Summary
Her præsenterer vi en standardiseret protokol til overvågning af tarmforsuring i Drosophila melanogaster med optimal effekt. Vi bruger først denne protokol til overvågning af tarmforsuring i Drosophila melanogaster og demonstrerer derefter dens anvendelse i ikke-model Drosophila arter.
Abstract
Bananfluen midgut består af flere regioner, som hver især består af celler, der udfører unikke fysiologiske funktioner, der kræves for at tarmen fungerer korrekt. En sådan region, kobbercelleregionen (CCR), er lokaliseret til den midterste midttarm og består delvist af en gruppe celler kendt som kobberceller. Kobberceller er involveret i mavesyresekretion, en evolutionært bevaret proces, hvis præcise rolle er dårligt forstået. Dette papir beskriver forbedringer i den nuværende protokol, der bruges til at analysere for forsuring af den voksne Drosophila melanogaster tarm og viser, at den kan bruges på andre arter af fluer. Dette papir viser især, at tarmforsuring er afhængig af fluens ernæringsstatus og præsenterer en protokol baseret på dette nye fund. Samlet set viser denne protokol den potentielle nytte af at studere Drosophila kobberceller for at afdække generelle principper, der ligger til grund for mekanismerne for tarmforsuring.
Introduction
I insekttarmen deler kobberceller cellulære og funktionelle ligheder med de syreproducerende gastriske parietale celler (også kendt som oxyntiske) i pattedyrs mave. Denne gruppe af celler frigiver syre i tarmens lumen. Funktionen af syresekretion og anatomi bevares evolutionært. Hovedkomponenterne i den udledte syre er saltsyre og kaliumchlorid. Den kemiske mekanisme for syredannelse i cellerne afhænger af kulsyreanhydrase. Dette enzym genererer en bicarbonation fra CO2 og vand, som frigiver en hydroxylion, der derefter udledes i lumen gennem en protonpumpe i bytte for kalium. Chlorid- og kaliumioner transporteres ind i lumen ved hjælp af konduktanskanaler, hvilket resulterer i dannelse af saltsyre og kaliumchlorid, hovedbestanddelen af mavesaft1,2,3,4.
Selvom mekanismerne for syredannelse er godt forstået, er der meget mindre kendt om de fysiologiske mekanismer, der regulerer syresekretion. Målet med at udvikle denne metode er at hjælpe med bedre at afgrænse de cellulære veje, der koordinerer syredannelse og sekretion og bestemme syrens rolle i formidlen af tarmfysiologi og homeostase. Rationalet bag udviklingen og anvendelsen af denne teknik er at tilvejebringe en konsekvent og pålidelig metode til at studere processen med tarmforsuring i Drosophila og ikke-modelorganismer. Selvom der i øjeblikket findes en standardprotokol til bestemmelse af Drosophila midgut forsuring2,5,6, blev der observeret signifikant variabilitet i omfanget af forsuring i vildtypefluer (WT), mens denne protokol blev brugt til at studere kobbercellefunktion. For at forstå grundlaget for denne observerede variabilitet og opnå konsistente resultater blev flere aspekter af standardprotokollen optimeret som beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Standardlaboratorielinjen Oregon R blev brugt som WT-kontrol. Alle fluer blev opdrættet på standard majsmelasse-melasse medium (indeholdende melasse, agar, gær, majsmel, tegosept, propionsyre og vand) ved stuetemperatur med 12/12 timers lys / mørk døgnrytme.
1. Forberedelse til analysen
- Saml kvindelige fluer (0-2 dage gamle, ikke-jomfruelige) under CO2-anæstesi og lad dem komme sig på standard majsmel mad i mindst 3 dage før forsøg.
- Sult fluerne i ~ 24 timer ved stuetemperatur (~ 23 ° C) i hætteglas, der indeholder et laboratorievæv gennemblødt med ~ 2 ml deioniseret vand.
- Forbered fluemaden med bromphenolblå (BPB) som følger:
- Smelt fluemaden i en mikrobølgeovn, og lad den derefter køle af, indtil den er lunken.
- Tilsæt 1 ml 4% BPB til 1 ml lunken mad og bland godt.
- Brug en pipet til at tilsætte fluemaden, der indeholder BPB, i en enkelt p-7 (~ 200 μL) i midten af en petriskål.
2. Overvågning af tarmforsuring
- Overfør udsultede fluer til en petriskål indeholdende enkelte prikker (200 μL) fluemad suppleret med 2% bromphenolblå (BPB). Lad fluerne søge i 4 timer ved stuetemperatur, mens de udsættes for lys.
- Efter 4 timer skal du samle fluerne og bedøm dem på is; kirurgisk isolere deres tarme.
- Udfør operationen i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) med tang under et stereomikroskop (se materialetabellen). Isoler tarmen ved at holde brystkassen med et par tang og trække maven ned med et andet par, indtil tarmens CCR er synlig, og sørg for at sikre, at tarmen forbliver fastgjort i begge ender.
- Bestem forsuring af tarmen ved at undersøge farven på tarmens CCR (figur 1C; gul indikerer forsuret, og blå indikerer ikke forsuret).
- Tæl kun de fluer, der viser robust BPB-farvning i deres tarme.
- Beregn procentdelen ved hjælp af følgende ligning:
Procentdel af fluer med forsurede tarme = antal fluer forsuret × 100 / (antal fluer forsuret + antal fluer ikke-forsurede)
BEMÆRK: En procentdel på 0 indikerer, at ingen fluer forsurede deres tarm, mens en procentdel på 100 angiver, at alle fluer forsurede deres tarm.
3. Montering og billedoptagelse
BEMÆRK: Dette trin er et supplement til at indsamle og behandle billeder til de respektive betingelser for yderligere analyser, da prøverne ikke kan bevares længe. Disse billeder bruges ikke til nogen kvantificering af tarmens surhedsgrad.
- Efter dissektion monteres prøverne i PBS på et glasglas.
- Hent billederne under et mikroskop ved hjælp af cellSens Entry-software (se tabellen over materialer).
- Placer det forberedte dias under mikroskopet, og juster prøven ved hjælp af okularet.
- Sluk okularet for at åbne lukkeren for kameraet.
- Åbn softwaren på den tilsluttede computer.
- Vælg de rigtige objektivobjektiver, klik på live-knappen , og vælg standardindstillingen med justering af eksponeringstid.
- Fokuser på CCR-området, og tag snapshottet.
- Højreklik på snapshotbilledvinduet, og gem det som en .tif fil.
- Juster og behandl billederne yderligere ved hjælp af Fiji-software.
- Importer filen .tif i Fiji software og ryd den ikke-relaterede baggrund.
- Juster intensiteten og kontrasten for at optimere CCR og andre tarmregioner.
- Tilføj skalalinjen, og gem som en .tif fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi sultede Oregon R kvindelige fluer i mere end 20 timer og fodrede dem derefter med mad suppleret med BPB (2%) i ~ 12 timer, som beskrevet tidligere7,8,9,10,11. Bromphenolblå (BPB) er et pH-sensing farvestof. Det skifter fra gul ved pH 3,0 til blå ved pH 4,6 og derover. Efter tarmdissektion, som tidligere rapporteret, viste det sig, at nogle fluer producerede syre som angivet med gul farve i tarmens CCR (figur 1B). Overraskende, i modsætning til offentliggjorte resultater, var tarmene hos nogle fluer blå, hvilket tyder på, at de ikke havde forsuret deres tarme. Disse inkonsekvente resultater viste, at protokollen skulle ændres for at optimere til konsistente og fortolkelige resultater.
For at optimere BPB-protokollen blev to nye ændringer indarbejdet. For det første for bedre at kontrollere begyndelsen af fodring blev fluer sultet og derefter anbragt på pletter af mad med BPB i midten af en plade (figur 1A). For det andet begyndte vi at analysere for tarmforsuring på tidspunkter tættere på begyndelsen af fodring. Hunfluer blev sultet i >20 timer, forsynet fluemad med BPB i en lille Petri-pladearena (se figur 1A) og fik lov til at fodre i forskellige tidspunkter indtil 4 timer, mens de dissekerede tarme med 1 timers mellemrum. Antallet af forsurede tarme (gul farve) og ikke-forsurede tarme (blå farve) blev bestemt, og procentdelen af fluer, der viste tarmforsuring, blev beregnet for hvert tidspunkt (figur 1B). Inden for 30 minutter havde ~ 20% af fluerne syrnet deres tarm. Efter en time viste ~ 40% af tarmene tegn på forsuring, mens procentdelen af forsurede tarme efter 2 timer og 3 timers fodring steg til henholdsvis ~ 60% og ~ 70% (figur 1B). Dette indikerer, at der er en stigning i procentdelen af fluer, der viser tarmforsuring med tiden. Næsten 90-95% af tarmene blev forsuret, når fluer blev fodret i 4 timer (figur 1B). Vi brugte denne optimerede protokol med 4 timers fodring til efterfølgende eksperimenter.
Ud over effekten af fodring blev effekten af temperatur, ved hvilken fluer blev rejst på tarmforsuring, undersøgt. Fluer blev opdrættet ved 23 ° C og 30 ° C, og kvindelige fluer blev sultet i ~ 20 timer. Fluer blev derefter fodret med fluemad suppleret med BPB i 4 timer, og procentdelen af tarmforsuring blev bestemt som beskrevet ovenfor. Vi observerede ingen forskel i tarmforsuring for disse to temperaturer (figur 1C), hvilket tyder på, at temperaturen, i modsætning til fodring, ikke påvirker tarmforsuringen.
Demonstration af tarmforsuringsprotokol for organismer uden model
Drosophilae arter er fylogenetisk adskilt over millioner af år (se figur 2A). I løbet af denne enorme periode har de tilpasset sig forskellige levesteder og kostvaner12, hvilket øger muligheden for, at nogle arter måske ikke syrner deres tarm på samme måde som D. melanogaster. Vi brugte D. melanogaster (frugt), D. sechecllia (morinda frugt), D. erecta (pandanus frugt), D. pseudoosubcura & D. virilis (plantesaft) og D. mojavensis (kaktusfrugter) (figur 2B). For at demonstrere, at denne protokol kunne anvendes til andre Drosophila-arter , blev disse arter fodret med fluefødevarer suppleret med BPB i 4 timer, og procentdelen af tarmforsuring blev bestemt som beskrevet ovenfor. Robust tarmforsuring blev observeret for alle testede arter (figur 2B). Dette resultat tyder på, at forsuring af tarmen er evolutionært bevaret blandt forskellige Drosophila-arter , og at denne protokol let kan implementeres for andre organismer.
Figur 1: Overvågning af tarmforsuring. (A) Skematisk tegning af fodringsarena. Den blå prik repræsenterer fluemad med bromphenolblå (et pH-indikerende farvestof). Andre pletter repræsenterer frugtfluer. B) Grafisk gengivelse af procentdelen af fluer, der viser tarmforsuring, der fodres i forskellige varigheder over 4 timer. Repræsentative tarmbilleder af en forsuret tarm og en ikke-forsuret tarm. Den røde pil indikerer sur frigivelse i kobbercelleområdet i midgut. n = 4 forsøg, 25-30 hunfluer pr. forsøg. Skalabjælke = 500 μm hver. Stjerner angiver signifikante forskelle fra kontrolgruppen (envejs ANOVA, efterfulgt af en Bonferroni-test) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Fluer blev fodret med fluefoder med BPB i 4 timer ved 23 °C eller 30 °C. Procentdel (%) af fluer, der viser tarmforsuring. n = 4 forsøg, 25-30 hunfluer pr. eksperiment (uparret t-test efterfulgt af ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test og Wilcoxon rangsumstest. Forkortelse: ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fylogeni af tarmforsuringsfænomen. (A) Fylogenetisk forhold mellem Drosophila-arter sammen med deres fodringsvaner og levesteder. 1 mm stang angiver 1 million år. (B) Procentdel af fluer (Drosophila-arter ), der viser tarmforsuring, fodret fluefoder med BPB i 4 timer. n = 4 forsøg, 25-30 hunfluer pr. forsøg (envejs ANOVA, efterfulgt af en Bonferroni-test). Forkortelse: ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trin i denne protokol er den korrekte dissektion af tarmen for at visualisere CCR for forsuringsfænotypen. Syren frigivet fra kobbercellerne er begrænset til CCR, når tarmen er intakt. Under dissektion kan lækage forårsaget af brud på tarmen imidlertid føre til diffusion af syre fra CCR og resultere i en tarm, der fejlagtigt scores som en negativ til forsuring. Derudover falmer den gule farve, der indikerer forsuring, inden for 5-10 minutter efter dissektion, hvilket understreger vigtigheden af at score tarme for forsuringsfænotypen kort efter isolering. Endelig er de nuværende protokoller7,8,9,10,11, der analyserer tilstanden af forsuring i fluetarmen, afhængige af tilskud af fluefoder med BPB uden hensyntagen til dyrenes fodringsstatus. Under vores undersøgelser fandt vi imidlertid, at forsuring af tarmen ikke var konstitutiv, men snarere afhængig af fodring efter tidligere sult. Som sådan kræver nøjagtig evaluering af tarmens syretilstand ved hjælp af BPB som indikator for tarmens pH-værdi overvejelse af fluens ernæringsstatus sammen med andre variabler, der overvejes.
Forsuring af tarmen bevares fra lavere multicellulære til højere organismer. Imidlertid er der lidt kendt om dets funktion hos de fleste dyr og det fulde omfang af de molekylære og cellulære veje, der regulerer det. Hos mennesker er manglende tarmforsuring forbundet med malabsorption af næringsstoffer, mens overskydende syre i tarmen kan resultere i tarmsår13. Indsigter fra forskning i tarmforsuring vil således sandsynligvis give ny indsigt i behandling og helbredelse af tarmsygdomme forårsaget af defekter i reguleringen af syresekretion.
Drosophila har for nylig vist sig som en stærk model til undersøgelse af tarmforsuring2,5,6. Genetiske undersøgelser har identificeret gener, der er nødvendige for at etablere syreudskillende celler og det maskineri, der er involveret i produktionen af syre. Narkotikaundersøgelser er også blevet udført. For eksempel forhindres forsuring af tarmen, når fluer fodres med acetazolamid, en carbonanhydrasehæmmer (CAH)7, i overensstemmelse med den centrale rolle, som CAH spiller i produktionen af protoner, der er nødvendige for syreproduktion. Vi forventer, at denne protokol vil hjælpe forskere hurtigt og omkostningseffektivt med at opdage lægemiddelhæmmere eller aktivatorer af tarmens surhedsgrad. Derudover vil anvendelsen af denne metode i kombination med genetiske og biokemiske tilgange hjælpe med at afdække de cellulære veje, der er involveret i syresekretion og lokalisere tarmforsuringens rolle i tarm- og organismehomeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender, at støtte til arbejde i forfatterens laboratorium ydes af en HHMI Faculty Scholar Award og opstartsmidler fra Children's Research Institute ved UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
