Summary
Qui, presentiamo un protocollo standardizzato per il monitoraggio dell'acidificazione intestinale in Drosophila melanogaster con un output ottimale. Per prima cosa usiamo questo protocollo per il monitoraggio dell'acidificazione intestinale in Drosophila melanogaster e poi dimostriamo il suo uso in specie di Drosophila non modello.
Abstract
Il moscerino della frutta midgut è costituito da più regioni, ognuna delle quali è composta da cellule che svolgono funzioni fisiologiche uniche necessarie per il corretto funzionamento dell'intestino. Una di queste regioni, la regione delle cellule di rame (CCR), è localizzata nel midgut medio e consiste, in parte, di un gruppo di cellule note come cellule di rame. Le cellule di rame sono coinvolte nella secrezione acida gastrica, un processo evolutivamente conservato il cui ruolo preciso è poco compreso. Questo documento descrive i miglioramenti nell'attuale protocollo utilizzato per il test per l'acidificazione dell'intestino adulto di Drosophila melanogaster e dimostra che può essere utilizzato su altre specie di mosche. In particolare, questo documento dimostra che l'acidificazione intestinale dipende dallo stato nutrizionale della mosca e presenta un protocollo basato su questa nuova scoperta. Nel complesso, questo protocollo dimostra la potenziale utilità di studiare le cellule di rame Drosophila per scoprire i principi generali alla base dei meccanismi di acidificazione intestinale.
Introduction
Nell'intestino degli insetti, le cellule di rame condividono somiglianze cellulari e funzionali con le cellule parietali gastriche produttrici di acido (note anche come ossintiche) dello stomaco dei mammiferi. Questo gruppo di cellule rilascia acido nel lume intestinale. La funzione della secrezione acida e dell'anatomia è conservata evolutivamente. I componenti principali dell'acido scaricato sono l'acido cloridrico e il cloruro di potassio. Il meccanismo chimico di formazione dell'acido nelle cellule dipende dall'anidrasi carbonica. Questo enzima genera uno ione bicarbonato da CO2 e acqua, che libera uno ione idrossile che viene poi scaricato nel lume attraverso una pompa protonica in cambio di potassio. Gli ioni cloruro e potassio vengono trasportati nel lume da canali di conduttanza con conseguente formazione di acido cloridrico e cloruro di potassio, il componente principale del succo gastrico1,2,3,4.
Sebbene i meccanismi di formazione dell'acido siano ben compresi, molto meno si sa sui meccanismi fisiologici che regolano la secrezione acida. L'obiettivo dello sviluppo di questo metodo è quello di aiutare a delineare meglio le vie cellulari che coordinano la formazione e la secrezione di acido e determinare il ruolo dell'acido nel mediare la fisiologia intestinale e l'omeostasi. Il razionale alla base dello sviluppo e dell'uso di questa tecnica è quello di fornire un metodo coerente e affidabile per studiare il processo di acidificazione intestinale nella Drosophila e negli organismi non modello. Sebbene esista attualmente un protocollo standard per determinare l'acidificazione midgut di Drosophila2,5,6, è stata osservata una significativa variabilità nell'entità dell'acidificazione nelle mosche wild-type (WT) durante l'utilizzo di questo protocollo per studiare la funzione delle cellule di rame. Per comprendere le basi di questa variabilità osservata e ottenere risultati coerenti, diversi aspetti del protocollo standard sono stati ottimizzati come descritto di seguito.
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Protocol
NOTA: La linea di laboratorio standard Oregon R è stata utilizzata come controllo WT. Tutte le mosche sono state allevate su un mezzo standard di farina di mais-melassa (contenente melassa, agar, lievito, farina di mais, tegosept, acido propionico e acqua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano chiaro / scuro di 12/12 ore.
1. Preparazione per il test
- Raccogli le mosche femmine (0-2 giorni, non vergini) in anestesia CO2 e consenti loro di recuperare sul cibo standard di farina di mais per almeno 3 giorni prima degli esperimenti.
- Affamare le mosche per ~ 24 ore a temperatura ambiente (~ 23 ° C) in fiale contenenti un tessuto di pulizia di laboratorio imbevuto di ~ 2 ml di acqua deionizzata.
- Preparare il cibo a mosca con bromophenol blue (BPB) come segue:
- Sciogliere il cibo a mosca in un forno a microonde e poi lasciarlo raffreddare fino a quando non è tiepido.
- Aggiungere 1 mL di BPB al 4% a 1 mL di cibo tiepido e mescolare bene.
- Usando un pipetto, aggiungi il cibo per mosche contenente BPB in un singolo punto (~ 200 μL) al centro di una capsula di Petri.
2. Saggio di monitoraggio dell'acidificazione intestinale
- Trasferisci le mosche affamate in una capsula di Petri contenente punti singoli (200 μL) di cibo per mosche integrato con il 2% di blu di bromofenolo (BPB). Lasciare che le mosche foraggino per 4 ore a temperatura ambiente mentre sono esposte alla luce.
- Dopo 4 ore, raccogliere le mosche e anestetizzarle sul ghiaccio; isolare chirurgicamente le loro viscere.
- Eseguire l'intervento chirurgico in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con pinza sotto stereomicroscopio (vedere la tabella dei materiali). Isolare l'intestino tenendo il torace con un paio di pinze e tirando giù l'addome con un secondo paio fino a quando il CCR dell'intestino è visibile, avendo cura di assicurarsi che l'intestino rimanga attaccato ad entrambe le estremità.
- Determinare l'acidificazione dell'intestino esaminando il colore del CCR dell'intestino (Figura 1C; il giallo indica acidificato e il blu indica non acidificato).
- Conta solo quelle mosche che mostrano una robusta colorazione BPB nelle loro viscere.
- Calcola la percentuale usando la seguente equazione:
Percentuale di mosche con budella acidificata = numero di mosche acidificate × 100 / (numero di mosche acidificate + numero di mosche non acidificate)
NOTA: Una percentuale di 0 indica che nessuna mosca ha acidificato il proprio intestino, mentre una percentuale di 100 indica che tutte le mosche hanno acidificato il loro intestino.
3. Montaggio e acquisizione di immagini
NOTA: questo passaggio è aggiuntivo per acquisire ed elaborare le immagini per le rispettive condizioni per ulteriori analisi in quanto i campioni non possono essere conservati a lungo. Queste immagini non vengono utilizzate per alcuna quantificazione dell'acidità intestinale.
- Dopo la dissezione, montare i campioni in PBS su un vetrino.
- Acquisire le immagini al microscopio utilizzando il software cellSens Entry (vedere la Tabella dei materiali).
- Posizionare il vetrino preparato sotto il microscopio e regolare il campione utilizzando l'oculare.
- Spegnere l'oculare per aprire l'otturatore della fotocamera.
- Aprire il software sul computer collegato.
- Scegli le lenti dell'obiettivo corrette, fai clic sul pulsante live e seleziona l'impostazione standard con la regolazione del tempo di esposizione.
- Concentrati sull'area CCR e scatta l'istantanea.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra dell'immagine istantanea e salvarla come file .tif.
- Allinea ed elabora ulteriormente le immagini utilizzando il software Fiji.
- Importa il file .tif nel software Fiji e cancella lo sfondo non correlato.
- Regola l'intensità e il contrasto per ottimizzare il CCR e altre regioni intestinali.
- Aggiungere la barra di scala e salvare come file .tif.
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Representative Results
Abbiamo affamato le mosche femminili dell'Oregon R per più di 20 ore e poi le abbiamo alimentate con cibo integrato con BPB (2%) per ~ 12 ore, come descritto in precedenza7,8,9,10,11. Il blu di bromofenolo (BPB) è un colorante sensibile al pH. Cambia da giallo a pH 3,0 a blu a pH 4,6 e oltre. Dopo la dissezione intestinale, come riportato in precedenza, alcune mosche sono state trovate a produrre acido come indicato dal colore giallo nel CCR dell'intestino (Figura 1B). Sorprendentemente, in contrasto con i risultati pubblicati, l'intestino di alcune mosche era blu, suggerendo che non erano riusciti ad acidificare le loro viscere. Questi risultati incoerenti indicavano che il protocollo doveva essere modificato per ottimizzare per risultati coerenti e interpretabili.
Per ottimizzare il protocollo BPB, sono state incorporate due nuove modifiche. In primo luogo, per controllare meglio l'inizio dell'alimentazione, le mosche sono state affamate e poi posizionate su punti di cibo con BPB al centro di una piastra (Figura 1A). In secondo luogo, abbiamo iniziato a testare l'acidificazione intestinale in punti temporali più vicini all'inizio dell'alimentazione. Le mosche femmine sono state affamate per >20 ore, hanno fornito cibo per mosche con BPB in una piccola arena di piastre di Petri (vedi Figura 1A) e hanno permesso di nutrirsi per vari punti temporali fino a 4 ore mentre sezionavano le viscere a intervalli di 1 ora. È stato determinato il numero di budella acidificate (colore giallo) e budella non acidificata (colore blu) e la percentuale di mosche che mostrano acidificazione intestinale è stata calcolata per ogni punto temporale (Figura 1B). Entro 30 minuti, circa il 20% delle mosche aveva acidificato il loro intestino. Dopo un'ora, ~ 40% delle viscere ha mostrato evidenza di acidificazione, mentre dopo 2 ore e 3 ore di alimentazione, la percentuale di budella acidificata è aumentata a ~ 60% e ~ 70%, rispettivamente (Figura 1B). Ciò indica che c'è un aumento della percentuale di mosche che mostrano acidificazione intestinale con il tempo. Quasi il 90-95% delle budella è stato acidificato quando le mosche sono state alimentate per 4 ore (Figura 1B). Abbiamo usato questo protocollo ottimizzato di alimentazione di 4 ore per esperimenti successivi.
Oltre all'effetto dell'alimentazione, è stato esaminato l'effetto della temperatura alla quale le mosche sono state sollevate sull'acidificazione intestinale. Le mosche sono state allevate a 23 ° C e 30 ° C, e le mosche femminili sono state affamate per ~ 20 ore. Le mosche sono state quindi alimentate con cibo a mosca integrato con BPB per 4 ore e la percentuale di acidificazione intestinale è stata determinata come descritto sopra. Non abbiamo osservato alcuna differenza nell'acidificazione intestinale per queste due temperature (Figura 1C), suggerendo che la temperatura, a differenza dell'alimentazione, non influisce sull'acidificazione intestinale.
Dimostrazione del protocollo di acidificazione intestinale per organismi non modello
Le specie di Drosophilae sono filogeneticamente separate nel corso di milioni di anni (vedi Figura 2A). In questo vasto periodo, si sono adattati a diversi habitat e diete12, aumentando la possibilità che alcune specie non acidifichino il loro intestino allo stesso modo di D. melanogaster. Abbiamo usato D. melanogaster (frutto), D. sechecllia (frutto morinda), D. erecta (frutto pandanus), D. pseudoosubcura & D. virilis (linfa delle piante) e D. mojavensis (frutti di cactus) (Figura 2B). Per dimostrare che questo protocollo potrebbe essere utilizzato per altre specie di Drosophila , queste specie sono state alimentate con alimenti a mosca integrati con BPB per 4 ore e la percentuale di acidificazione intestinale è stata determinata come descritto sopra. È stata osservata una robusta acidificazione intestinale per tutte le specie testate (Figura 2B). Questo risultato suggerisce che l'acidificazione dell'intestino è conservata evolutivamente tra diverse specie di Drosophila e che questo protocollo può essere facilmente implementato per altri organismi.
Figura 1: Monitoraggio dell'acidificazione intestinale. (A) Disegno schematico dell'arena di alimentazione. Il punto blu rappresenta il cibo volante con il blu bromofenolo (un colorante che indica il pH). Altri punti rappresentano moscerini della frutta. (B) Rappresentazione grafica della percentuale di mosche che mostrano l'acidificazione intestinale alimentate per durate diverse oltre 4 ore. Immagini intestinali rappresentative di un intestino acidificato e di un intestino non acidificato. La freccia rossa indica il rilascio acido nella regione delle cellule di rame del midgut. n = 4 esperimenti, 25-30 mosche femmine per esperimento. Barra della scala = 500 μm ciascuna. Gli asterischi indicano differenze significative rispetto al gruppo di controllo (ANOVA unidirezionale, seguito da un test Bonferroni) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Le mosche sono state alimentate con cibo volante con BPB per 4 ore a 23 °C o 30 °C. Percentuale (%) di mosche che mostrano acidificazione intestinale. n = 4 esperimenti, 25-30 mosche femmine per esperimento ( t-test spaiato seguito da test Mann-Whitney U non parametrico e test di Wilcoxon rank-sum test. Abbreviazione: ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Filogenesi del fenomeno di acidificazione intestinale. (A) Relazione filogenetica delle specie di Drosophila con la loro abitudine alimentare e habitat. La barra di 1 mm indica 1 milione di anni. (B) Percentuale di mosche (specie Drosophila ) che mostrano acidificazione intestinale, alimentate con cibo volante con BPB per 4 ore n = 4 esperimenti, 25-30 mosche femmine per esperimento (ANOVA unidirezionale, seguito da un test Bonferroni). Abbreviazione: ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un passo critico in questo protocollo è la corretta dissezione dell'intestino per visualizzare il CCR per il fenotipo di acidificazione. L'acido rilasciato dalle cellule di rame è confinato al CCR quando l'intestino è intatto. Tuttavia, durante la dissezione, la perdita causata dalla rottura dell'intestino può portare alla diffusione di acido dal CCR e provocare un intestino erroneamente valutato come negativo per l'acidificazione. Inoltre, il colore giallo indicativo di acidificazione svanisce entro 5-10 minuti dopo la dissezione, sottolineando l'importanza di segnare l'intestino per il fenotipo di acidificazione subito dopo l'isolamento. Infine, gli attuali protocolli7,8,9,10,11 che analizzano lo stato di acidificazione nell'intestino della mosca si basano sull'integrazione di cibo a mosca con BPB, senza considerare lo stato di alimentazione degli animali. Tuttavia, durante i nostri studi, abbiamo scoperto che l'acidificazione dell'intestino non era costitutiva ma piuttosto dipendente dall'alimentazione dopo la fame precedente. Pertanto, una valutazione accurata dello stato acido dell'intestino utilizzando BPB come indicatore del pH intestinale richiede la considerazione dello stato nutrizionale della mosca insieme a qualsiasi altra variabile considerata.
L'acidificazione dell'intestino è conservata da organismi multicellulari inferiori a organismi superiori. Tuttavia, si sa poco sulla sua funzione nella maggior parte degli animali e sulla piena estensione dei percorsi molecolari e cellulari che lo regolano. Nell'uomo, la mancanza di acidificazione intestinale è associata al malassorbimento dei nutrienti, mentre l'eccesso di acido nell'intestino può causare ulcere intestinali13. Pertanto, le intuizioni acquisite dalla ricerca sull'acidificazione intestinale potrebbero fornire nuove informazioni sul trattamento e la cura delle malattie intestinali causate da difetti nella regolazione della secrezione acida.
La drosophila è recentemente emersa come un potente modello per lo studio dell'acidificazione intestinale2,5,6. Studi genetici hanno identificato i geni necessari per la creazione di cellule che secernono acido e il meccanismo coinvolto nella produzione di acido. Sono stati condotti anche studi sui farmaci. Ad esempio, l'acidificazione dell'intestino viene impedita quando le mosche vengono alimentate con acetazolamide, un inibitore dell'anidrasi carbonica (CAH)7, coerente con il ruolo centrale che il CAH svolge nella produzione di protoni necessari per la produzione di acido. Ci aspettiamo che questo protocollo aiuti i ricercatori a scoprire in modo rapido ed economico inibitori o attivatori dell'acidità intestinale. Inoltre, l'applicazione di questo metodo in combinazione con approcci genetici e biochimici aiuterà a scoprire le vie cellulari coinvolte nella secrezione acida e individuare il ruolo dell'acidificazione intestinale nell'omeostasi intestinale e dell'organismo.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono che il supporto per il lavoro nel laboratorio dell'autore è fornito da un HHMI Faculty Scholar Award e fondi di avvio dal Children's Research Institute presso l'UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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