Summary
Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para monitoramento da acidificação intestinal em Drosophila melanogaster com ótima saída. Primeiro usamos este protocolo para monitoramento da acidificação intestinal em Drosophila melanogaster e, em seguida, demonstramos seu uso em espécies não-modelo de Drosophila .
Abstract
O midgut mosca-das-frutas consiste em múltiplas regiões, cada uma das quais é composta de células que realizam funções fisiológicas únicas necessárias para o bom funcionamento do intestino. Uma dessas regiões, a região da célula de cobre (CCR), é localizada até o meio médio e consiste, em parte, de um grupo de células conhecidas como células de cobre. As células de cobre estão envolvidas na secreção do ácido gástrico, um processo evolutivamente conservado cujo papel preciso é mal compreendido. Este artigo descreve melhorias no protocolo atual usado para avaliar a acidificação do intestino melanogaster drosophila adulto e demonstra que pode ser usado em outras espécies de moscas. Em particular, este artigo demonstra que a acidificação intestinal depende do estado nutricional da mosca e apresenta um protocolo baseado neste novo achado. No geral, este protocolo demonstra a utilidade potencial de estudar células de cobre de Drosophila para descobrir princípios gerais subjacentes aos mecanismos de acidificação intestinal.
Introduction
No intestino do inseto, as células de cobre compartilham semelhanças celulares e funcionais com as células parietal gástricas produtoras de ácido (também conhecidas como oxíntica) do estômago mamífero. Este grupo de células libera ácido no lúmen intestinal. A função da secreção ácida e da anatomia é evolutivamente conservada. Os principais componentes do ácido descarregado são o ácido clorídrico e o cloreto de potássio. O mecanismo químico da formação de ácido nas células depende da anidrádrase carbônica. Esta enzima gera um íon bicarbonato de CO2 e água, que libera um íon hidroxyl que é então descarregado no lúmen através de uma bomba de prótons em troca de potássio. Os íons de cloreto e potássio são transportados para o lúmen por canais de condutância que resultam na formação de ácido clorídrico e cloreto de potássio, principal componente do suco gástrico1,2,3,4.
Embora os mecanismos de formação de ácido sejam bem compreendidos, muito menos se sabe sobre os mecanismos fisiológicos que regulam a secreção ácida. O objetivo do desenvolvimento deste método é ajudar a delinear melhor as vias celulares que coordenam a formação e secreção de ácidos e determinar o papel do ácido na mediação da fisiologia intestinal e da homeostase. A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é fornecer um método consistente e confiável para estudar o processo de acidificação intestinal em Drosophila e organismos não-modelo. Embora exista atualmente um protocolo padrão para determinar a acidificação de drosophila midgut, atualmente existe 2,5,6, observou-se variabilidade significativa na extensão da acidificação em moscas do tipo selvagem (TG) ao usar este protocolo para estudar a função celular de cobre. Para compreender a base dessa variabilidade observada e obter resultados consistentes, vários aspectos do protocolo padrão foram otimizados conforme descrito abaixo.
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Protocol
NOTA: A linha de laboratório padrão Oregon R foi usada como controle WT. Todas as moscas foram criadas em meio padrão de fubá-melaço (contendo melaço, ágar, levedura, farinha de milho, tegosept, ácido propiônico e água) em temperatura ambiente com 12/12 h de ritmo circadiano claro/escuro.
1. Preparando-se para o ensaio
- Coletar moscas fêmeas (0-2 dias de idade, não virgem) sob anestesia de CO2 e permitir que elas se recuperem em alimentos padrão de farinha de milho por pelo menos 3 dias antes dos experimentos.
- Esfurre as moscas por ~24 h à temperatura ambiente (~23 °C) em frascos contendo um tecido limpo de laboratório encharcado com ~2 mL de água desionizada.
- Prepare a comida de mosca com azul bromofenol (BPB) da seguinte forma:
- Derreta a comida de mosca em um micro-ondas e deixe esfriar até ficar morna.
- Adicione 1 mL de 4% de BPB a 1 mL de alimentos mornos e misture bem.
- Usando uma pipeta, adicione o alimento de mosca contendo BPB em um único ponto (~200 μL) no centro de uma placa de Petri.
2. Ensaio de monitoramento da acidificação intestinal
- Transfira moscas famintas em uma placa de Petri contendo pontos únicos (200 μL) de alimentos de mosca suplementados com 2% de azul bromofenol (BPB). Deixe as moscas forragearem por 4h à temperatura ambiente enquanto expostas à luz.
- Depois das 4h, recolhe as moscas e anestesia-as no gelo; cirurgicamente isolar suas entranhas.
- Realize a cirurgia em soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS) com fórceps sob um estereoscópio (ver a Tabela de Materiais). Isole o intestino segurando o tórax com um par de fórceps e puxando o abdômen com um segundo par até que a CCR do intestino seja visível, tomando cuidado para garantir que o intestino permaneça preso em ambas as extremidades.
- Determinar a acidificação do intestino examinando a cor da CCR do intestino (Figura 1C; amarelo indica acidificado, e azul indica não acidificado).
- Conte apenas as moscas que mostram uma forte mancha de BPB em suas entranhas.
- Calcule a porcentagem usando a seguinte equação:
Porcentagem de moscas com tripas acidificadas = número de moscas acidificadas × 100 / (número de moscas acidificadas + número de moscas não acidificadas)
NOTA: Uma porcentagem de 0 indica que nenhuma mosca acidificou seu intestino, enquanto uma porcentagem de 100 indica que todas as moscas acidificaram seu intestino.
3. Montagem e aquisição de imagens
NOTA: Esta etapa é adicional para adquirir e processar imagens para as respectivas condições para novas análises, uma vez que as amostras não podem ser preservadas por muito tempo. Estas imagens não estão sendo usadas para qualquer quantificação de acidez intestinal.
- Após a dissecação, monte as amostras em PBS em um slide de vidro.
- Adquira as imagens sob um microscópio usando o software CellSens Entry (veja a Tabela de Materiais).
- Coloque o slide preparado sob o microscópio e ajuste a amostra usando a ocular.
- Desligue a ocular para abrir o obturador para a câmera.
- Abra o software no computador conectado.
- Escolha as lentes objetivas corretas, clique no botão ao vivo e selecione a configuração padrão com ajuste de tempo do expostor.
- Concentre-se na região da CCR e tire a foto.
- Clique com o botão direito do mouse na janela de imagem snapshot e salve-a como um arquivo .tif.
- Alinhe e processe ainda mais as imagens usando o software Fiji.
- Importe o arquivo .tif no software Fiji e limpe o fundo não relacionado.
- Ajuste a intensidade e o contraste para otimizar a CCR e outras regiões intestinais.
- Adicione a barra de escala e salve como um arquivo .tif.
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Representative Results
Passamos fome de moscas do Oregon R por mais de 20 h e depois alimentamos-as com BPB (2%) por ~12 h, como descrito anteriormente7,8,9,10,11. Bromophenol blue (BPB) é um corante de pH. Ele muda de amarelo em pH 3.0 para azul em pH 4.6 ou superior. Após dissecção intestinal, como relatado anteriormente, algumas moscas foram encontradas para produzir ácido como indicado pela cor amarela na CCR do intestino (Figura 1B). Surpreendentemente, ao contrário dos resultados publicados, os intestinos de algumas moscas eram azuis, sugerindo que eles não tinham conseguido acidificar suas entranhas. Esses resultados inconsistentes indicaram que o protocolo precisava ser modificado para otimizar para resultados consistentes e interpretatáveis.
Para otimizar o protocolo bpb, duas novas modificações foram incorporadas. Primeiro, para controlar melhor o início da alimentação, as moscas passavam fome e depois colocadas em pontos de alimentação com BPB no centro de um prato (Figura 1A). Em segundo lugar, começamos a avaliar a acidificação intestinal em pontos de tempo mais próximos do início da alimentação. Moscas fêmeas estavam famintas por >20 h, forneceu comida de mosca com BPB em uma pequena arena de placas de Petri (ver Figura 1A), e permitiu alimentar por vários pontos de tempo até 4h enquanto dissecava tripas em intervalos de 1h. O número de tripas acidificadas (cor amarela) e tripas não acidificadas (cor azul) foi determinado, e a porcentagem de moscas mostrando acidificação intestinal foi calculada para cada ponto de tempo (Figura 1B). Dentro de 30 minutos, ~20% das moscas acidificaram seu intestino. Após uma hora, ~40% das tripas apresentaram evidências de acidificação, enquanto após 2h e 3h de alimentação, a porcentagem de tripas acidificadas aumentou para ~60% e ~70%, respectivamente (Figura 1B). Isso indica que há um aumento na porcentagem de moscas mostrando acidificação intestinal com o tempo. Quase 90-95% das tripas foram acidificadas quando as moscas foram alimentadas por 4h (Figura 1B). Usamos este protocolo otimizado de alimentação de 4h para experimentos subsequentes.
Além do efeito da alimentação, foi examinado o efeito da temperatura em que as moscas foram criadas na acidificação intestinal. As moscas foram criadas a 23 °C e 30 °C, e as moscas fêmeas morreram de fome por ~20 h. As moscas foram então alimentadas com alimentos de mosca suplementados com BPB por 4h, e a porcentagem de acidificação intestinal foi determinada como descrito acima. Não observou diferença na acidificação intestinal para essas duas temperaturas (Figura 1C), sugerindo que a temperatura, ao contrário da alimentação, não afeta a acidificação intestinal.
Demonstração do protocolo de acidificação intestinal para organismos não-modelo
As espécies de drosophilae são filogeneticamente separadas ao longo de milhões de anos (ver Figura 2A). Durante este vasto período, eles se adaptaram a diferentes habitats e dietas12, levantando a possibilidade de que algumas espécies podem não acidificar seu intestino da mesma forma que D. melanogaster. Usamos D. melanogaster (fruta), D. sechecllia (fruta morinda), D. erecta (fruta pandanus), D. pseudoosubcura & D. virilis (seiva vegetal) e D. mojavensis (frutos do cacto) (Figura 2B). Para demonstrar que este protocolo poderia ser usado para outras espécies de Drosophila, essas espécies foram alimentadas com alimentos de mosca suplementados com BPB por 4h, e a porcentagem de acidificação intestinal foi determinada como descrito acima. Observou-se acidificação intestinal robusta para todas as espécies testadas (Figura 2B). Este resultado sugere que a acidificação do intestino é evolutivamente conservada entre diversas espécies de Drosophila e que este protocolo pode ser facilmente implementado para outros organismos.
Figura 1: Monitoramento da acidificação intestinal. (A) Desenho esquemático da arena de alimentação. O ponto azul representa comida de mosca com azul bromofenol (um corante indicando pH). Outros pontos representam moscas frutíferas. (B) Representação gráfica da porcentagem de moscas que demonstram acidificação intestinal alimentada por diferentes durações acima de 4h. Imagens do intestino representativas de um intestino acidificado e um intestino não acidificado. A seta vermelha indica liberação ácida na região da célula de cobre do midgut. n = 4 experimentos, 25-30 moscas fêmeas por experimento. Barra de escala = 500 μm cada. Asteriscos indicam diferenças significativas do grupo controle (ANOVA unidirecional, seguido de um teste de Bonferroni) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) As moscas foram alimentadas com alimentos de mosca com BPB por 4 h a 23 °C ou 30 °C. Percentual (%) de moscas mostrando acidificação intestinal. n = 4 experimentos, 25-30 moscas fêmeas por experimento (teste t não pago seguido de teste não paramétrico Mann-Whitney U e teste de classificação wilcoxon. Abreviação: ns = não significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Filogenia do fenômeno da acidificação intestinal. (A) Relação filogenética das espécies de Drosophila , juntamente com seu hábito alimentar e habitat. 1 mm de barra indica 1 milhão de anos. (B) Percentual de moscas (espécies de Drosophila ) que mostram acidificação intestinal, alimentadas com bpb por 4 h. n = 4 experimentos, 25-30 moscas fêmeas por experimento (ANOVA unidirecional, seguida de um teste de Bonferroni). Abreviação: ns = não significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um passo crítico neste protocolo é a dissecação adequada do intestino para visualizar a CCR para o fenótipo de acidificação. O ácido liberado das células de cobre está confinado à CCR quando o intestino está intacto. No entanto, durante a dissecção, o vazamento causado pela ruptura do intestino pode levar à difusão de ácido da CCR e resultar em um intestino erroneamente marcado como negativo para acidificação. Além disso, a cor amarela indicativa de acidificação desaparece dentro de 5-10 minutos após a dissecação, ressaltando a importância de marcar intestinos para o fenótipo de acidificação logo após o isolamento. Por fim, os protocolos atuais7,8,9,10,11 que avaliam o estado de acidificação no intestino mosca dependem da suplementação de alimentos-mosca com BPB, sem considerar o estado alimentar dos animais. No entanto, durante nossos estudos, descobrimos que a acidificação do intestino não era constitutiva, mas sim dependente da alimentação após a fome prévia. Como tal, uma avaliação precisa do estado ácido do intestino usando o BPB como indicador de pH intestinal requer a consideração do estado nutricional da mosca, juntamente com quaisquer outras variáveis que estão sendo consideradas.
A acidificação do intestino é conservada de organismos multicelulares inferiores a organismos superiores. No entanto, pouco se sabe sobre sua função na maioria dos animais e toda a extensão das vias moleculares e celulares que a regulam. Em humanos, a falta de acidificação intestinal está associada à má absorção de nutrientes, enquanto o excesso de ácido no intestino pode resultar em úlceras intestinais13. Assim, os insights obtidos a partir de pesquisas sobre acidificação intestinal provavelmente fornecerão novas percepções sobre o tratamento e a cura de doenças intestinais causadas por defeitos na regulação da secreção ácida.
A drosophila emergiu recentemente como um modelo poderoso para o estudo da acidificação intestinal2,5,6. Estudos genéticos identificaram genes necessários para o estabelecimento de células segregadoras de ácido e do maquinário envolvido na produção de ácido. Também foram realizados estudos sobre drogas. Por exemplo, a acidificação do intestino é prevenida quando as moscas são alimentadas com acetazolamida, um inibidor de anidrágora carbônica (CAH), consistente com o papel central que o CAH desempenha na produção de prótons necessários para a produção de ácido. Esperamos que este protocolo ajude os pesquisadores a descobrir rapidamente e de forma econômica os inibidores de drogas ou ativadores da acidez intestinal. Além disso, a aplicação deste método em combinação com abordagens genéticas e bioquímicas ajudará a descobrir as vias celulares envolvidas na secreção ácida e identificar o papel da acidificação intestinal na homeostase intestinal e organismo.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem que o apoio ao trabalho no laboratório do autor é fornecido por um Prêmio HHMI Faculty Scholar e fundos de startup do Instituto de Pesquisa Infantil do UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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