Summary
Aquí, presentamos un protocolo estandarizado para monitorear la acidificación intestinal en Drosophila melanogaster con un rendimiento óptimo. Primero usamos este protocolo para el monitoreo de la acidificación intestinal en Drosophila melanogaster y luego demostramos su uso en especies de Drosophila no modelo.
Abstract
El intestino medio de la mosca de la fruta consta de múltiples regiones, cada una de las cuales está compuesta por células que llevan a cabo funciones fisiológicas únicas requeridas para el correcto funcionamiento del intestino. Una de estas regiones, la región de células de cobre (CCR), se localiza en el intestino medio y consiste, en parte, en un grupo de células conocidas como células de cobre. Las células de cobre están involucradas en la secreción de ácido gástrico, un proceso evolutivamente conservado cuyo papel preciso es poco conocido. Este artículo describe las mejoras en el protocolo actual utilizado para el ensayo de la acidificación del intestino adulto de Drosophila melanogaster y demuestra que se puede utilizar en otras especies de moscas. En particular, este trabajo demuestra que la acidificación intestinal depende del estado nutricional de la mosca y presenta un protocolo basado en este nuevo hallazgo. En general, este protocolo demuestra la utilidad potencial del estudio de las células de cobre de Drosophila para descubrir los principios generales que subyacen a los mecanismos de acidificación intestinal.
Introduction
En el intestino del insecto, las células de cobre comparten similitudes celulares y funcionales con las células parietales gástricas productoras de ácido (también conocidas como oxínticas) del estómago de los mamíferos. Este grupo de células libera ácido en la luz intestinal. La función de la secreción ácida y la anatomía se conserva evolutivamente. Los componentes principales del ácido descargado son el ácido clorhídrico y el cloruro de potasio. El mecanismo químico de la formación de ácido en las células depende de la anhidrasa carbónica. Esta enzima genera un ion bicarbonato a partir de CO2 y agua, que libera un ion hidroxilo que luego se descarga en la luz a través de una bomba de protones a cambio de potasio. Los iones cloruro y potasio son transportados a la luz por canales de conductancia que resultan en la formación de ácido clorhídrico y cloruro de potasio, el componente principal del jugo gástrico1,2,3,4.
Aunque los mecanismos de formación de ácido son bien conocidos, se sabe mucho menos sobre los mecanismos fisiológicos que regulan la secreción de ácido. El objetivo de desarrollar este método es ayudar a delinear mejor las vías celulares que coordinan la formación y secreción de ácido y determinar el papel del ácido en la mediación de la fisiología intestinal y la homeostasis. La razón detrás del desarrollo y uso de esta técnica es proporcionar un método consistente y confiable para estudiar el proceso de acidificación intestinal en Drosophila y organismos no modelo. Aunque actualmente existe un protocolo estándar para determinar la acidificación del intestino medio de Drosophila2,5,6, se observó una variabilidad significativa en el grado de acidificación en moscas de tipo salvaje (WT) mientras se utilizaba este protocolo para estudiar la función de las células de cobre. Para comprender la base de esta variabilidad observada y obtener resultados consistentes, se optimizaron varios aspectos del protocolo estándar como se describe a continuación.
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Protocol
NOTA: La línea de laboratorio estándar Oregon R se utilizó como control WT. Todas las moscas se criaron en medio estándar de harina de maíz-melaza (que contiene melaza, agar, levadura, harina de maíz, tegosept, ácido propiónico y agua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano claro / oscuro de 12/12 h.
1. Preparación para el ensayo
- Recolecte moscas hembras (0-2 días de edad, no vírgenes) bajo anestesia de CO2 y permita que se recuperen con alimentos estándar de harina de maíz durante al menos 3 días antes de los experimentos.
- Muera de hambre a las moscas durante ~ 24 h a temperatura ambiente (~ 23 ° C) en viales que contengan un pañuelo de laboratorio empapado con ~ 2 ml de agua desionizada.
- Prepare el alimento para moscas con azul de bromofenol (BPB) de la siguiente manera:
- Derrite la comida para moscas en un microondas y luego déjala enfriar hasta que esté tibia.
- Agregue 1 ml de BPB al 4% a 1 ml de alimentos tibios y mezcle bien.
- Usando una pipeta, agregue la comida para moscas que contiene BPB en un solo punto (~ 200 μL) en el centro de una placa de Petri.
2. Ensayo de monitoreo de acidificación intestinal
- Transfiera moscas hambrientas a una placa de Petri que contenga puntos individuales (200 μL) de alimentos para moscas suplementados con azul de bromofenol al 2% (BPB). Permita que las moscas se alimenten durante 4 h a temperatura ambiente mientras están expuestas a la luz.
- Después de 4 h, recoger las moscas y anestesiarlas en hielo; aislar quirúrgicamente sus intestinos.
- Realice la cirugía en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) con fórceps bajo un estereomicroscopio (consulte la Tabla de Materiales). Aísle el intestino sosteniendo el tórax con un par de fórceps y tirando hacia abajo del abdomen con un segundo par hasta que el CCR del intestino sea visible, teniendo cuidado de asegurarse de que el intestino permanezca unido en ambos extremos.
- Determinar la acidificación del intestino examinando el color del CCR del intestino (Figura 1C; amarillo indica acidificado, y azul indica no acidificado).
- Cuente solo aquellas moscas que muestran manchas robustas de BPB en sus intestinos.
- Calcule el porcentaje utilizando la siguiente ecuación:
Porcentaje de moscas con intestinos acidificados = número de moscas acidificadas × 100 / (número de moscas acidificadas + número de moscas no acidificadas)
NOTA: Un porcentaje de 0 indica que ninguna mosca acidificó su intestino, mientras que un porcentaje de 100 indica que todas las moscas acidificaron su intestino.
3. Montaje y adquisición de imágenes
NOTA: Este paso es adicional para adquirir y procesar imágenes para las condiciones respectivas para análisis adicionales, ya que las muestras no se pueden conservar por mucho tiempo. Estas imágenes no se están utilizando para ninguna cuantificación de la acidez intestinal.
- Después de la disección, monte las muestras en PBS en un portaobjetos de vidrio.
- Adquiera las imágenes bajo un microscopio utilizando el software cellSens Entry (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque el portaobjetos preparado bajo el microscopio y ajuste la muestra con el ocular.
- Apague el ocular para abrir el obturador de la cámara.
- Abra el software en el ordenador conectado.
- Elija las lentes de objetivo correctas, haga clic en el botón en vivo y seleccione la configuración estándar con el ajuste de tiempo de exposición.
- Concéntrese en la región CCR y tome la instantánea.
- Haga clic con el botón derecho en la ventana de la imagen instantánea y guárdela como un archivo .tif.
- Alinee y procese las imágenes utilizando el software de Fiji.
- Importe el archivo .tif en el software de Fiji y borre el fondo no relacionado.
- Ajuste la intensidad y el contraste para optimizar el CCR y otras regiones intestinales.
- Agregue la barra de escala y guárdela como un archivo .tif.
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Representative Results
Matamos de hambre a las moscas hembra de Oregon R durante más de 20 h y luego las alimentamos con alimentos suplementados con BPB (2%) durante ~ 12 h, como se describió anteriormente7,8,9,10,11. El azul de bromofenol (BPB) es un colorante sensible al pH. Cambia de amarillo a pH 3.0 a azul a pH 4.6 y superior. Después de la disección intestinal, como se informó anteriormente, se encontró que algunas moscas producen ácido como lo indica el color amarillo en el CCR del intestino (Figura 1B). Sorprendentemente, en contraste con los resultados publicados, los intestinos de algunas moscas eran azules, lo que sugiere que no habían logrado acidificar sus intestinos. Estos resultados inconsistentes indicaron que el protocolo necesitaba ser modificado para optimizar los resultados consistentes e interpretables.
Para optimizar el protocolo BPB, se incorporaron dos nuevas modificaciones. Primero, para controlar mejor el inicio de la alimentación, las moscas se morían de hambre y luego se colocaban en puntos de comida con BPB en el centro de un plato (Figura 1A). En segundo lugar, comenzamos a evaluar la acidificación intestinal en puntos más cercanos al inicio de la alimentación. Las moscas hembras se murieron de hambre durante >20 h, se les proporcionó comida para moscas con BPB en una pequeña arena de placa de Petri (ver Figura 1A) y se les permitió alimentarse durante varios puntos de tiempo hasta las 4 h mientras diseccionaban las tripas a intervalos de 1 h. Se determinó el número de intestinos acidificados (color amarillo) y no acidificados (color azul), y se calculó el porcentaje de moscas que muestran acidificación intestinal para cada punto de tiempo (Figura 1B). En 30 minutos, ~ 20% de las moscas habían acidificado su intestino. Después de una hora, ~ 40% de los intestinos mostraron evidencia de acidificación, mientras que después de 2 h y 3 h de alimentación, el porcentaje de intestinos acidificados aumentó a ~ 60% y ~ 70%, respectivamente (Figura 1B). Esto indica que hay un aumento en el porcentaje de moscas que muestran acidificación intestinal con el tiempo. Casi el 90-95% de los intestinos se acidificaron cuando las moscas fueron alimentadas durante 4 h (Figura 1B). Utilizamos este protocolo optimizado de alimentación de 4 h para experimentos posteriores.
Además del efecto de la alimentación, se examinó el efecto de la temperatura a la que se criaron las moscas en la acidificación intestinal. Las moscas se criaron a 23 ° C y 30 ° C, y las moscas hembras se murieron de hambre durante ~ 20 h. Las moscas fueron alimentadas con alimentos para moscas suplementados con BPB durante 4 h, y el porcentaje de acidificación intestinal se determinó como se describió anteriormente. No observamos diferencias en la acidificación intestinal para estas dos temperaturas (Figura 1C), lo que sugiere que la temperatura, a diferencia de la alimentación, no afecta la acidificación intestinal.
Demostración del protocolo de acidificación intestinal para organismos no modelo
Las especies de Drosophilae se separan filogenéticamente a lo largo de millones de años (ver Figura 2A). Durante este vasto período, se han adaptado a diferentes hábitats y dietas12, lo que plantea la posibilidad de que algunas especies no acidifiquen su intestino de la misma manera que D. melanogaster. Utilizamos D. melanogaster (fruto), D. sechecllia (fruto de morinda), D. erecta (fruto de pandanus), D. pseudoosubcura y D. virilis (savia vegetal) y D. mojavensis (frutos de cactus) (Figura 2B). Para demostrar que este protocolo podría usarse para otras especies de Drosophila , estas especies fueron alimentadas con alimentos para moscas suplementados con BPB durante 4 h, y se determinó el porcentaje de acidificación intestinal como se describió anteriormente. Se observó una acidificación intestinal robusta para todas las especies probadas (Figura 2B). Este resultado sugiere que la acidificación del intestino se conserva evolutivamente entre diversas especies de Drosophila y que este protocolo se puede implementar fácilmente para otros organismos.
Figura 1: Monitoreo de la acidificación intestinal. (A) Dibujo esquemático de la arena de alimentación. El punto azul representa la comida de la mosca con azul bromofenol (un colorante que indica el pH). Otros puntos representan moscas de la fruta. (B) Representación gráfica del porcentaje de moscas que muestran acidificación intestinal alimentadas durante diferentes duraciones durante 4 h. Imágenes intestinales representativas de un intestino acidificado y un intestino no acidificado. La flecha roja indica la liberación ácida en la región de la célula de cobre del intestino medio. n = 4 experimentos, 25-30 moscas hembra por experimento. Barra de escala = 500 μm cada una. Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al grupo control (ANOVA unidireccional, seguido de una prueba de Bonferroni) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Las moscas fueron alimentadas con alimentos para moscas con BPB durante 4 h a 23 °C o 30 °C. Porcentaje (%) de moscas que muestran acidificación intestinal. n = 4 experimentos, 25-30 moscas hembra por experimento (prueba t no apareada seguida de prueba U de Mann-Whitney no paramétrica y prueba de suma de rango de Wilcoxon. Abreviatura: ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Filogenia del fenómeno de acidificación intestinal. (A) Relación filogenética de las especies de Drosophila junto con su hábito de alimentación y hábitat. La barra de 1 mm indica 1 millón de años. (B) Porcentaje de moscas (especies de Drosophila ) que muestran acidificación intestinal, alimentadas con alimentos para moscas con BPB durante 4 h. n = 4 experimentos, 25-30 moscas hembras por experimento (ANOVA unidireccional, seguido de una prueba de Bonferroni). Abreviatura: ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un paso crítico en este protocolo es la disección adecuada del intestino para visualizar el CCR para el fenotipo de acidificación. El ácido liberado de las células de cobre se limita al CCR cuando el intestino está intacto. Sin embargo, durante la disección, la fuga causada por la ruptura del intestino puede conducir a la difusión de ácido del CCR y dar lugar a un intestino erróneamente calificado como negativo para la acidificación. Además, el color amarillo indicativo de acidificación se desvanece dentro de los 5-10 minutos posteriores a la disección, lo que subraya la importancia de puntuar los intestinos para el fenotipo de acidificación poco después del aislamiento. Finalmente, los protocolos actuales7,8,9,10,11 que evalúan el estado de acidificación en el intestino de la mosca se basan en la suplementación de alimentos para moscas con BPB, sin tener en cuenta el estado de alimentación de los animales. Sin embargo, durante nuestros estudios, encontramos que la acidificación del intestino no era constitutiva, sino que dependía de la alimentación después de una inanición previa. Como tal, la evaluación precisa del estado ácido del intestino utilizando BPB como un indicador del pH intestinal requiere la consideración del estado nutricional de la mosca junto con cualquier otra variable que se esté considerando.
La acidificación del intestino se conserva de organismos multicelulares inferiores a organismos superiores. Sin embargo, se sabe poco sobre su función en la mayoría de los animales y la extensión total de las vías moleculares y celulares que lo regulan. En los seres humanos, la falta de acidificación intestinal se asocia con la malabsorción de nutrientes, mientras que el exceso de ácido en el intestino puede dar lugar a úlceras intestinales13. Por lo tanto, es probable que los conocimientos obtenidos de la investigación sobre la acidificación intestinal proporcionen nuevos conocimientos sobre el tratamiento y la cura de las enfermedades intestinales causadas por defectos en la regulación de la secreción ácida.
Drosophila ha surgido recientemente como un poderoso modelo para el estudio de la acidificación intestinal2,5,6. Los estudios genéticos han identificado los genes necesarios para el establecimiento de células secretoras de ácido y la maquinaria involucrada en la producción de ácido. También se han llevado a cabo estudios farmacológicos. Por ejemplo, la acidificación del intestino se previene cuando las moscas son alimentadas con acetazolamida, un inhibidor de la anhidrasa carbónica (CAH)7, consistente con el papel central que desempeña la CAH en la producción de protones necesarios para la producción de ácido. Esperamos que este protocolo ayude a los investigadores a descubrir de manera rápida y rentable inhibidores de fármacos o activadores de la acidez intestinal. Además, la aplicación de este método en combinación con enfoques genéticos y bioquímicos ayudará a descubrir las vías celulares involucradas en la secreción de ácido y a identificar el papel de la acidificación intestinal en la homeostasis intestinal y del organismo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen que el apoyo para el trabajo en el laboratorio del autor es proporcionado por un Premio Académico de la Facultad de HHMI y fondos de inicio del Instituto de Investigación Infantil en UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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