Summary
Hier stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Überwachung der Darmsäuerung bei Drosophila melanogaster mit optimalem Output vor. Wir verwenden dieses Protokoll zuerst für das Monitoring der Darmversauerung bei Drosophila melanogaster und demonstrieren dann seine Verwendung bei Nicht-Modell-Drosophila-Spezies.
Abstract
Der Fruchtfliegenmitteldarm besteht aus mehreren Regionen, von denen jede aus Zellen besteht, die einzigartige physiologische Funktionen ausführen, die für das reibungslose Funktionieren des Darms erforderlich sind. Eine solche Region, die Kupferzellregion (CCR), ist im mittleren Mitteldarm lokalisiert und besteht zum Teil aus einer Gruppe von Zellen, die als Kupferzellen bekannt sind. Kupferzellen sind an der Magensäuresekretion beteiligt, einem evolutionär konservierten Prozess, dessen genaue Rolle kaum verstanden wird. Dieses Papier beschreibt Verbesserungen im aktuellen Protokoll, das zur Untersuchung der Übersäuerung des adulten Drosophila melanogaster-Darms verwendet wird, und zeigt, dass es bei anderen Fliegenarten angewendet werden kann. Insbesondere zeigt diese Arbeit, dass die Übersäuerung des Darms vom Ernährungszustand der Fliege abhängt und stellt ein Protokoll vor, das auf diesem neuen Befund basiert. Insgesamt zeigt dieses Protokoll die potenzielle Nützlichkeit der Untersuchung von Drosophila-Kupferzellen , um allgemeine Prinzipien aufzudecken, die den Mechanismen der Darmversauerung zugrunde liegen.
Introduction
Im Insektendarm teilen Kupferzellen zelluläre und funktionelle Ähnlichkeiten mit den säureproduzierenden Magenparietalzellen (auch bekannt als oxyntisch) des Säugetiermagens. Diese Gruppe von Zellen setzt Säure in das Darmlumen frei. Die Funktion der Säuresekretion und Anatomie ist evolutionär erhalten. Die Hauptbestandteile der entladenen Säure sind Salzsäure und Kaliumchlorid. Der chemische Mechanismus der Säurebildung in den Zellen hängt von der Carboanhydrase ab. Dieses Enzym erzeugt aus CO2 und Wasser ein Bicarbonation, das ein Hydroxylion freisetzt, das dann durch eine Protonenpumpe im Austausch für Kalium in das Lumen abgegeben wird. Chlorid- und Kaliumionen werden über Leitfähigkeitskanäle in das Lumen transportiert, was zur Bildung von Salzsäure und Kaliumchlorid, dem Hauptbestandteil des Magensaftes, führt1,2,3,4.
Obwohl die Mechanismen der Säurebildung gut verstanden sind, ist viel weniger über die physiologischen Mechanismen bekannt, die die Säuresekretion regulieren. Ziel der Entwicklung dieser Methode ist es, die zellulären Wege, die die Säurebildung und -sekretion koordinieren, besser abzugrenzen und die Rolle der Säure bei der Vermittlung der Darmphysiologie und Homöostase zu bestimmen. Die Begründung für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik besteht darin, eine konsistente und zuverlässige Methode zur Untersuchung des Prozesses der Darmversauerung in Drosophila und Nicht-Modellorganismen bereitzustellen. Obwohl derzeit ein Standardprotokoll zur Bestimmung der Drosophila-Mitteldarmversauerung existiert2,5,6 wurde eine signifikante Variabilität im Ausmaß der Versauerung bei Wildtypfliegen (WT) beobachtet, während dieses Protokoll zur Untersuchung der Kupferzellfunktion verwendet wurde. Um die Grundlage für diese beobachtete Variabilität zu verstehen und konsistente Ergebnisse zu erhalten, wurden mehrere Aspekte des Standardprotokolls wie unten beschrieben optimiert.
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Protocol
HINWEIS: Die Standard-Laborlinie Oregon R wurde als WT-Steuerung verwendet. Alle Fliegen wurden auf Standard-Maismehl-Melasse-Medium (mit Melasse, Agar, Hefe, Maismehl, Tegosept, Propionsäure und Wasser) bei Raumtemperatur mit 12/12 h hell/dunkel zirkadianem Rhythmus aufgezogen.
1. Vorbereitung auf den Assay
- Sammeln Sie weibliche Fliegen (0-2 Tage alt, nicht jungfräulich) unter CO2-Anästhesie und lassen Sie sie sich mindestens 3 Tage vor den Experimenten mit Standard-Maismehlfutter erholen.
- Verhungern Sie die Fliegen für ~ 24 h bei Raumtemperatur (~ 23 ° C) in Fläschchen, die ein Laborwischtuch enthalten, das mit ~ 2 ml entionisiertem Wasser getränkt ist.
- Bereiten Sie das Fliegenfutter mit Bromphenolblau (BPB) wie folgt zu:
- Schmelzen Sie das Fliegenfutter in einer Mikrowelle und lassen Sie es dann abkühlen, bis es lauwarm ist.
- Fügen Sie 1 ml 4% BPB zu 1 ml lauwarmer Nahrung hinzu und mischen Sie gut.
- Fügen Sie mit einem Pipett das BPB-haltige Fliegenfutter in einen einzigen Punkt (~ 200 μL) in der Mitte einer Petrischale hinzu.
2. Untersuchung der Darmsäuerungsüberwachung
- Übertragen Sie ausgehungerte Fliegen in eine Petrischale mit einzelnen Punkten (200 μL) Fliegenfutter, ergänzt mit 2% Bromphenolblau (BPB). Lassen Sie die Fliegen 4 h bei Raumtemperatur nach Futter suchen, während sie Licht ausgesetzt sind.
- Sammeln Sie nach 4 h die Fliegen und betäuben Sie sie auf Eis; isolieren chirurgisch ihre Eingeweide.
- Führen Sie die Operation in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Pinzette unter einem Stereomikroskop durch (siehe Materialtabelle). Isolieren Sie den Darm, indem Sie den Thorax mit einer Pinzette halten und den Bauch mit einem zweiten Paar nach unten ziehen, bis die CCR des Darms sichtbar ist, und achten Sie darauf, dass der Darm an beiden Enden befestigt bleibt.
- Bestimmen Sie die Versauerung des Darms, indem Sie die Farbe der CCR des Darms untersuchen (Abbildung 1C; gelb zeigt angesäuert und blau bedeutet nicht angesäuert).
- Zählen Sie nur die Fliegen, die eine robuste BPB-Färbung in ihren Eingeweiden zeigen.
- Berechnen Sie den Prozentsatz mit der folgenden Gleichung:
Prozentsatz der Fliegen mit versauertem Darm = Anzahl der angesäuerten Fliegen × 100 / (Anzahl der angesäuerten Fliegen + Anzahl der nicht angesäuerten Fliegen)
HINWEIS: Ein Prozentsatz von 0 zeigt an, dass keine Fliegen ihren Darm versauert haben, während ein Prozentsatz von 100 angibt, dass alle Fliegen ihren Darm versauert haben.
3. Montage und Bilderfassung
HINWEIS: Dieser Schritt ist zusätzlich, um Bilder für die jeweiligen Bedingungen für weitere Analysen zu erfassen und zu verarbeiten, da die Proben nicht lange konserviert werden können. Diese Bilder werden nicht für die Quantifizierung des Darmsäuregehalts verwendet.
- Montieren Sie die Proben nach der Dissektion in PBS auf einem Glasobjektträger.
- Erfassen Sie die Bilder unter dem Mikroskop mit der cellSens Entry Software (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie den vorbereiteten Objektträger unter das Mikroskop und justieren Sie die Probe mit dem Okular.
- Schalten Sie das Okular aus, um den Verschluss für die Kamera zu öffnen.
- Öffnen Sie die Software auf dem angeschlossenen Computer.
- Wählen Sie die richtigen Objektive aus, klicken Sie auf die Live-Taste und wählen Sie die Standardeinstellung mit belichterzeitlicher Einstellung.
- Konzentrieren Sie sich auf die CCR-Region und machen Sie den Schnappschuss.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Schnappschussbildfenster und speichern Sie es als .tif Datei.
- Richten Sie die Bilder mit der Fidschi-Software aus und verarbeiten Sie sie weiter.
- Importieren Sie die .tif-Datei in die Fidschi-Software und löschen Sie den nicht verwandten Hintergrund.
- Passen Sie die Intensität und den Kontrast an, um die CCR und andere Darmregionen zu optimieren.
- Fügen Sie die Skalierungsleiste hinzu und speichern Sie sie als .tif Datei.
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Representative Results
Wir hungerten Oregon R weibliche Fliegen für mehr als 20 h und fütterten sie dann mit BPB (2%) für ~ 12 h, wie zuvor beschrieben7,8,9,10,11. Bromphenolblau (BPB) ist ein pH-sensorischer Farbstoff. Es wechselt von Gelb bei pH 3,0 zu Blau bei pH 4,6 und höher. Nach der Darmdissektion wurde, wie bereits berichtet, festgestellt, dass einige Fliegen Säure produzieren, wie durch die gelbe Farbe in der CCR des Darms angezeigt (Abbildung 1B). Überraschenderweise war der Darm einiger Fliegen im Gegensatz zu den veröffentlichten Ergebnissen blau, was darauf hindeutet, dass sie ihre Eingeweide nicht übersäuert hatten. Diese inkonsistenten Ergebnisse zeigten, dass das Protokoll modifiziert werden musste, um konsistente und interpretierbare Ergebnisse zu optimieren.
Um das BPB-Protokoll zu optimieren, wurden zwei neue Modifikationen integriert. Erstens, um den Beginn der Fütterung besser kontrollieren zu können, wurden Fliegen ausgehungert und dann auf Futterstellen mit BPB in der Mitte eines Tellers gelegt (Abbildung 1A). Zweitens begannen wir mit der Untersuchung der Darmsäuerung zu einem Zeitpunkt, der näher am Beginn der Fütterung lag. Weibliche Fliegen wurden für >20 h ausgehungert, versorgten Fliegenfutter mit BPB in einer kleinen Petriplattenarena (siehe Abbildung 1A) und durften für verschiedene Zeitpunkte bis 4 h füttern, während sie eingeweide in 1 h-Intervallen sezierten. Die Anzahl der versauerten Eingeweide (gelbe Farbe) und nicht angesäuerten Eingeweide (blaue Farbe) wurde bestimmt, und der Prozentsatz der Fliegen, die eine Darmversauerung zeigten, wurde für jeden Zeitpunkt berechnet (Abbildung 1B). Innerhalb von 30 Minuten hatten ~20% der Fliegen ihren Darm angesäuert. Nach einer Stunde zeigten ~ 40% der Eingeweide Anzeichen einer Übersäuerung, während nach 2 h und 3 h Fütterung der Prozentsatz der angesäuerten Eingeweide auf ~ 60% bzw. ~ 70% anstieg (Abbildung 1B). Dies deutet darauf hin, dass der Prozentsatz der Fliegen, die mit der Zeit eine Übersäuerung des Darms zeigen, zunimmt. Fast 90-95% der Eingeweide wurden angesäuert, wenn Fliegen 4 h lang gefüttert wurden (Abbildung 1B). Wir verwendeten dieses optimierte Protokoll der 4-stündigen Fütterung für nachfolgende Experimente.
Neben dem Effekt der Fütterung wurde der Einfluss der Temperatur, bei der Fliegen aufgezogen wurden, auf die Darmversauerung untersucht. Fliegen wurden bei 23 °C und 30 °C aufgezogen, und weibliche Fliegen wurden für ~20 h ausgehungert. Die Fliegen wurden dann 4 h lang mit Fliegenfutter gefüttert, das mit BPB ergänzt wurde, und der Prozentsatz der Darmversauerung wurde wie oben beschrieben bestimmt. Wir beobachteten keinen Unterschied in der Darmversauerung für diese beiden Temperaturen (Abbildung 1C), was darauf hindeutet, dass die Temperatur im Gegensatz zur Fütterung die Darmsäuerung nicht beeinflusst.
Demonstration des Darmversauerungsprotokolls für Nicht-Modellorganismen
Drosophilae-Arten sind phylogenetisch über Millionen von Jahren getrennt (siehe Abbildung 2A). Während dieser langen Zeit haben sie sich an verschiedene Lebensräume und Diäten angepasst12, was die Möglichkeit aufwirft, dass einige Arten ihren Darm nicht auf die gleiche Weise wie D. melanogaster übersäuern. Wir verwendeten D. melanogaster (Frucht), D. sechecllia (Morinda-Frucht), D. erecta (Pandanus-Frucht), D. pseudoosubcura & D. virilis (Pflanzensaft) und D. mojavensis (Kaktusfrüchte) (Abbildung 2B). Um zu zeigen, dass dieses Protokoll für andere Drosophila-Arten verwendet werden könnte, wurden diese Spezies 4 h lang mit FLIEGENFUTTER gefüttert, das mit BPB ergänzt wurde, und der Prozentsatz der Darmsäuerung wurde wie oben beschrieben bestimmt. Für alle getesteten Spezies wurde eine robuste Darmversauerung beobachtet (Abbildung 2B). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Versauerung des Darms bei verschiedenen Drosophila-Arten evolutionär konserviert ist und dass dieses Protokoll leicht für andere Organismen implementiert werden kann.
Abbildung 1: Überwachung der Darmversauerung. (A) Schematische Darstellung der Futterarena. Der blaue Punkt stellt Fliegenfutter mit Bromphenolblau (einem pH-angebenden Farbstoff) dar. Andere Flecken stellen Fruchtfliegen dar. (B) Grafische Darstellung des Prozentsatzes der Fliegen mit Darmversauerung, die für unterschiedliche Zeiträume über 4 h gefüttert wurden. Repräsentative Darmbilder eines angesäuerten Darms und eines nicht angesäuerten Darms. Der rote Pfeil zeigt die saure Freisetzung in der Kupferzellregion des Mitteldarms an. n = 4 Experimente, 25-30 weibliche Fliegen pro Experiment. Maßstabsleiste = je 500 μm. Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe hin (Einweg-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Test) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Die Fliegen wurden 4 h lang bei 23 °C oder 30 °C mit Fliegenfutter mit BPB gefüttert. Prozentsatz (%) der Fliegen mit Darmversauerung. n = 4 Experimente, 25-30 weibliche Fliegen pro Experiment (ungepaarter t-Test gefolgt von nicht-parametrischem Mann-Whitney-U-Test und Wilcoxon-Rangsummentest. Abkürzung: ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Phylogenie des Phänomens der Darmversauerung. (A) Phylogenetische Verwandtschaft der Drosophila-Arten zusammen mit ihrer Nahrungsgewohnheit und ihrem Lebensraum. 1 mm Balken zeigt 1 Million Jahre an. (B) Prozentsatz der Fliegen (Drosophila-Spezies ) mit Darmversauerung, gefüttert mit Fliegenfutter mit BPB für 4 h. n = 4 Experimente, 25-30 weibliche Fliegen pro Experiment (Einweg-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Test). Abkürzung: ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Dissektion des Darms, um die CCR für den Versauerungsphänotyp zu visualisieren. Die aus den Kupferzellen freigesetzte Säure ist auf das CCR beschränkt, wenn der Darm intakt ist. Während der Dissektion kann jedoch eine durch darmruptur verursachte Leckage zur Diffusion von Säure aus dem CCR führen und zu einem Darm führen, der fälschlicherweise als negativ für die Übersäuerung bewertet wird. Darüber hinaus verblasst die gelbe Farbe, die auf eine Ansäuerung hinweist, innerhalb von 5-10 Minuten nach der Dissektion, was die Bedeutung der Bewertung des Darms für den Säuerungsphänotyp kurz nach der Isolierung unterstreicht. Schließlich beruhen die aktuellen Protokolle7,8,9,10,11, die den Zustand der Versauerung im Fliegendarm bestimmen, auf der Supplementierung von Fliegenfutter mit BPB, ohne Berücksichtigung des Fütterungsstatus der Tiere. Während unserer Studien fanden wir jedoch heraus, dass die Versauerung des Darms nicht konstitutiv war, sondern eher von der Fütterung nach vorherigem Hungertod abhängig war. Daher erfordert eine genaue Bewertung des sauren Zustands des Darms unter Verwendung von BPB als Indikator für den pH-Wert des Darms die Berücksichtigung des Ernährungszustands der Fliege zusammen mit allen anderen Variablen, die berücksichtigt werden.
Die Versauerung des Darms wird von niedrigeren mehrzelligen zu höheren Organismen konserviert. Über seine Funktion bei den meisten Tieren und das volle Ausmaß der molekularen und zellulären Wege, die es regulieren, ist jedoch wenig bekannt. Beim Menschen ist der Mangel an Darmsäuerung mit der Malabsorption von Nährstoffen verbunden, während überschüssige Säure im Darm zu Darmgeschwüren führen kann13. So dürften Erkenntnisse aus der Forschung zur Darmversauerung neue Erkenntnisse über die Behandlung und Heilung von Darmerkrankungen liefern, die durch Defekte in der Regulation der Säuresekretion verursacht werden.
Drosophila hat sich in jüngster Zeit als leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der Darmversauerung herausgestellt2,5,6. Genetische Studien haben Gene identifiziert, die für die Etablierung von säuresekreierenden Zellen und die an der Säureproduktion beteiligten Maschinen erforderlich sind. Es wurden auch Arzneimittelstudien durchgeführt. Zum Beispiel wird eine Versauerung des Darms verhindert, wenn Fliegen mit Acetazolamid, einem Carboanhydrase (CAH) -Inhibitor7, gefüttert werden, was mit der zentralen Rolle übereinstimmt, die CAH bei der Produktion von Protonen spielt, die für die Säureproduktion notwendig sind. Wir erwarten, dass dieses Protokoll den Forschern helfen wird, schnell und kostengünstig Arzneimittelinhibitoren oder Aktivatoren der Darmsäure zu entdecken. Darüber hinaus wird die Anwendung dieser Methode in Kombination mit genetischen und biochemischen Ansätzen dazu beitragen, die zellulären Wege aufzudecken, die an der Säuresekretion beteiligt sind, und die Rolle der Darmsäuerung in der intestinalen und organismischen Homöostase zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen an, dass die Unterstützung für die Arbeit im Labor des Autors durch einen HHMI Faculty Scholar Award und Startkapital des Children's Research Institute am UT Southwestern Medical Center bereitgestellt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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