veier har blitt utforsket som potensielle TrkB-ligander 41,42,43. Blant testede små molekylagonister har 7,8-dihydroksyflavon (7,8-DHF), vist seg å aktivere BDNF /TrkB-banen 41,44,45,46. Et derivat på 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenyl-4H-krom-7,8-diyl bis (metylkarbamat)) er for tiden under vurdering som et mulig legemiddel for47 e.Kr. Nylig ble det vist at flere antidepressiva jobber gjennom direkte binding til TrkB og fremme BDNF-signalering, og understreker ytterligere viktigheten av å forfølge TrkB som et gyldig mål for å behandle ulike nevrologiske lidelser48.
Protokollen beskriver prosessen med å sette sammen funksjonell TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrollkolonne. Kolonnene er preget av et kjent naturlig produkt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. I tillegg beskriver vi prosessen med å screene komplekse matriser, ved hjelp av planteekstrakt som eksempel, for identifisering av forbindelser som samhandler med TrkB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur av SH-SY5Y nevroblastomceller (TrkB og TrkB-NULL (foreldre) cellelinjer)
MERK: Cellelinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) og SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 ble kjøpt fra Kerafast. Kultiverte celler brukes som en kilde til transmembranreseptorene som skal immobiliseres for fremstilling av CMAC-kolonner. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du får tak i cellemembranfragmenter og monterer funksjonelle CMAC-kolonner.
- Vokse cellene i et cellekulturmedium tilberedt ved å blande 450 ml RPMI-medier, 50 ml FBS, 5 ml penicillin/streptomycinoppløsning og 0,3 mg/ml genetikk (G418) i en 150 mm cellekulturrett ved 37 °C i en fuktig atmosfære med 5 % CO2.
2. Cellehøsting
- Bekreft cellesamtidighet (80%-90%) ved hjelp av et mikroskop, nådd etter 3-4 dager etter cellepasning.
- Aspirer cellekulturmediet ovenfra cellene og vask cellene to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS, 1x, pH 7,4). Fjern PBS og tilsett 2 ml lav konsentrert trypsin (0,25%) for å løsne celler.
- Virvle platen forsiktig for å dekke alle cellene jevnt med trypsinoppløsning og inkubere cellene i ca. 2 min ved 37 °C i en fuktig atmosfære med 5 % CO2. Tilsett 8 ml cellekulturmedium for å løsne celler og overføre frittliggende celler til et 50 ml konisk rør og legg det på is.
- Bruk et hemocytometer til å beregne antall celler (ca. 3 x 107 celler). Bland celleoppheng ved å pipettere opp og ned for å oppnå jevn celletetthet i blandingen. Plasser 10 μL cellefjæring under dekslene og tell cellene under et mikroskop ved hjelp av et 40x mål.
3. Celle homogenisering
- Forbered lagerløsninger av følgende proteasehemmere: benzamidin (200 mM), fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, 10 mM), og kommersielt tilgjengelige proteasehemmere cocktail (100x konsentrasjon) som inneholder 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfluoridhydroklorid (AEBSF), aprotinin, bestatin og leupeptin.
FORSIKTIG: PMSF skal kun håndteres inne i avtrekkshetten.- Forbered benzamidin lagerløsning (200 mM) ved å oppløse 120 mg benzamidin i 5 ml ultrarent deionisert vann. Oppbevars ved 4 °C og brukes innen en dag. Forbered løsningen på nytt før hver bruk (anbefales).
- Forbered PMSF lagerløsning (10 mM) ved å oppløse 0,017 g PMSF i 10 ml etanol. Oppbevars ved - 20 °C.
- Forbered proteasehemmercocktail (100x) ved å oppløse kommersielt tilgjengelig proteasehemmerblanding i 1 ml ultrarent deionisert vann. Bland grundig og aliquot 200-300 μL av cocktailen og oppbevar ved - 20 °C før bruk.
- Forbered ATP-lagerløsning (100 mM) ved å oppløse 55,114 mg ATP disodium salthydrat i 1 ml deionisert ultrarent vann. Bland grundig og aliquot 100 μL av blandingen og oppbevar ved - 20 °C før bruk.
- Forbered buffer ved å oppløse 3,03 g tris (hydroksymetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g natriumklorid (NaCl, 100 mM), 0,22 g kalsiumklorid vannfri (CaCl2, 3 mM), 0,2 g magnesiumklorid heksahydrat (MgCl2, 2 mM) og 0,19 kaliumklorid (KCl, 5 mM) i 500 ml ultrapure deionisert vann.
- Forbered homogeniseringsbuffer ved å blande 17,3 ml av bufferen som er utarbeidet i trinn 3,3 med 0,3 ml (3 mM) benzamidinbestandsløsning, 0,2 ml (0,1 mM) PMSF-lagerløsning, 0,2 ml proteasehemmercocktailblanding, 20 μL (100 μM) ATP-lagerløsning, 2 ml (10 %) glyserol og 0,029 g (5 mM) EDTA (tabell 1). Juster pH til 7,4 ved hjelp av saltsyreoppløsning.
- Snurr ned cellene som høstes i trinn 2,3 ved 4 °C i 5 minutter ved 400 x g. Fjern supernatanten og vask den gjenværende cellepelleten med 10 ml iskald PBS (1x, pH 7,4). Snurr ned cellene igjen ved 4 °C i 5 minutter ved 400 x g.
- Kast supernatanten og erstatt den med 20 ml homogeniseringsbuffer utarbeidet i trinn 3.4. Plasser det koniske røret på isen.
- Overfør cellefjæringen til en 40 ml Dounce homogenisator vevskvern og legg den på is. Homogeniser suspensjonen manuelt, på is, ved hjelp av 40 opp-og-ned pestle slag. Overfør homogenisert cellefjæring til et 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger homogenatet ved 4 °C i 7 minutter ved 400 x g. Kast pelletsen og overfør supernatanten til et nytt konisk rør og sentrifuger den ved 4 °C i 30 minutter ved 47900 x g. Lagre cellemembranpellet og kast supernatanten.
4. Cellemembran solubilisering
- Forbered løsningsbuffer ved å blande 8,7 ml bufferløsning i trinn 3.3 med 0,1 ml (0,1 mM) PMSF-lagerløsning, 0,15 ml benzamidinbestandsoppløsning, 0,1 ml proteasehemmercocktail, 10 μL (100 μM) ATP-lageroppløsning, 1 ml (10 %) glyserol og 0,2 g (2 %) natrium kolat (tabell 2).
- Overfør solubiliseringsbufferen inn i det koniske røret med cellemembranfragmenter oppnådd i trinn 3.8 og resuspend pellet. Roter den resulterende blandingen ved 150 o/min ved 4 °C i 18 timer.
MERK: På dette tidspunktet kan eksperimentet settes på pause for nattcellemembranpellet-solubilisering.
5. Immobilisering av cellemembran på IAM. Pc. DD2 partikler
- Etter 18 timer, sentrifuger solubiliseringsblandingen ved 4 °C i 30 minutter ved 47900 x g.
- Oppbevar supernatanten og kast pelletsen. Tilsett 100 mg IAM. Pc. DD2 partikler, til supernatant, virvel og rotere den resulterende suspensjon blanding ved 150 rpm ved 4 °C i 1 time.
- For å lette immobiliseringen av cellemembranfragmenter på IAM. Pc. DD2-partikler går videre til dialysetrinnet som beskrevet nedenfor.
- Forbered dialysebuffer i 4 L ultrarent avionisert vann ved å tilsette 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,0,5 06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) og 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabell 3).
MERK: PMSF er ikke løselig i vann, oppløs det derfor først i små mengder etanol og tilsett deretter sakte inn i begeret med bufferen. - Juster pH til 7,4 med saltsyreoppløsning. Plasser bufferen ved 4 °C i minst 1 time før du går videre til dialysetrinnet.
- Forbered dialyserør ved å kutte 10 cm cellulosemembrandialyseslange (10 K MWCO, 35 mm) og overfør suspensjonen som inneholder IAM. Pc. DD2-partikler og cellemembranfragmenter i dialyserøret. Bruk dialyserørklemmer for å lukke begge ender av dialyserøret.
- Plasser dialyserøret som inneholder IAM. Pc. DD2 stasjonær fase i dialysebufferen og dialyze ved 4 °C i 24 timer under forsiktig omrøring.
- Etter 24 timer plasserer du dialyseslangen i den nylagde dialysebufferen og fortsetter dialysen i ytterligere 24 timer.
- Forbered dialysebuffer i 4 L ultrarent avionisert vann ved å tilsette 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,0,5 06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) og 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabell 3).
6. CMAC kolonne pakking
- Klargjør ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) som skal brukes til å vaske IAM. Pc. DD2-partikler og i kolonnekarakteriseringseksperimenter ved å oppløse 0,7708 g ammoniumacetat i 1 L ultrarent deionisert vann. Juster pH til 7,4 med saltsyreoppløsning.
- Etter 48 h dialyse, fjern dialyserøret fra dialysebufferen og overfør innholdet i dialyserøret til et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger blandingen ved 4 °C i 5 minutter ved 400 x g. Kast supernatanten og vask den gjenværende pellet tre ganger med 10 ml ammoniumacetatbuffer, sentrifuger blandingen ved 4 °C i 5 minutter ved 400 x g, etter hver vask.
- Etter den tredje vasken, resuspend den gjenværende pellet i 1 ml ammoniumacetatbuffer. Bland den grundig og bruk den resulterende slurryen til å pakke 5/20 glasskolonnen for å gi CMAC kromatografikolonne.
- For å pakke kolonnen, plasser først et bunnfilter som tidligere var gjennomvåt med ammoniumacetatbuffer, i filterholderen. Monter filterholderen i glasssøylen og skru søylehetten for å feste holderens posisjon. Plasser søylen vertikalt i en fingerklemme og fest den i labstativet. Plasser et beger under kolonnen.
- Ved hjelp av en enkeltkanals pipettor overføres et lite volum av slammet oppnådd i trinn 6.4 inn i glasskolonnen. Hell materialet sakte, hold pipettespissen mot glasssøyleveggen. La emballasjematerialet slå seg ned før du heller et nytt volum slurry.
- For å øke hastigheten på pakkeprosessen, fjern bufferen fra over den stasjonære sengen ved hjelp av en mikropipette mellom hvert trinn. Gjenta disse trinnene til 1 ml av slammet er pakket.
- Plasser et toppfilter og skru adapterenheten slik at det ikke er noen gjenværende buffer over den stasjonære fasen, som vist i figur 1. Fest plasseringen av adapterenheten med adapterlåsen.
- Koble kolonnen til en HPLC-pumpe (Liquid Chromatography) med høy ytelse, sett strømningshastigheten til 0,2 ml/min, og vask kolonnen over natten med ammoniumacetatbuffer. Kolonnen er nå klar for karakteriseringstrinnet. Oppbevar søylen ved 4 °C til bruk.
MERK: For lengre lagring (kolonne som ikke brukes på mer enn en uke) kjør kolonnen med 0,05% natriumazidoppløsning i ammoniumacetatbuffer og oppbevar ved 4 °C.
FORSIKTIG: Natriumazid er svært giftig når det inntas oralt eller absorberes gjennom huden; Den må kun håndteres under avtrekkshetten. Sørg for å bruke labjakke, vernebriller og hansker (nitril foretrukket) når du arbeider med natriumazid.
7. KARAKTERISERING av CMAC-kolonner
- Konfektmikroskopi og BDNF-binding
- Forbered IAM. Grunnfond. DD2 stasjonære fasepartikler med immobiliserte cellemembranfragmenter hentet separat fra SH-SY5Y nevroblastomceller som overekspresserer TrkB- og SH-SY5Y TrkB-NULL-celler ved å følge instruksjonene fra trinn 1 til trinn 6.4.
- For prøver som vil bli inkubert med BDNF før antistofffarging, forberede BDNF lagerløsning ved å oppløse 10 μg BDNF i 100 μL ultrarent deionisert vann. Oppbevar oppløsningen ved -20 °C.
- Overføring i separate 1,5 ml mikrocentrifugerør, 100 μL aliquot av IAM. Pc. DD2-søylepakningsmateriale med immobiliserte SH-SY5Y Neuroblastoma-celler som overekspresserer TrkB og 100 μL aliquot av IAM. Pc. DD2-kolonnepakningsmateriale med immobilisert SH-SY5Y TrkB-NULL-celler suspendert i ammoniumacetatbuffer.
- Tilsett 390 μL ammoniumacetatbuffer, 10 μL BDNF lagerløsning og 0,5 μL ATP-lagerløsning (fremstilt i trinn 3.2) i hvert rør og inkuber i 1 time ved romtemperatur med gynging.
- For prøver som ikke vil bli inkubert med BDNF før antistofffarging, overfør 100 μL aliquot av IAM. Pc. DD2 kolonne pakking materiale med immobilisert SH-SY5Y Neuroblastoma celler overekspresserende TrkB suspendert i ammoniumacetat i 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
- Tilsett 400 μL ammoniumacetatbuffer og 0,5 μL ATP-lagerløsning (fremstilt i trinn 3.2) i hvert rør og inkuber i 1 time ved romtemperatur med gynging.
- Snurr prøvene som er tilberedt i trinn 7.1.2 og 7.1.4 ved 4 °C i 1 min ved 10 000 x g , og kast supernatanten.
- Vask de resulterende pelletsene med 500 μL ammoniumacetatbuffer i 10 min og spinn igjen ved 4 °C i 1 min ved 10 000 x g og kast supernatanten.
- Til hver av pelletsene, tilsett 220 μL ammoniumacetatbuffer, 25 μL 10% normalt geitserum og 5 μL primær anti-BDNF antistoff. Inkuber i et kaldt rom (4 °C) over natten med gynging.
- Når inkubasjonstrinnet er fullført, spinner du blandingen i 1 min ved 10 000 x g ved 4 °C og kaster den overnaturlige.
- Vask den resulterende pelletsen 3 ganger med ammoniumacetatbuffer som inneholder 1% mildt vaskemiddel (f.eks. natrium cholate) i 10 min og spinn blandingene i 1 min ved 10.000 x g ved 4 °C og kast supernatanten.
- Forbered sekundær antistoffløsning ved å blande 900 μL ammoniumacetatbuffer, 100 μL 10% normalt geitserum og 1 μL fluorofor-konjugert sekundært antistoff (1:1000 fortynning). Tilsett 300 μL sekundær antistoffoppløsning til hver av pelletsene oppnådd i trinn 7.1.9. og inkubere over natten ved 4 °C med gynging.
- Snurr blandingen ved 10.000 x g i 1 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Vask den resulterende pelletsen 3 ganger med ammoniumacetatbuffer som inneholder 1% mildt vaskemiddel (f.eks. natrium cholate) i 10 min og spinn blandingen i 1 min ved 10.000 x g ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspend de resulterende pellets i 50 μL ammoniumacetatbuffer. Legg 20 μL av hver av blandingene på et lysbilde og dekk med en deksleslip.
- Bilde av IAM. Pc. DD2-partikler med immobiliserte cellemembranfragmenter ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop med eksitasjon ved 488 nm og utslipp ved 520 nm generert ved hjelp av et solid state lasersystem. Bruk et 20x mål med en NA på 0,75 og WD på 0,35 mm.
- Frontal affinitetskromatografi som bruker 7,8-DHF som markørligand
- Koble en CMAC-kolonne til et HPLC-system med en diode-array detektor og/eller massespektrometer.
- Forbered 500 ml 1 mM oppløsning på 7,8-DHF i ammoniumacetatbuffer som inneholder 5% metanol.
- Pump konstant konsentrasjon av markørligaen (1 mM) gjennom CMAC-kolonnen ved 0,4 ml/min strømningshastighet ved romtemperatur. Overvåk elutionprofilen ved hjelp av enten en diode array detection (DAD) (bølgelengde 254 nm) detektor eller massespektrometer (bruk enkeltionovervåkingsmodus; m / z 253 i negativ ioniseringsmodus).
- Etter fullføring av løpet utføre over natten vaske ved å kjøre ammonium acetat buffer gjennom kolonnen.
- Gjenta trinn 7.2.2. - 7.2.4. ved hjelp av forskjellige konsentrasjoner av markørligen (750 nM, 500 nM, 300 nM), vaske kolonnene over natten etter hver kjøring. Bruk frontal affinitetskromatografi til å beregne ligand Kd, som gjennomgått i detalj, andre steder. 24.51
- Forskyvningsstudier med Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) ekstrakt
- Forbered 500 ml 500 nM oppløsning på 7,8-DHF i ammoniumacetatbuffer som inneholder 5% metanol og 0,2% vandig gotu kola ekstrakt (10 mg / ml).
- Pump konstant konsentrasjon av merketlevnde (500 nM) med ekstraktet gjennom kolonnen ved 0,4 ml / min strømningshastighet ved romtemperatur. Overvåk elutionprofilen enten ved hjelp av en DAD-detektor (bølgelengde 254 nm) eller et massespektrometer (bruk enkeltionovervåkingsmodus; m/z 253 i negativ ioniseringsmodus).
- Etter fullføring av løpet utføre over natten vaske ved å kjøre ammonium acetat buffer gjennom kolonnen.
- Plott elution profilene for 500 nM 7,8-DHF og den som er oppnådd etter å ha kjørt løsningen med gotu kola ekstrakt for å inspisere for markør ligand forskyvning.
8. Mangler topp kromatografi tilnærming for å identifisere potensielle TrkB bindemidler fra gotu kola ekstrakt
- Fraksjonering av gotu kola-ekstrakt på CMAC-kolonner
- Koble CMAC TrkB- og TrkB-NULL-kolonnene separat til et HPLC-system og injiser 50 μL av det vandige gotu kola-ekstraktet (10 mg/ml) på hver av kolonnene. Pumpe ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) som inneholder 5% metanol gjennom kolonnen ved 0,4 ml / min strømningshastighet ved romtemperatur.
- Samle brøker separat fra CMAC TrkB- og TrkB-NULL-kolonner som følger: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
- Frys og lyofiliser de oppnådde fraksjonene. Resuspend lyofiliserte fraksjoner i 50 μL metanol før du går videre til ultraytelses væskekromatografi og massespektrometrianalyse.
- Ultra-ytelse flytende kromatografi quadrupole tid-of-flight masse spektrometri (UPLC-QTOF-MS) analyse av gotu kola CMAC fraksjoner
- Analyser alle brøkene som er oppnådd i punkt 8.1.3. ved hjelp av et massespektrometer kombinert med et UPLC-system (UPLC-MSE-analysemodus ). Analyser brøkene ved hjelp av en C18-kolonne (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) med en C18 VanGuard-forkolonne (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
- Elute kolonnen ved hjelp av følgende gradient løsninger med en strømningshastighet på 0,3 ml / min med mobil fase A (vann med 0,1% maursyre) og B (acetonitril med 0,1% maursyre): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84 % A 16 % B, 5,0 min 80 % A 20 % B, 7,0 min 75 % A 25 % B, 10.0 min 65% A 35% B, 20.0-24.0 min 1% A 99% B, 25.0-29.0 min 99% A 1% B.
- Sett injeksjonsvolumet for hver prøve til 3 μL. Utfør MSE i oppløsningspositive og negative ionmoduser, med kollisjonsenergi ved 4V for lav energi og 20-35 V for høy energi.
- Bruk følgende ESI-kildeforhold i positiv iioniseringsmodus: kapillærspenning 1,5 kV, prøvetakingskjegle 40 V, kildeforskyvning 80, kildetemperatur 100 °C, desolvasjonstemperatur 350 °C, kjeglegassstrøm 38,0 l/t, desolvasjonsgass 400 l/t.
- Bruk følgende ESI-kildeforhold i negativ iioniseringsmodus: kapillærspenning 1,45 kV, prøvetakingskjegle 40 V, kildeforskyvning 80, kildetemperatur 110 °C, desolvasjonstemperatur 300 °C, kjeglegassstrøm 50,0 l/t, desolvasjonsgassstrøm 652 l/t.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen ble to CMAC kromatografiske kolonner montert: en med de immobiliserte SH-SY5Y nevroblastomcellemembranfragmentene med overekspressert TrkB og en med SH-SY5Y TrkB-NULL cellemembranfragmenter. Den korrekt monterte CMAC-kolonnen presenteres i figur 1 , og trinnene som er involvert i immobilisering av cellemembranfragment, presenteres i figur 2.
Siden immobilisering av TrkB reseptorer på IAM. Pc. DD2 kromatografisk stasjonær fase hadde ikke blitt forsøkt før, den vellykkede immobiliseringen av reseptorene ble bekreftet av antistofffarging og frontal affinitetskromatografi ved hjelp av en markørligand: 7,8-DHF. En skjematisk fremstilling av antistofffargingseksperimentet er presentert i figur 2. Cellemembranfragmenter hentet fra nevroblastomcellelinjen som overekspresserte TrkB-reseptorer og cellemembranfragmenter fra foreldrecellelinjen uten TrkB-reseptorer (TrkB-NULL)) ble immobilisert på IAM. Pc. DD2-partikler som bruker den optimaliserte protokollen. Deretter ble partiklene med immobiliserte cellemembranfragmenter inkubert med BDNF (fysiologisk ligand) og deretter med primære og fluorescerende sekundære antistoffer (figur 2). Iam. Pc. DD2-partikler med immobiliserte neuroblastom TrkB cellemembranfragmenter og i nærvær av BDNF resulterte i fluorescerende merkede partikler (figur 3C). Ingen fluorescens (med unntak av svak bakgrunnsfluorescens) ble observert da TrkB-NULL cellemembran innkapslede IAM-partikler ble undersøkt (figur 3A) eller når ingen BDNF ble brukt ved TrkB-cellemembran innkapslede IAM-partikler (figur 3B).
For å karakterisere bindingen av en liten markørligand (7,8-DHF) til de immobiliserte TrkB-reseptorene ble frontal affinitetskromatografi utført med forskjellige konsentrasjoner på 7,8-DHF. Et typisk kromatogram med økende konsentrasjoner på 7,8 DHF på en funksjonell CMAC-kolonne er presentert i figur 4. Spesifikk binding på 7,8-DHF til immobilisert TrkB ble bekreftet av konsentrasjonsavhengige reduksjoner i oppbevaringstiden til markørligaen. Resultater av frontaffinitetskromatografi oppnådd på en ikke-funksjonell CMAC-kolonne er presentert i figur 5. Mangelen på konsentrasjonsavhengige endringer i oppbevaring av markørligaden indikerer det mislykkede forsøket i CMAC-preparatet.
Forbindelser som injiseres i CMAC-kolonnen, samhandler ikke bare spesifikt, men kan også ikke-spesifikt samhandle med IAM. Pc. DD2 partikler, fosfolipid bilayer av immobiliserte cellemembran fragmenter, og andre proteiner tilstede i bilayer. For å utelukke forbindelser som ikke spesifikt samhandler med CMAC-kolonnen under prosessen med screening av komplekse ekstrakter for TrkB-bindemidler, er det viktig å forberede CMAC negativ kontrollkolonne ved å immobilisere cellemembranfragmenter av foreldrecellelinjen som ikke uttrykker det målrettede proteinet (i dette tilfellet TrkB-NULL). Resultater av frontaffinitetskromatografi oppnådd på en negativ CMAC TrkB-NULL-kolonne er presentert i figur 6.
Funksjonelle CMAC-kolonner kan brukes til forskjellige formål, for eksempel karakterisering av det målrettede proteinet, studier av interaksjoner mellom individuelle forbindelser med de immobiliserte målene (f.eks. oppnå dissosiasjonskonstant, Kd) eller bestemme bindende kinetikk (kpå og kav) etc.24. Kolonnene kan også brukes til å screene komplekse prøver, for eksempel planteekstrakter for tilstedeværelse av forbindelser som binder seg til TrkB-reseptorer, og inneholder derfor potensielt molekyler som fungerer som TrkB-agonister eller antagonister. For å bekrefte om et ekstrakt potensielt inneholder forbindelser som samhandler med de immobiliserte reseptorene, utføres et enkelt forskyvningseksperiment. Resultatet av konkurranseeksperimentet utført med gotu kola ekstrakt og 500 nM på 7,8-DHF på en funksjonell TrkB-kolonne presenteres i figur 7. Tilsetningen av 0,2% vandig gotu kola ekstrakt (10 mg / ml) resulterte i en betydelig reduksjon på 7,8-DHF oppbevaring som indikerer tilstedeværelsen av konkurrerende ligand (er) for den agonistiske bindingsstedet. Resultatet av forskyvningseksperimentet utført på CMAC negativ TrkB-NULL-kolonnen er presentert i figur 8. Mangelen på reduksjon av 7,8-DHF oppbevaring på den kolonnen bekrefter ytterligere mangelen på funksjonelle TrkB-reseptorer på CMAC TrkB-NULL-kolonnen.
For å identifisere spesialiserte metabolitter som spesifikt samhandler med de immobiliserte målene, brukes CMAC-kolonner i en tilnærming som kalles manglende toppkromatografi52 etter forskyvningseksperimentet. I denne tilnærmingen er et lite volum av det undersøkte ekstraktet kromatografert parallelt på kolonnen som inneholder det undersøkte immobiliserte målet og CMAC negativ kontrollkolonne. Disse to kolonnene er forskjellige i uttrykket av målet, derfor skyldes eventuelle forskjeller i oppbevaringsmønstrene til individuelle molekyler den spesifikke arten av interaksjoner med de undersøkte målene på CMAC-kolonnen som inneholder disse TMPene. Tidsbestemte brøker fra begge kolonnene samles, konsentreres og analyseres deretter på en C18-kolonne. De oppnådde kromatogrammer sammenlignes, og forbindelser representert av topper som på samme måte beholdes på begge kolonnene, er merket som ikke-spesifikt interagerende molekyler. Tilstedeværelsen av en topp i senere fraksjoner på CMAC-kolonnen med de immobiliserte reseptorene og mangelen på en topp som representerer den samme forbindelsen i tidlige brøkdeler av CMAC-negativ kolonne representerer spesifikk interaksjon av forbindelsen med det immobiliserte målet. Forbindelsene identifisert i dette trinnet kan målrettes mot isolasjon og videre testing, uten behov for å utføre biostyrt fraksjonering. Den manglende toppen kromatografi tilnærming ble brukt til å identifisere forbindelser spesielt samhandle med TrkB reseptorer fra gotu kola ekstrakt. Gotu kola ekstrakt ble fraksjonert på både TrkB og TrkB-NULL kolonner og forbindelser til stede i disse fraksjonene ble analysert ved hjelp av UPLC-QTOF-MS. Undersøkelse av kromatogrammer av hver av fraksjonene førte til identifisering av en forbindelse som var sterkt beholdt på TrkB-kolonnen (50-55 min brøkdel), mens de unngikk tidlig på TrkB-NULL-kolonnen (0-5 min brøkdel), noe som indikerer spesifikk interaksjon med de immobiliserte TrkB-reseptorene (figur 9). Forbindelsen eluting på ~ 17.48 min (Figur 9) er nå rettet mot isolasjon og testing i funksjonelle analyser.
Figur 1. Riktig montert CMAC-kolonne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. CMAC forberedelse trinn og fluorescerende antistoff merking av immobiliserte reseptorer. Skjematisk fremstilling av utarbeidelsen av en CMAC-kolonne (1-4) og antistoffmerkingseksperimentet (5-8). (1) Homogeniserte cellemembranfragmenter som inneholder målrettet transmembranprotein, TrkB. (2) Solubiliserte cellemembranfragmenter i en micellarstruktur. (3) Cellemembranfragmenter immobilisert på overflaten av IAM-partiklene. (4) IAM-partikler med immobiliserte cellemembranfragmenter pakket inn i en glasskolonne. (5) Immobilisert TrkB-reseptor i cellemembranfragmentene. (6) Binding av den naturlige liganden BDNF til den funksjonelle TrkB-reseptoren. (7) Binding av de primære antistoffene mot BDNF-molekyler. (8) Binding av fluorofor-merkede sekundære antistoffer mot de primære antistoffene som resulterer i grønn fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Immobilisering av cellemembranfragmenter med TrkB-reseptorer på IAM-partikler. Confocal mikroskopi bilder som viser immobilisering av cellemembran fragmenter med funksjonelle TrkB reseptorer på IAM partikler. (A) Cellemembranfragmenter fra SH-SY5Y TrkB-NULL cellelinje immobilisert på IAM-partikler etter inkubasjon med BDNF, primært antistoff og fluoroforemerket sekundært antistoff. (B) Cellemembranfragmenter fra SH-SY5Y Neuroblastoma cellelinjer som uttrykker TrkB immobilisert på IAM-partikler etter inkubasjon med primær antistoff og fluorofor-merket sekundært antistoff uten BDNF. (C) Cellemembranfragmenter fra SH-SY5Y neuroblastomcellelinjer som uttrykker TrkB immobilisert på IAM-partikler etter inkubasjon med BDNF, primært antistoff og fluorofor-merket sekundært antistoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Fremre affinitetskromatogrammer på 7,8-DHF i TrkB CMAC-kolonnen. Frontal kromatogram med økende konsentrasjoner på 7,8-DHF på TrkB CMAC-kolonnen, hvor A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM og D - 300 nM. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol ble brukt som eluent med en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Fremre affinitetskromatogrammer på 7,8-DHF på ikke-fungerende TrkB CMAC-kolonne. Frontal kromatogram av forskjellige konsentrasjoner på 7,8-DHF på den ikke-funksjonelle TrkB CMAC-kolonnen, hvor A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM og D - 500 nM. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol ble brukt som eluent med en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Frontal affinitetskromatogrammer på 7,8-DHF i CMAC-kolonnen TrkB-NULL. Frontal kromatogram med økende konsentrasjoner på 7,8-DHF på TrkB-NULL CMAC-kolonnen, hvor A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM og D - 300 nM. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5 % metanol ble brukt som eluent med en strømningshastighet på 0,4 ml/min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Frontal affinitet kromatogrammer på 7,8-DHF med 0,2% gotu kola ekstrakt på TrkB CMAC kolonnen. Representativ frontal elutionprofil på (A) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola ekstrakt (10 mg/ml) og (B) 500 nM 7,8-DHF på CMAC TrkB-kolonnen. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol ble brukt som eluent med en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8. Frontal affinitet kromatogrammer på 7,8-DHF med 0,2% gotu kola ekstrakt på TrkB-NULL CMAC kolonnen. Representativ frontal elutionprofil på (A) 500 nM 7,8-DHF og (B) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola ekstrakt (10 mg/ml) på TrkB-NULL CMAC-kolonnen. Ammoniumacetatbuffer (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol ble brukt som eluent med en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9. UPLC-MS kromatogrammer av gotu kola ekstraktfraksjoner. UPLC-MS-kromatogrammer av gotu kola ekstraktfraksjoner (A) eluted mellom 0-5 min fra TrkB-NULL CMAC kolonne og (C) unngikk mellom 50-55 min fra CMAC TrkB kolonne. En forbindelse med en oppbevaringstid på 17,48 min til stede i begge fraksjonene, som bekreftet ved å matche massespektra (B og D) ble identifisert som en potensiell TrkB-bindemiddel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Homogeniseringsbuffer | ||||
| 1 | Tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumklorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Kalsiumklorid vannfri (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Magnesiumklorid heksahydrat (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Kaliumklorid (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidin | 3 mM | ||
| 8 | Protease hemmer cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glyserol | 10% | ||
| 10 | Adenosin 5'-tripfosfat (ATP) disodium salthydrat | 100 μM | ||
| 11 | Etylendimintalaktisk syre (EDTA) | 5mM | ||
Tabell 1. Homogeniseringsbuffersammensetning.
| Buffer for solubilisering | ||||
| 1 | Tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumklorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Kalsiumklorid vannfri (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Magnesiumklorid heksahydrat (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Kaliumklorid (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidin | 3 mM | ||
| 8 | Protease hemmer cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glyserol | 10% | ||
| 10 | Adenosin 5'-tripfosfat (ATP) disodium salthydrat | 100 μM | ||
| 11 | Natrium kolat | 2% | ||
Tabell 2. Solubilisering buffersammensetning.
| Buffer for dialyse | ||||
| 1 | Tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumklorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Kalsiumklorid vannfri (CaCl2) | 0,1 mM | ||
| 4 | Etylendimintalaktisk syre (EDTA) | 5 mM | ||
| 5 | Fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
Tabell 3. Sammensetning av dialysebuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifisering av aktive forbindelser tilstede i komplekse blandinger av spesialiserte metabolitter er en svært utfordrende oppgave23. Tradisjonelt er individuelle forbindelser isolert, og deres aktivitet testes i forskjellige analyser. Denne tilnærmingen er tidkrevende og kostbar og fører ofte til isolasjon og identifisering av de mest tallrike og godt karakteriserte forbindelsene23. For tiden brukes screeninganalyser med høy gjennomstrømning og er avhengige av screening av kombinatoriske kjemibiblioteker med allerede kjente mål og er ikke designet for å identifisere og isolere biologisk aktive forbindelser som finnes i komplekse blandinger53.
CMAC tillater identifisering av forbindelser rettet mot TMPer 23,24,54. I denne teknikken er cellemembranfragmenter med TMPer immobilisert på overflaten av IAM stasjonære fasepartikler 23,24. CMAC er en unik tilnærming som gjør det mulig å immobilisere cellemembranfragmenter med målrettede proteiner på den faste støtten som etterligner cellemembranfosfolipid bilayer24. Dette gjør det mulig å bevare funksjonaliteten til immobiliserte proteinmål og gir nær fysiologiske forhold mens du bruker CMAC til å identifisere små molekyler som samhandler med TMPer. CMAC tilbyr fordelen av muligheter for oppdagelsen av nye kjemiske stillaser fra unike naturlige produktbiblioteker, som ikke kan testes ved hjelp av noen andre av de for tiden brukte analysene23 . Den foreslåtte tilnærmingen gjør det mulig å identifisere forbindelser som samhandler med TMPer uten å avdekke arten av denne interaksjonen. Samhandlingsmodusen (allosterisk eller ortopedisk interaksjon, hemming eller aktivering) må verifiseres ved hjelp av funksjonelle cellebaserte analyser. CMAC med immobiliserte proteinmål kan også brukes til karakterisering av farmakodynamikk (f.eks. dissosiasjonskonstant, Kd) eller bestemme bindende kinetikk (kpå og koff) av små molekylligander som samhandler med målet, så vel som i prosessen med karakterisering av bindingsstedene på det immobiliserte proteinet24 . Selv om CMAC bare tillater identifisering av forbindelser som er bindende for TMPer, er det en innovativ tilnærming som øker hastigheten på det første trinnet i rørledningen for legemiddeloppdagelse, da det ikke krever sammensatt rensing, som for tiden har vært den store flaskehalsen i legemiddeloppdagelsesprosessen fra naturlige blandinger.
Selv om den presenterte protokollen fokuserer på immobilisering av en transmembranreseptor (TrkB), kan CMAC-teknologi brukes til utarbeidelse av kolonner med andre mål. En av de avgjørende aspektene ved CMAC-forberedelse er valget av cellelinje eller vev som brukes til å isolere cellemembranfragmenter. Hvis kolonner brukes i screening av komplekse blandinger for forbindelser som samhandler med de immobiliserte reseptorene, anbefales det å bruke cellelinjer som overekspresserer det målrettede proteinet. Bruk av en slik cellelinje vil resultere i et høyere antall immobiliserte mål og øke sjansen for identifisering av forbindelser med lavere affinitet mot målet eller mindre rikelige molekyler. Hvis man fokuserer på karakterisering av det immobiliserte proteinet, anbefales bruk av en innfødt cellelinje, da postoversettelsesendringer proteinet gjennomgår så vel som fosfolipidmiljøet, kan variere betydelig i den transfekterte cellelinjen.
Noen aspekter ved cellemembranisolasjon og immobilisering på IAM-partikler er kritiske og kan kreve modifikasjoner avhengig av reseptortypen eller kilden til proteinet. For å forhindre proteolytisk spalting av de immobiliserte proteinene, er det viktig å bruke riktige proteasehemmere i homogeniserings- og solubiliseringsbuffere. Et litteratursøk anbefales for å identifisere nødvendige proteasehemmere. I prosessen med protokolloptimalisering bestemte vi oss for at tilsetningen av ATP og glyserol øker antall bindingssteder (Bmaks) på CMAC-kolonner når du immobiliserer TrkB. Andre kofaktorer kan være nødvendige når du optimaliserer immobilisering av andre typer transmembranmål24. For tiden undersøker vi tilsetning av kolesterol i prosessen med TrkB immobilisering, så nylig kolesterol ble funnet for å endre effekten av TrkB ligands48. Det ble tidligere rapportert at tilsetning av kolesterol og / eller andre lipider kan være nødvendig for å oppnå funksjonelle CMAC-kolonner24.
Ulike typer detektorer kan brukes til å overvåke kolonne eluate inkludert diode array detektor for ligander med kromoforer, masse spektrometri, eller radiostrøm detektor for radioaktive ligander.
Overvåking av stabiliteten til CMAC-kolonner er av kritisk betydning. CMAC-kolonner kan være stabile i opptil flere måneder, avhengig av type immobilisert protein, bruksfrekvens og lagringsforhold. Det anbefales å lagre kolonnen i 0,05% natriumazidoppløsning i ammoniumacetatbuffer ved 4 °C hvis kolonnen forblir ubrukt i mer enn en uke. Det er viktig å vaske kolonnen grundig med ammoniumacetatbuffer etter lengre perioder før du prøver å bruke den. Det anbefales å overvåke funksjonaliteten til kolonnen ved å injisere en valgt konsentrasjon av en markørligand ukentlig.
Til tross for mange fordeler har CMAC-teknologi flere begrensninger som må tas i betraktning ved bruk av kolonnene i forsøk på narkotikaoppdagelse. For det første reduseres antall immobiliserte transmembranmål med tiden, og derfor anbefales det at det totale antallet bindingssteder overvåkes ukentlig24. En av årsakene til denne nedgangen er konsekvensen av immobiliseringsprosessen som er basert på adsorpsjon og ikke innebærer innføring av kovalente obligasjoner. Lipofile forbindelser kan beholdes sterkt på CMAC-kolonner på grunn av betydelig ikke-spesifikk binding til IAM-overflaten og fosfolipid-bilayers. Dette øker analysetiden betydelig redusere gjennomstrømningen. Prosessen med CMAC-kolonneforberedelse er cellelinjespesifikk og krever en grundig forståelse av arten av immobiliserte proteiner, noe som gjør den mindre egnet for mindre karakteriserte mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lukasz Ciesla samarbeider med Regis Technologies, leverandøren av IAM. Pc. DD2 partikler.
Acknowledgments
Z.C.A. ble støttet av Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Center for Complimentary and Integrative Medicine of the National Institutes of Health under tildeling nummer 1R41AT011716-01. Dette arbeidet ble også delvis støttet av American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies grant til L.C. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
References
- Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
- Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
- Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
- Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
- Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
- Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
- Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
- Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
- Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
- Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
- Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
- Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
- Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
- Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
- Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
- Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
- Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
- Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
- Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
- Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
- Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
- Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
- Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
- Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
- Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
- Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
- Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
- Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
- Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
- Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
- Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
- Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
- Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
- Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
- Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
- Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
- Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
- Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
- Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
- Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
- Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
- Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
- Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
- Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
- Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
- Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
- Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
- Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
- Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
- Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C.
- Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
- Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
- Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).
