Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا موحدا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة مع الإخراج الأمثل. نستخدم هذا البروتوكول أولا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ثم نظهر استخدامه في أنواع ذبابة الفاكهة غير النموذجية.
Abstract
تتكون ذبابة الفاكهة midgut من مناطق متعددة ، يتكون كل منها من خلايا تقوم بوظائف فسيولوجية فريدة مطلوبة لحسن سير العمل في الأمعاء. إحدى هذه المناطق ، منطقة الخلايا النحاسية (CCR) ، موضعية في منتصف الأمعاء الوسطى وتتكون ، جزئيا ، من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم الخلايا النحاسية. تشارك الخلايا النحاسية في إفراز حمض المعدة ، وهي عملية محفوظة تطوريا ودورها الدقيق غير مفهوم بشكل جيد. تصف هذه الورقة التحسينات في البروتوكول الحالي المستخدم لفحص تحمض أمعاء ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة وتوضح أنه يمكن استخدامه على أنواع أخرى من الذباب. على وجه الخصوص ، توضح هذه الورقة أن تحمض الأمعاء يعتمد على الحالة الغذائية للذبابة ويقدم بروتوكولا يعتمد على هذه النتيجة الجديدة. بشكل عام ، يوضح هذا البروتوكول الفائدة المحتملة لدراسة خلايا ذبابة الفاكهة النحاسية للكشف عن المبادئ العامة الكامنة وراء آليات تحمض الأمعاء.
Introduction
في أمعاء الحشرات ، تشترك الخلايا النحاسية في أوجه تشابه خلوية ووظيفية مع الخلايا الجدارية المعدية المنتجة للحمض (المعروفة أيضا باسم oxyntic) في معدة الثدييات. هذه المجموعة من الخلايا تطلق الحمض في تجويف الأمعاء. يتم الحفاظ على وظيفة إفراز الحمض والتشريح تطوريا. المكونات الرئيسية للحمض المفرغ هي حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم. تعتمد الآلية الكيميائية لتكوين الحمض في الخلايا على الأنهيدراز الكربوني. يولد هذا الإنزيم أيون بيكربونات من CO2 والماء ، والذي يحرر أيون الهيدروكسيل الذي يتم تفريغه بعد ذلك في التجويف من خلال مضخة بروتون مقابل البوتاسيوم. يتم نقل أيونات الكلوريد والبوتاسيوم إلى التجويف عن طريق قنوات التوصيل مما يؤدي إلى تكوين حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم ، المكون الرئيسي لعصير المعدة 1،2،3،4.
على الرغم من أن آليات تكوين الحمض مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن الآليات الفسيولوجية التي تنظم إفراز الحمض. الهدف من تطوير هذه الطريقة هو المساعدة في تحديد المسارات الخلوية التي تنسق تكوين الحمض وإفرازه بشكل أفضل وتحديد دور الحمض في التوسط في فسيولوجيا الأمعاء والتوازن. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو توفير طريقة متسقة وموثوقة لدراسة عملية تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة والكائنات الحية غير النموذجية. على الرغم من وجود بروتوكول قياسي لتحديد تحمض ذبابة الفاكهة في منتصف الأمعاء حاليا2,5,6 ، فقد لوحظ تباين كبير في مدى التحمض في الذباب من النوع البري (WT) أثناء استخدام هذا البروتوكول لدراسة وظيفة الخلايا النحاسية. لفهم أساس هذا التباين الملحوظ والحصول على نتائج متسقة ، تم تحسين العديد من جوانب البروتوكول القياسي كما هو موضح أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم استخدام خط المختبر القياسي أوريغون R كعنصر تحكم WT. تم تربية جميع الذباب على وسط دبس الذرة القياسي (الذي يحتوي على دبس السكر ، والأجار ، والخميرة ، ودقيق الذرة ، و tegosept ، وحمض البروبيونيك ، والماء) في درجة حرارة الغرفة مع إيقاع الساعة البيولوجية الفاتحة / الداكنة 12/12 ساعة.
1. التحضير للفحص
- جمع الذباب الإناث (0-2 أيام من العمر ، غير عذراء) تحت التخدير CO2 والسماح لهم بالتعافي على طعام دقيق الذرة القياسي لمدة 3 أيام على الأقل قبل التجارب.
- تجويع الذباب لمدة ~ 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) في قوارير تحتوي على أنسجة مسح مختبرية غارقة في ~ 2 مل من الماء منزوع الأيونات.
- تحضير طعام الذبابة مع بروموفينول الأزرق (BPB) على النحو التالي:
- قم بإذابة طعام الذبابة في الميكروويف ثم اتركه يبرد حتى يصبح فاترا.
- أضف 1 مل من 4٪ BPB إلى 1 مل من الطعام الفاتر واخلطه جيدا.
- باستخدام ماصة ، أضف طعام الذبابة الذي يحتوي على BPB إلى نقطة واحدة (~ 200 ميكرولتر) في وسط طبق بتري.
2. فحص مراقبة تحمض الأمعاء
- انقل الذباب الجائع إلى طبق بتري يحتوي على نقاط مفردة (200 ميكرولتر) من طعام الذباب المكمل بنسبة 2٪ من أزرق بروموفينول (BPB). اسمح للذباب بالعلف لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أثناء تعرضه للضوء.
- بعد 4 ساعات ، جمع الذباب وتخديره على الجليد ؛ عزل أحشائهم جراحيا.
- قم بإجراء الجراحة في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام ملقط تحت المجهر المجسم (انظر جدول المواد). اعزل الأمعاء عن طريق الإمساك بالصدر بزوج من الملقط وسحب البطن لأسفل بزوج ثان حتى يصبح CCR للأمعاء مرئيا ، مع الحرص على التأكد من أن الأمعاء تظل متصلة في كلا الطرفين.
- تحديد تحمض الأمعاء عن طريق فحص لون CCR للأمعاء (الشكل 1C ؛ الأصفر يشير إلى المحمضة ، والأزرق يشير إلى غير محمض).
- عد فقط تلك الذباب التي تظهر تلطيخ BPB قوي في أحشائهم.
- احسب النسبة المئوية باستخدام المعادلة التالية:
نسبة الذباب ذو الأمعاء المحمضة = عدد الذباب المحمض × 100 / (عدد الذباب المحمض + عدد الذباب غير المحمض)
ملاحظة: تشير النسبة المئوية من 0 إلى أنه لا يوجد ذباب يحمض أمعائه ، في حين تشير نسبة 100 إلى أن جميع الذباب قد حمض أمعاءه.
3. التركيب والحصول على الصور
ملاحظة: هذه الخطوة إضافية للحصول على الصور ومعالجتها للظروف المعنية لمزيد من التحليلات حيث لا يمكن الاحتفاظ بالعينات لفترة طويلة. لا يتم استخدام هذه الصور لأي قياس كمي لحموضة الأمعاء.
- بعد التشريح ، قم بتركيب العينات في PBS على شريحة زجاجية.
- احصل على الصور تحت المجهر باستخدام برنامج cellSens Entry (انظر جدول المواد).
- ضع الشريحة المحضرة تحت المجهر واضبط العينة باستخدام النظارة.
- أغلق العدسة لفتح الغالق للكاميرا.
- افتح البرنامج على الكمبيوتر المتصل.
- اختر العدسات الموضوعية الصحيحة، وانقر فوق الزر المباشر ، وحدد الإعداد القياسي مع ضبط وقت المكشوف.
- ركز على منطقة CCR والتقط اللقطة.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة صورة اللقطة واحفظها كملف .tif.
- قم بمحاذاة الصور ومعالجتها بشكل أكبر باستخدام برنامج فيجي.
- استيراد ملف .tif في فيجي البرمجيات ومسح الخلفية غير ذات الصلة.
- اضبط الشدة والتباين لتحسين CCR ومناطق الأمعاء الأخرى.
- أضف شريط المقياس واحفظه كملف .tif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد جوعنا ذباب أوريغون R لأكثر من 20 ساعة ثم أطعمناهم طعاما مكملا ب BPB (2٪) لمدة 12 ساعة تقريبا ، كما هو موضح سابقا7،8،9،10،11. بروموفينول الأزرق (BPB) هو صبغة استشعار درجة الحموضة. يتغير من الأصفر عند درجة الحموضة 3.0 إلى الأزرق عند الرقم الهيدروجيني 4.6 وما فوق. بعد تشريح الأمعاء ، كما ذكر سابقا ، وجد أن بعض الذباب ينتج حمضا كما هو موضح باللون الأصفر في CCR للأمعاء (الشكل 1B). والمثير للدهشة ، على عكس النتائج المنشورة ، أن أمعاء بعض الذباب كانت زرقاء ، مما يشير إلى أنها فشلت في تحمض أحشائها. وأشارت هذه النتائج غير المتسقة إلى أن البروتوكول بحاجة إلى تعديل لتحقيق نتائج متسقة وقابلة للتفسير.
لتحسين بروتوكول BPB ، تم دمج تعديلين جديدين. أولا ، للتحكم بشكل أفضل في بداية التغذية ، تم تجويع الذباب ثم وضعه على بقع الطعام مع BPB في وسط طبق (الشكل 1A). ثانيا ، بدأنا في فحص تحمض الأمعاء في نقاط زمنية أقرب إلى بداية التغذية. تم تجويع ذبابة الإناث لمدة >20 ساعة ، وقدمت طعام الذباب مع BPB في ساحة صغيرة من لوحة بتري (انظر الشكل 1A) ، وسمح لها بالتغذية لنقاط زمنية مختلفة حتى 4 ساعات أثناء تشريح الأمعاء على فترات 1 ساعة. تم تحديد عدد الأمعاء المحمضة (اللون الأصفر) والأمعاء غير المحمضة (اللون الأزرق) ، وتم حساب النسبة المئوية للذباب الذي يظهر تحمض الأمعاء لكل نقطة زمنية (الشكل 1B). في غضون 30 دقيقة ، قام ~ 20٪ من الذباب بتحمض أمعائه. بعد ساعة ، أظهر ~ 40٪ من الأمعاء دليلا على التحمض ، بينما بعد 2 ساعة و 3 ساعات من التغذية ، زادت النسبة المئوية للأمعاء المحمضة إلى ~ 60٪ و ~ 70٪ ، على التوالي (الشكل 1B). هذا يشير إلى أن هناك زيادة في النسبة المئوية للذباب الذي يظهر تحمض الأمعاء مع مرور الوقت. تم تحمض ما يقرب من 90-95 ٪ من الأمعاء عندما تم تغذية الذباب لمدة 4 ساعات (الشكل 1 ب). استخدمنا هذا البروتوكول الأمثل للتغذية لمدة 4 ساعات للتجارب اللاحقة.
بالإضافة إلى تأثير التغذية ، تم فحص تأثير درجة الحرارة التي تم فيها رفع الذباب على تحمض الأمعاء. تم تربية الذباب في 23 درجة مئوية و 30 درجة مئوية ، وتم تجويع الذباب الإناث لمدة 20 ساعة تقريبا. ثم تم تغذية الذباب بطعام الذباب المكمل ب BPB لمدة 4 ساعات ، وتم تحديد النسبة المئوية لتحمض الأمعاء كما هو موضح أعلاه. لم نلاحظ أي فرق في تحمض الأمعاء لهاتين الدرجتين (الشكل 1C) ، مما يشير إلى أن درجة الحرارة ، على عكس التغذية ، لا تؤثر على تحمض الأمعاء.
عرض بروتوكول تحمض الأمعاء للكائنات الحية غير النموذجية
يتم فصل أنواع ذبابة الفاكهة من الناحية الفيلولوجية على مدى ملايين السنين (انظر الشكل 2 أ). خلال هذه الفترة الشاسعة ، تكيفت مع الموائل والوجبات الغذائية المختلفة 12 ، مما أثار احتمال أن بعض الأنواع قد لا تحمض أمعائها بنفس الطريقة مثل D. melanogaster. استخدمنا D. melanogaster (الفاكهة) ، D. sechecllia (فاكهة موريندا ) ، D. erecta (فاكهة pandanus) ، D. pseudoosubcura & D. virilis (النسغ النباتي) ، و D. mojavensis (ثمار الصبار) (الشكل 2B). لإثبات أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه لأنواع ذبابة الفاكهة الأخرى ، تم تغذية هذه الأنواع بأطعمة الذباب المكملة ب BPB لمدة 4 ساعات ، وتم تحديد النسبة المئوية لتحمض الأمعاء كما هو موضح أعلاه. لوحظ تحمض الأمعاء القوي لجميع الأنواع التي تم اختبارها (الشكل 2B). تشير هذه النتيجة إلى أن تحمض الأمعاء محفوظ تطوريا بين أنواع ذبابة الفاكهة المتنوعة وأن هذا البروتوكول يمكن تنفيذه بسهولة للكائنات الحية الأخرى.
الشكل 1: مراقبة تحمض الأمعاء . (أ) الرسم التخطيطي لساحة التغذية. تمثل النقطة الزرقاء طعام الذبابة مع أزرق بروموفينول (صبغة تشير إلى درجة الحموضة). بقع أخرى تمثل ذباب الفاكهة. (ب) تمثيل بياني للنسبة المئوية للذباب الذي يظهر تحمض الأمعاء الذي يتم تغذيته لفترات مختلفة تزيد عن 4 ساعات. صور الأمعاء التمثيلية للأمعاء المحمضة والأمعاء غير المحمضة. يشير السهم الأحمر إلى إطلاق حمضي في منطقة الخلية النحاسية في القناة الهضمية الوسطى. n = 4 تجارب، 25-30 ذبابة أنثى لكل تجربة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر لكل منهما. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة عن المجموعة الضابطة (ANOVA أحادية الاتجاه ، متبوعة باختبار Bonferroni) * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01 ؛ P < 0.0001. (ج) تم تغذية الذباب بطعام الذباب مع BPB لمدة 4 ساعات عند 23 درجة مئوية أو 30 درجة مئوية. النسبة المئوية (٪) من الذباب الذي يظهر تحمض الأمعاء. n = 4 تجارب، 25-30 ذبابة أنثى لكل تجربة (اختبار t غير مقترن يليه اختبار Mann-Whitney U غير البارامتري واختبار Wilcoxon Rank-sum. اختصار: ns = غير مهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Phylogeny من ظاهرة تحمض الأمعاء . (أ) العلاقة الجينية لأنواع ذبابة الفاكهة جنبا إلى جنب مع عاداتها الغذائية وموائلها. شريط 1 مم يشير إلى 1 مليون سنة. (ب) النسبة المئوية للذباب (أنواع ذبابة الفاكهة ) التي تظهر تحمض الأمعاء ، وتغذية طعام الذباب مع BPB لمدة 4 ساعات ن = 4 تجارب ، و 25-30 ذبابة أنثى لكل تجربة (ANOVA أحادية الاتجاه ، تليها اختبار بونفيروني). اختصار: ns = غير مهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي التشريح السليم للأمعاء لتصور CCR للنمط الظاهري للتحمض. يقتصر الحمض المنبعث من الخلايا النحاسية على CCR عندما تكون الأمعاء سليمة. ومع ذلك ، أثناء التشريح ، يمكن أن يؤدي التسرب الناجم عن تمزق الأمعاء إلى انتشار الحمض من CCR ويؤدي إلى تسجيل الأمعاء عن طريق الخطأ على أنها سلبية للتحمض. بالإضافة إلى ذلك ، يتلاشى اللون الأصفر الذي يدل على التحمض في غضون 5-10 دقائق بعد التشريح ، مما يؤكد أهمية تسجيل الأمعاء للنمط الظاهري للتحمض بعد فترة وجيزة من العزلة. وأخيرا ، تعتمد البروتوكولات الحالية7،8،9،10،11 التي تفحص حالة التحمض في أمعاء الذبابة على مكملات أغذية الذباب مع BPB ، دون النظر في حالة تغذية الحيوانات. ومع ذلك ، خلال دراساتنا ، وجدنا أن تحمض الأمعاء لم يكن مكونا بل يعتمد على التغذية بعد المجاعة السابقة. على هذا النحو ، فإن التقييم الدقيق للحالة الحمضية للأمعاء باستخدام BPB كمؤشر على درجة الحموضة في الأمعاء يتطلب النظر في الحالة الغذائية للذبابة إلى جانب أي متغيرات أخرى يتم النظر فيها.
يتم الحفاظ على تحمض الأمعاء من الكائنات الحية متعددة الخلايا السفلى إلى الكائنات الحية العليا. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن وظيفته في معظم الحيوانات والمدى الكامل للمسارات الجزيئية والخلوية التي تنظمه. في البشر ، يرتبط نقص تحمض الأمعاء بسوء امتصاص العناصر الغذائية ، في حين أن الحمض الزائد في الأمعاء يمكن أن يؤدي إلى قرحة معوية13. وبالتالي ، من المرجح أن توفر الأفكار المكتسبة من الأبحاث حول تحمض الأمعاء رؤى جديدة في علاج وعلاج الأمراض المعوية الناجمة عن عيوب في تنظيم إفراز الحمض.
ظهرت ذبابة الفاكهة مؤخرا كنموذج قوي لدراسة تحمض الأمعاء2،5،6. حددت الدراسات الجينية الجينات اللازمة لإنشاء خلايا إفراز الحمض والآلات المشاركة في إنتاج الحمض. كما أجريت دراسات عن المخدرات. على سبيل المثال ، يتم منع تحمض الأمعاء عندما يتم تغذية الذباب بالأسيتازولاميد ، وهو مثبط أنهيدراز كربوني (CAH) 7 ، بما يتفق مع الدور المركزي الذي يلعبه CAH في إنتاج البروتونات اللازمة لإنتاج الحمض. نتوقع أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على اكتشاف مثبطات الأدوية أو منشطات حموضة الأمعاء بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تطبيق هذه الطريقة بالاقتران مع النهج الوراثية والكيميائية الحيوية سيساعد في الكشف عن المسارات الخلوية المشاركة في إفراز الحمض وتحديد دور تحمض الأمعاء في التوازن المعوي والكائنات الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بأن الدعم للعمل في مختبر المؤلف يتم توفيره من خلال جائزة HHMI College Scholar Award وصناديق بدء التشغيل من معهد أبحاث الأطفال في مركز UT Southwestern الطبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
