Summary
Her presenterer vi en standardisert protokoll for overvåking av tarmforsuring i Drosophila melanogaster med optimal effekt. Vi bruker først denne protokollen for tarmforsuringsovervåking i Drosophila melanogaster og demonstrerer deretter bruken i ikke-modell Drosophila-arter .
Abstract
Fruktfluen midgut består av flere regioner, som hver består av celler som utfører unike fysiologiske funksjoner som kreves for riktig funksjon av tarmen. En slik region, kobbercelleområdet (CCR), er lokalisert til midten av midgut og består delvis av en gruppe celler kjent som kobberceller. Kobberceller er involvert i gastrsyresekresjon, en evolusjonær konservert prosess hvis presise rolle er dårlig forstått. Dette dokumentet beskriver forbedringer i den nåværende protokollen som brukes til å analyse for forsuring av den voksne Drosophila melanogaster tarmen og viser at den kan brukes på andre arter av fluer. Spesielt viser dette papiret at tarmforsuring er avhengig av flyets ernæringsstatus og presenterer en protokoll basert på dette nye funnet. Samlet sett viser denne protokollen den potensielle nytten av å studere Drosophila kobberceller for å avdekke generelle prinsipper som ligger til grunn for mekanismene for tarmforsuring.
Introduction
I insekts tarmen deler kobberceller cellulære og funksjonelle likheter med de syreproduserende mageparietalcellene (også kjent som oksytisk) av pattedyrets mage. Denne gruppen av celler frigjør syre i tarmlumen. Funksjonen av syresekresjon og anatomi er evolusjonært bevart. De viktigste komponentene i den utladede syren er saltsyre og kaliumklorid. Den kjemiske mekanismen for syredannelse i cellene avhenger av karbonanhydrase. Dette enzymet genererer en bikarbonation fra CO2 og vann, som frigjør en hydroksylion som deretter slippes ut i lumen gjennom en protonpumpe i bytte mot kalium. Klorid- og kaliumioner transporteres inn i lumen ved konduktivanskanaler som resulterer i dannelse av saltsyre og kaliumklorid, hovedkomponenten i magesaft1,2,3,4.
Selv om mekanismene for syredannelse er godt forstått, er mye mindre kjent om de fysiologiske mekanismene som regulerer syresekresjon. Målet med å utvikle denne metoden er å bidra til bedre å avgrense de cellulære banene som koordinerer syredannelse og sekresjon og bestemmer syrens rolle i å formidle tarmfysiologi og homeostase. Begrunnelsen bak utviklingen og bruken av denne teknikken er å gi en konsekvent og pålitelig metode for å studere prosessen med tarmforsuring i Drosophila og ikke-modellorganismer. Selv om en standardprotokoll for å bestemme Drosophila midgut-forsuring for tiden eksisterer2,5,6, ble det observert betydelig variasjon i omfanget av forsuring i villtype (WT) fluer mens du bruker denne protokollen for å studere kobbercellefunksjon. For å forstå grunnlaget for denne observerte variasjonen og oppnå konsistente resultater, ble flere aspekter av standardprotokollen optimalisert som beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Standard laboratorielinje Oregon R ble brukt som en WT-kontroll. Alle fluer ble oppdrettet på standard maismelassemedium (som inneholder melasse, agar, gjær, maismel, tegosept, propionsyre og vann) ved romtemperatur med 12/12 t lys / mørk døgnrytme.
1. Forberedelse til analysen
- Samle kvinnelige fluer (0-2 dager gamle, ikke-jomfru) under CO2 anestesi og la dem gjenopprette på standard maismel mat i minst 3 dager før eksperimenter.
- Sult fluene i ~ 24 timer ved romtemperatur (~ 23 °C) i hetteglass som inneholder et laboratorieserviettvev gjennomvåt med ~ 2 ml deionisert vann.
- Forbered fluematen med bromofenolblå (BPB) som følger:
- Smelt flymaten i en mikrobølgeovn og la den avkjøles til den er lunken.
- Tilsett 1 ml 4% BPB til 1 ml lunken mat og bland godt.
- Bruk en pipet, tilsett fluematen som inneholder BPB i en enkelt prikk (~ 200 μL) i midten av en Petri-tallerken.
2. Overvåking av tarmforsuring
- Overfør sultne fluer til en Petri-tallerken som inneholder enkle prikker (200 μL) flymat supplert med 2% bromofenolblå (BPB). La fluene salvie i 4 timer ved romtemperatur mens de utsettes for lys.
- Etter 4 timer, samle fluene og bedøv dem på is; kirurgisk isolere tarmene sine.
- Utfør operasjonen i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) med tang under et stereomikroskop (se materialtabellen). Isoler tarmen ved å holde thoraxen med et par tang og trekke ned magen med et annet par til CCR i tarmen er synlig, og pass på at tarmen forblir festet i begge ender.
- Bestem forsuring av tarmen ved å undersøke fargen på tarmens CCR (figur 1C; gul indikerer forsuret, og blå indikerer ikke surgjort).
- Tell bare de fluene som viser robuste BPB-flekker i tarmene.
- Beregn prosenten ved hjelp av følgende formel:
Prosentandel av fluer med surgjort tarm = antall fluer surgjort × 100 / (antall fluer surgjort + antall fluer ikke-surgjort)
MERK: En prosentandel på 0 indikerer at ingen fluer surgjorde tarmen, mens en prosentandel på 100 indikerer at alle fluer surgjorde tarmen.
3. Montering og bildeanskaffelse
MERK: Dette trinnet er i tillegg til å skaffe og behandle bilder for de respektive betingelsene for videre analyser, da prøvene ikke kan bevares lenge. Disse bildene brukes ikke til noen tarmforsuring kvantifisering.
- Etter disseksjonen monterer du prøvene i PBS på en glasssklie.
- Skaff bildene under et mikroskop ved hjelp av cellSens Entry-programvaren (se materialtabellen).
- Plasser den forberedte sklien under mikroskopet og juster prøven ved hjelp av okularet.
- Slå av okularet for å åpne lukkeren for kameraet.
- Åpne programvaren på den tilkoblede datamaskinen.
- Velg de riktige objektive linsene, klikk på live-knappen , og velg standardinnstillingen med eksponeringstidsjustering.
- Fokuser på CCR-området og ta øyeblikksbildet.
- Høyreklikk på øyeblikksbildebildevinduet og lagre det som en .tif fil.
- Juster og behandle bildene ytterligere ved hjelp av Fiji-programvare.
- Importer .tif-filen i Fiji-programvaren og fjern den ikke-relaterte bakgrunnen.
- Juster intensiteten og kontrasten for å optimalisere CCR og andre tarmregioner.
- Legg til skalalinjen, og lagre som en .tif fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi sultet Oregon R kvinnelige fluer i mer enn 20 timer og matet dem deretter mat supplert med BPB (2%) i ~ 12 timer, som beskrevet tidligere7,8,9,10,11. Bromophenol blå (BPB) er en pH-sensing fargestoff. Den skifter fra gul ved pH 3,0 til blå ved pH 4.6 og over. Etter tarm disseksjon, som tidligere rapportert, ble det funnet at noen fluer produserte syre som indikert med gul farge i tarmens CCR (figur 1B). Overraskende nok, i motsetning til publiserte resultater, var tarmene til noen fluer blå, noe som tyder på at de ikke hadde klart å forsure tarmene sine. Disse inkonsekvente resultatene indikerte at protokollen måtte endres for å optimalisere for konsistente og tolkelige resultater.
For å optimalisere BPB-protokollen ble to nye modifikasjoner innlemmet. Først, for bedre å kontrollere utbruddet av fôring, ble fluer sultet og deretter plassert på flekker av mat med BPB i midten av en tallerken (figur 1A). For det andre begynte vi å analyse for tarmforsuring på tidspunkter nærmere begynnelsen av fôring. Kvinnelige fluer ble sultet i >20 timer, forutsatt flymat med BPB i en liten Petri-platearena (se figur 1A), og fikk lov til å mate for ulike tidspunkter til 4 timer mens de dissekerte tarmene med 1 t intervaller. Antall forsurede tarmer (gul farge) og ikke-forsurede tarmer (blå farge) ble bestemt, og prosentandelen fluer som viser tarmforsuring ble beregnet for hvert tidspunkt (figur 1B). Innen 30 min hadde ~ 20% av fluene surgjort tarmen. Etter en time viste ~ 40% av tarmene tegn på forsuring, mens etter 2 h og 3 h fôring økte prosentandelen surgjorte tarmer til henholdsvis ~ 60% og ~ 70%(figur 1B). Dette indikerer at det er en økning i prosentandelen fluer som viser tarmforsuring med tiden. Nesten 90-95% av tarmene ble surgjort da fluer ble matet i 4 timer (figur 1B). Vi brukte denne optimaliserte protokollen med 4 timers fôring for etterfølgende eksperimenter.
I tillegg til effekten av fôring ble effekten av temperatur der fluer ble økt på tarmforsuring undersøkt. Fluer ble oppdrettet ved 23 °C og 30 °C, og hunnfluer ble sultet i ca. 20 timer. Fluer ble deretter matet flymat supplert med BPB i 4 timer, og prosentandelen av tarmforsuring ble bestemt som beskrevet ovenfor. Vi observerte ingen forskjell i tarmforsuring for disse to temperaturene (figur 1C), noe som tyder på at temperatur, i motsetning til fôring, ikke påvirker tarmforsuring.
Tarmforsuringsprotokolldemonstrasjon for ikke-modellorganismer
Drosophilae arter er fylogentisk separert over millioner av år (se figur 2A). I løpet av denne enorme perioden har de tilpasset seg forskjellige habitater og dietter12, noe som øker muligheten for at noen arter kanskje ikke syrer tarmen på samme måte som D. melanogaster. Vi brukte D. melanogaster (frukt), D. sechecllia (morinda frukt), D. erecta (pandanus frukt), D. pseudoosubcura & D. virilis (plantesap) og D. mojavensis (kaktusfrukter) (figur 2B). For å demonstrere at denne protokollen kunne brukes til andre Drosophila-arter , ble disse artene matet flymat supplert med BPB i 4 timer, og prosentandelen av tarmforsuring ble bestemt som beskrevet ovenfor. Robust tarmforsuring ble observert for alle arter som ble testet (figur 2B). Dette resultatet antyder at forsuring av tarmen er evolusjonært bevart blant forskjellige Drosophila-arter , og at denne protokollen lett kan implementeres for andre organismer.
Figur 1: Overvåking av tarmforsuring. (A) Skjematisk tegning av fôringsarena. Den blå prikken representerer flymat med bromofenolblå (en pH-indikerende fargestoff). Andre flekker representerer fruktfluer. (B) Grafisk fremstilling av prosentandel av fluer som viser tarmforsuring matet i forskjellige varigheter over 4 timer. Representative tarmbilder av en surgjort tarm og en ikke-surgjort tarm. Den røde pilen indikerer sur frigjøring i kobbercelleområdet i midgut. n = 4 eksperimenter, 25-30 kvinnelige fluer per eksperiment. Skalastang = 500 μm hver. Stjerner indikerer signifikante forskjeller fra kontrollgruppen (enveis ANOVA, etterfulgt av en Bonferroni-test) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0.0001. (C) Fluer ble matet flymat med BPB i 4 timer ved 23 °C eller 30 °C. Prosentandel (%) av fluer som viser tarmforsuring. n = 4 eksperimenter, 25-30 kvinnelige fluer per eksperiment (uparret t-test etterfulgt av ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test og Wilcoxon rank-sum test. Forkortelse: ns = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fylogogeni av tarmforsuringsfenomen. (A) Fylogenetisk forhold til Drosophila-arter sammen med deres fôringsvane og habitat. 1 mm bar indikerer 1 million år. (B) Prosentandel av fluer (Drosophila arter) som viser tarmforsuring, matet flymat med BPB i 4 t. n = 4 eksperimenter, 25-30 kvinnelige fluer per eksperiment (enveis ANOVA, etterfulgt av en Bonferroni-test). Forkortelse: ns = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skritt i denne protokollen er riktig disseksjon av tarmen for å visualisere CCR for forsuring fenotype. Syren som frigjøres fra kobbercellene er begrenset til CCR når tarmen er intakt. Men under disseksjonen kan lekkasje forårsaket av brudd i tarmen føre til diffusjon av syre fra CCR og resultere i at tarmen feilaktig skårer som et negativt for forsuring. I tillegg falmer den gule fargen som indikerer forsuring innen 5-10 min etter disseksjon, og understreker viktigheten av å score tarmer for forsuringsfenotypen kort tid etter isolasjon. Til slutt er dagens protokoller7,8,9,10,11 som analysen av tilstanden for forsuring i fly tarmen avhengig av tilskudd av flymat med BPB, uten hensyn til dyrenes fôringsstatus. Men i løpet av studiene fant vi ut at forsuring av tarmen ikke var konstituerende, men heller avhengig av fôring etter tidligere sult. Som sådan krever nøyaktig evaluering av syretilstanden til tarmen ved hjelp av BPB som en indikator på tarmpH hensyn til flyets ernæringsstatus sammen med eventuelle andre variabler som vurderes.
Forsuring av tarmen er bevart fra lavere multicellulære til høyere organismer. Imidlertid er lite kjent om funksjonen hos de fleste dyr og hele omfanget av de molekylære og cellulære banene som regulerer den. Hos mennesker er mangel på tarmforsuring forbundet med malabsorpsjon av næringsstoffer, mens overflødig syre i tarmen kan føre til tarmsår13. Dermed vil innsikt fra forskning på tarmforsuring sannsynligvis gi ny innsikt i behandling og kur av tarmsykdommer forårsaket av feil i reguleringen av syresekresjon.
Drosophila har nylig dukket opp som en kraftig modell for studiet av tarmforsuring2,5,6. Genetiske studier har identifisert gener som kreves for etablering av syreskillende celler og maskineriet som er involvert i produksjon av syre. Det er også utført legemiddelstudier. For eksempel forhindres forsuring av tarmen når fluer mates acetazolamid, en karbonanhydrase (CAH) inhibitor7, i samsvar med den sentrale rollen CAH spiller i produksjonen av protoner som er nødvendige for syreproduksjon. Vi forventer at denne protokollen vil hjelpe forskere raskt og kostnadseffektivt med å oppdage legemiddelhemmere eller aktivatorer av tarmsyre. I tillegg vil anvendelsen av denne metoden i kombinasjon med genetiske og biokjemiske tilnærminger bidra til å avdekke de cellulære veiene som er involvert i syresekresjon og finne rollen som tarmforsuring i tarm- og organismal homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner at støtte til arbeid i forfatterens laboratorium er gitt av en HHMI Faculty Scholar Award og oppstartsmidler fra Children's Research Institute ved UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
