Summary
Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för övervakning av gut försurning i Drosophila melanogaster med optimal utgång. Vi använder först detta protokoll för tarmförsurning övervakning i Drosophila melanogaster och sedan visa dess användning i icke-modell Drosophila arter.
Abstract
Fruktflugan midgut består av flera regioner, som var och en består av celler som utför unika fysiologiska funktioner som krävs för att tarmen ska fungera korrekt. En sådan region, kopparcellsområdet (CCR), är lokaliserad till mitten av mitten av geväret och består delvis av en grupp celler som kallas kopparceller. Kopparceller är involverade i magsyrautsöndring, en evolutionärt bevarad process vars exakta roll är dåligt förstådd. Detta dokument beskriver förbättringar i det nuvarande protokollet som används för att analysera försurning av den vuxna Drosophila melanogaster gut och visar att det kan användas på andra arter av flugor. I synnerhet visar detta dokument att tarmförsurning är beroende av flugans näringsstatus och presenterar ett protokoll baserat på detta nya fynd. Sammantaget visar detta protokoll den potentiella nyttan av att studera Drosophila kopparceller för att avslöja allmänna principer som ligger till grund för mekanismerna för gut försurning.
Introduction
I insektsmagen delar kopparceller cellulära och funktionella likheter med de syraproducerande magparietala cellerna (även känd som oxyntic) i däggdjursmagen. Denna grupp av celler släpper ut syra i tarmlumen. Funktionen av syrautsöndring och anatomi bevaras evolutionärt. De viktigaste komponenterna i den urladdade syran är saltsyra och kaliumklorid. Den kemiska mekanismen för syrabildning i cellerna beror på kolsyrahydras. Detta enzym genererar en bikarbonatjon från CO2 och vatten, som frigör en kolxyljon som sedan släpps ut i lumen genom en protonpump i utbyte mot kalium. Klorid och kaliumjoner transporteras in i lumen genom ledningskanaler som resulterar i bildandet av saltsyra och kaliumklorid, huvudkomponenten i magsaft1,2,3,4.
Även om mekanismerna för syrabildning är väl förstådda, är mycket mindre känt om de fysiologiska mekanismerna som reglerar sur utsöndring. Målet med att utveckla denna metod är att hjälpa till att bättre avgränsa de cellulära vägarna som samordnar syrabildning och utsöndring och bestämma syrans roll för att medla tarmfysiologi och homeostas. Grunden bakom utvecklingen och användningen av denna teknik är att tillhandahålla en konsekvent och pålitlig metod för att studera processen för tarmförsurning i Drosophila och icke-modellorganismer. Även om det för närvarande finns ett standardprotokoll för bestämning av Drosophila midgut-försurning2,5,6, observerades signifikant variabilitet i omfattningen av försurning i vilda (WT) flugor när man använde detta protokoll för att studera kopparcellsfunktionen. För att förstå grunden för denna observerade variabilitet och få konsekventa resultat optimerades flera aspekter av standardprotokollet enligt beskrivningen nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Standardlaboratoriumlinjen Oregon R användes som en WT-kontroll. Alla flugor uppfödds på standard majsmjöl-melass medium (innehållande melass, agar, jäst, majsmjöl, tegosept, propionsyra och vatten) vid rumstemperatur med 12/12 h ljus /mörk dygnsrytm.
1. Förberedelser för analysen
- Samla kvinnliga flugor (0-2 dagar gamla, icke-jungfruliga) under CO2-anestesi och låt dem återhämta sig på standard majsmjölsmat i minst 3 dagar före experiment.
- Svält flugorna i ~24 h vid rumstemperatur (~23 °C) i injektionsflaska som innehåller en laboratorieservettvävnad som blötläggs med ~2 ml avjoniserat vatten.
- Förbered flugmat med bromofenolblå (BPB) enligt följande:
- Smält flugmaten i en mikrovågsugn och låt den svalna tills den är ljummen.
- Tillsätt 1 ml 4% BPB till 1 ml ljummen mat och blanda väl.
- Tillsätt flugmat som innehåller BPB i en enda punkt (~200 μL) i mitten av en Petri-skål.
2. Övervakningsanalys för försurning av tarmen
- Överför svältande flugor till en Petri-maträtt som innehåller enstaka prickar (200 μL) flugmat kompletterad med 2% bromfenolblå (BPB). Låt flugorna båda i 4 timmar vid rumstemperatur medan de utsätts för ljus.
- Efter 4 h, samla flugorna och bedöva dem på is; kirurgiskt isolera deras tarmar.
- Utför operationen i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med tång under ett stereomikroscope (se materialtabellen). Isolera tarmen genom att hålla bröstkorgen med ett par tångar och dra ner buken med ett andra par tills tarmens CCR är synlig, var noga med att se till att tarmarna förblir fastsatta i båda ändarna.
- Bestäm försurningen av tarmen genom att undersöka färgen på tarmens CCR (figur 1C; gul indikerar surnad och blå indikerar inte sur).
- Räkna bara de flugor som visar robust BPB-färgning i magen.
- Beräkna procentsatsen med hjälp av följande ekvation:
Procentandel flugor med försurade tarmar = antal flugor som surgjorts × 100 / (antal flugor försurade + antal flugor som inte surgjorts)
OBS: En procentandel av 0 indikerar att inga flugor surnade tarmen, medan en procentandel av 100 indikerar att alla flugor surnade tarmen.
3. Montering och bildförvärv
OBS: Detta steg är ytterligare att förvärva och bearbeta bilder för respektive villkor för ytterligare analyser eftersom proverna inte kan bevaras länge. Dessa bilder används inte för någon kvantifiering av tarmsyran.
- Montera proverna i PBS på en glasrutschbana efter dissekering.
- Hämta bilderna under ett mikroskop med hjälp av cellSens Entry-programvara (se tabellen över material).
- Placera den förberedda bilden under mikroskopet och justera provet med okularet.
- Stäng av okularet för att öppna slutaren för kameran.
- Öppna programvaran på den anslutna datorn.
- Välj rätt objektiv, klicka på live-knappen och välj standardinställningen med justering av exponeringstid.
- Fokusera på CCR-regionen och ta ögonblicksbilden.
- Högerklicka på ögonblicksbildfönstret och spara den som en .tif fil.
- Justera och bearbeta bilderna ytterligare med fijiprogramvara.
- Importera .tif-filen i Fiji-programvaran och rensa den orelaterade bakgrunden.
- Justera intensiteten och kontrasten för att optimera CCR och andra tarmregioner.
- Lägg till skalstrecket och spara som en .tif fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi svalt Oregon R kvinnliga flugor i mer än 20 h och sedan mata dem med mat kompletterad med BPB (2%) för ~ 12 h, som beskrivits tidigare7,8,9,10,11. Bromofenolblå (BPB) är ett pH-avkännande färgämne. Den ändras från gult vid pH 3,0 till blått vid pH 4,6 och högre. Efter tarmdisekering, som tidigare rapporterats, visade sig vissa flugor producera syra som indikeras av gul färg i tarmens CCR (figur 1B). Överraskande, i motsats till publicerade resultat, var tarmarna hos vissa flugor blå, vilket tyder på att de hade misslyckats med att försura sina tarmar. Dessa inkonsekventa resultat indikerade att protokollet behövde ändras för att optimera för konsekventa och tolkningsbara resultat.
För att optimera BPB-protokollet införlivades två nya ändringar. Först, för att bättre kontrollera uppkomsten av utfodring, svälte flugor och placerades sedan på fläckar av mat med BPB i mitten av en tallrik (figur 1A). För det andra började vi analysera för tarmförsurning vid tidpunkter närmare början av utfodring. Kvinnliga flugor svalt i >20 h, försåg flugmat med BPB i en liten Petri-tallriksarena (se figur 1A) och fick mata i olika tidpunkter fram till 4 timmar medan de dissekerade inälvor med 1 h intervall. Antalet surnade tarmar (gul färg) och icke-surnade tarmar (blå färg) bestämdes, och andelen flugor som visar tarmförsurning beräknades för varje tidspunkt (figur 1B). Inom 30 min hade ~20% av flugorna surnat tarmen. Efter en timme visade ~ 40% av tarmarna tecken på försurning, medan efter 2 h och 3 h utfodring ökade andelen försurade tarmar till ~ 60% respektive ~ 70%, (figur 1B). Detta indikerar att det finns en ökning av andelen flugor som visar tarmförsurning med tiden. Nästan 90-95% av tarmarna surnade när flugor matades i 4 h (figur 1B). Vi använde detta optimerade protokoll på 4 h utfodring för efterföljande experiment.
Förutom effekten av utfodring undersöktes effekten av temperaturen vid vilken flugor höjdes på tarmförsurningen. Flugor uppföddes vid 23 °C och 30 °C, och kvinnliga flugor svalt i ~ 20 h. Flugor matades sedan flugmat kompletterat med BPB i 4 timmar, och procenten av tarmförsurningen bestämdes enligt beskrivningen ovan. Vi observerade ingen skillnad i tarmförsurning för dessa två temperaturer (figur 1C), vilket tyder på att temperaturen, till skillnad från utfodring, inte påverkar tarmförsurningen.
Demonstration av tarmförsurningsprotokoll för icke-modellorganismer
Drosophilae arter är fylogenetiskt åtskilda över miljontals år (se figur 2A). Under denna stora period har de anpassat sig till olika livsmiljöer och dieter12, vilket ökar möjligheten att vissa arter inte kan försura tarmen på samma sätt som D. melanogaster. Vi använde D. melanogaster (frukt), D. sechecllia (morindafrukt), D. erecta (pandanusfrukt), D. pseudoosubcura & D. virilis (växtsoppa) och D. mojavensis (kaktusfrukter) (figur 2B). För att visa att detta protokoll kunde användas för andra Drosophila arter, dessa arter utfodrades flugmat kompletteras med BPB för 4 h, och procenten av gut försurning fastställdes enligt beskrivningen ovan. Robust tarmförsurning observerades för alla testade arter (figur 2B). Detta resultat tyder på att försurning av tarmen är evolutionärt bevarad bland olika Drosophila arter och att detta protokoll lätt kan genomföras för andra organismer.
Figur 1: Övervakning av tarmförsurning.A) Schematisk ritning av utfodringsarenan. Den blå pricken representerar flugmat med bromofenolblå (ett pH-indikeringsfärgämne). Andra fläckar representerar fruktflugor. B) Grafisk representation av andelen flugor som visar försurning av tarmen under olika perioder över 4 timmar. Representativa tarmbilder av en surnad tarm och en icke-surnad tarm. Den röda pilen indikerar sur frisättning i kopparcellsregionen i midguten. n = 4 experiment, 25-30 kvinnliga flugor per experiment. Skalstång = 500 μm vardera. Asterisker indikerar signifikanta skillnader från kontrollgruppen (enkelriktad ANOVA, följt av ett Bonferroni-test) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. C) Flugor utfodrades med flugmat med BPB i 4 timmar vid 23 °C eller 30 °C. Procentandel (%) av flugor som visar tarmförsurning. n = 4 experiment, 25-30 kvinnliga flugor per experiment (oparat t-test följt av icke-parametriskt Mann-Whitney U-test och Wilcoxon rank-sum test. Förkortning: ns = ej signifikant. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Fylogeni av tarmförsurningsfenomen. (A) Fylogenetiskt förhållande mellan Drosophila-arter tillsammans med deras matvanor och livsmiljö. 1 mm bar indikerar 1 miljon år. (B) Procentandel flugor (Drosophila-arter ) som visar försurning av tarmen, utfodras med flugmat med BPB i 4 timmar n = 4 experiment, 25–30 honflugor per experiment (enkelriktad ANOVA, följt av ett Bonferroni-test). Förkortning: ns = ej signifikant. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg i detta protokoll är korrekt dissekering av tarmen för att visualisera CCR för försurning fenotyp. Syran som frigörs från kopparcellerna begränsas till CCR när tarmen är intakt. Under dissekering kan läckage som orsakas av bristning i tarmarna leda till diffusion av syra från CCR och resultera i en tarm som felaktigt poängsatts som en negativ försurning. Dessutom bleknar den gula färgen som indikerar försurning inom 5-10 min efter dissekering, vilket understryker vikten av att poängsätta tarmarna för försurningsfenotypen strax efter isolering. Slutligen förlitar sig nuvarande protokoll7,8,9,10,11 som består av försurningstillståndet i flugmagen på tillskott av flugmat med BPB, utan hänsyn till djurens utfodringsstatus. Men under våra studier fann vi att försurning av tarmen inte var konstituerande utan snarare beroende av utfodring efter tidigare svält. En korrekt utvärdering av tarmens sura tillstånd med bpb som indikator på pH i tarmen kräver därför att man tar hänsyn till flugans näringsstatus tillsammans med andra variabler som beaktas.
Försurning av tarmen bevaras från lägre multicellulära till högre organismer. Men lite är känt om dess funktion hos de flesta djur och den fulla omfattningen av de molekylära och cellulära vägar som reglerar den. Hos människor är brist på tarmförsurning förknippad med malabsorption av näringsämnen, medan överskott av syra i tarmen kan leda till tarmsår13. Således kommer insikter från forskning om tarmförsurning sannolikt att ge nya insikter om behandling och botemedel av tarmsjukdomar som orsakas av defekter i regleringen av syrasekresion.
Drosophila har nyligen dykt upp som en kraftfull modell för studier av tarmförsurning2,5,6. Genetiska studier har identifierat gener som krävs för att etablera syrautsöndrande celler och de maskiner som är involverade i produktionen av syra. Läkemedelsstudier har också utförts. Till exempel förhindras försurning av tarmen när flugor matas acetazolamid, en kolsyra anhydras (CAH) hämmare7, i överensstämmelse med den centrala roll som CAH spelar i produktionen av protoner som är nödvändiga för syraproduktion. Vi förväntar oss att detta protokoll hjälper forskare att snabbt och kostnadseffektivt upptäcka läkemedelshämmare eller aktivatorer av tarmsyra. Dessutom kommer tillämpningen av denna metod i kombination med genetiska och biokemiska metoder att hjälpa till att avslöja de cellulära vägarna som är involverade i syrasekrende och fastställa tarmförsurningens roll i tarm- och organismhemostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner att stöd för arbete i författarens laboratorium tillhandahålls av en HHMI Faculty Scholar Award och startfonder från Children's Research Institute vid UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
