Summary
Burada, Drosophila melanogaster'daki bağırsak asitleşmesini optimal çıkışla izlemek için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü ilk olarak Drosophila melanogaster'da bağırsak asitleştirme izleme için kullanıyoruz ve daha sonra model olmayan Drosophila türlerinde kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Meyve sineği midgut, her biri bağırsakların düzgün çalışması için gerekli benzersiz fizyolojik işlevleri yerine getiren hücrelerden oluşan birden fazla bölgeden oluşur. Bu bölgelerden biri olan bakır hücre bölgesi (CCR), orta ortaguta lokalizedir ve kısmen bakır hücre olarak bilinen bir grup hücreden oluşur. Bakır hücreler, kesin rolü yetenemeyen evrimsel olarak korunmuş bir süreç olan mide asidi salgılanmasına dahil olur. Bu makale, yetişkin Drosophila melanogaster bağırsağın asitleştirilmesi için kullanılan mevcut protokoldeki gelişmeleri açıklar ve diğer sinek türlerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Özellikle, bu makale bağırsak asitleşmesinin sineğin beslenme durumuna bağlı olduğunu göstermektedir ve bu yeni bulguya dayanan bir protokol sunun. Genel olarak, bu protokol, bağırsak asitleştirme mekanizmalarının altında yer alan genel ilkeleri ortaya çıkarmak için Drosophila bakır hücrelerini incelemenin potansiyel yararlılığını göstermektedir.
Introduction
Böcek bağırsasında, bakır hücreler memeli midesinin asit üreten mide parietal hücreleri (oksintik olarak da bilinir) ile hücresel ve fonksiyonel benzerlikleri paylaşır. Bu hücre grubu bağırsak lümenine asit salgılar. Asit salgısı ve anatomisinin işlevi evrimsel olarak korunur. Boşaltılan asidin ana bileşenleri hidroklorik asit ve potasyum klorürdür. Hücrelerde asit oluşumunun kimyasal mekanizması karbonik anhidre bağlıdır. Bu enzim, CO2 ve sudan bikarbonat iyon üretir, bu da daha sonra potasyum karşılığında bir proton pompası aracılığıyla lümene boşaltılan bir hidroksil iyonunu serbest eder. Klorür ve potasyum iyonları iletkenlik kanalları ile lümene taşınır ve bu da mide suyunun ana bileşeni olan hidroklorik asit ve potasyum klorürün oluşumuna neden olan 1,2,3,4.
Asit oluşum mekanizmaları iyi anlaşılsa da asit salgısını düzenleyen fizyolojik mekanizmalar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Bu yöntemi geliştirmenin amacı, asit oluşumunu ve salgısını koordine eden hücresel yolların daha iyi belirlenmesine yardımcı olmak ve asidin bağırsak fizyolojisi ve homeostazda aracılık etmedeki rolünü belirlemektir. Bu tekniğin geliştirilmesinin ve kullanılmasının arkasındaki mantık, Drosophila ve model olmayan organizmalarda bağırsak asitleşme sürecini incelemek için tutarlı ve güvenilir bir yöntem sağlamaktır. Drosophila midgut asitleşmesini belirlemek için standart bir protokol şu anda 2,5,6 olmasına rağmen, bakır hücre fonksiyonunu incelemek için bu protokolü kullanırken vahşi tip (WT) sineklerde asitleşme boyutunda önemli değişkenlik gözlenmiştir. Gözlemlenen bu değişkenliğin temelini anlamak ve tutarlı sonuçlar elde etmek için, standart protokolün çeşitli yönleri aşağıda açıklandığı gibi optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Oregon R standart laboratuvar hattı WT kontrolü olarak kullanılmıştır. Tüm sinekler oda sıcaklığında 12/12 saat açık/koyu sirkadiyen ritimle standart mısır unu-pekmez ortamında (pekmez, agar, maya, mısır unu, tegosept, propiyonik asit ve su içeren) yetiştirildi.
1. Teste hazırlık
- Kadın sinekleri (0-2 günlük, bakire olmayan) CO2 anestezisi altında toplayın ve deneylerden önce en az 3 gün boyunca standart mısır unu yiyeceklerinde iyileşmelerini sağlar.
- Sinekleri oda sıcaklığında (~23 °C) ~24 saat boyunca~ 2 mL deiyonize su ile ıslatılmış bir laboratuvar silme dokusu içeren şişelerde aç bırakın.
- Sinek besinlerini bromofenol mavisi (BPB) ile aşağıdaki gibi hazırlayın:
- Sinek yiyeceklerini mikrodalga fırında eritin ve ılık olana kadar soğumaya bırakın.
- 1 mL ılık yiyeceğe 1 mL% 4 BPB ekleyin ve iyice karıştırın.
- Bir pipet kullanarak, BPB içeren sinek gıdasını bir Petri kabının ortasındaki tek bir noktaya (~200 μL) ekleyin.
2. Bağırsak asitleştirme izleme tahlil
- Aç sinekleri% 2 bromofenol mavisi (BPB) ile desteklenmiş tek nokta (200 μL) sinek maması içeren bir Petri kabına aktarın. Sineklerin ışığa maruz kalırken oda sıcaklığında 4 saat yem yapmasına izin verin.
- 4 saat sonra sinekleri toplayın ve buz üzerinde uyuşturun; bağırsaklarını cerrahi olarak izole edin.
- Ameliyatı stereomikroskop altındaps ile 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Toraksı bir çift tospla tutarak ve bağırsağın CCR'si görünene kadar ikinci bir çiftle karnı aşağı çekerek bağırsakları izole edin, bağırsağın her iki ucunda da bağlı kalmasını sağlamaya özen göstererek.
- Bağırsak CCR'nin rengini inceleyerek bağırsağın asitleşmesini belirleyin (Şekil 1C; sarı asitli, mavi ise asitleşmediğini gösterir).
- Sadece bağırsaklarında güçlü BPB lekesi gösteren sinekleri sayın.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak yüzdeyi hesaplayın:
Asitlenmiş bağırsaklı sineklerin yüzdesi = asitlenmiş sinek sayısı × 100 / (asitlenmiş sinek sayısı + asitlenmemiş sinek sayısı)
NOT: 0'ın bir yüzdesi hiçbir sineklerin bağırsaklarını asitlemediklerini gösterirken, 100'ün yüzdesi tüm sineklerin bağırsaklarını asitlediğini gösterir.
3. Montaj ve görüntü alımı
NOT: Bu adım, numuneler uzun süre korunamadığından, daha fazla analiz için ilgili koşullar için görüntüleri elde etmek ve işlemek için ektir. Bu görüntüler herhangi bir bağırsak asitliği nicelemesi için kullanılmamaktadır.
- Diseksiyondan sonra, PBS'deki örnekleri cam bir slayda monte edin.
- CellSens Entry yazılımını kullanarak görüntüleri mikroskop altında elde edin ( Bkz. Malzeme Tablosu).
- Hazırlanan slaydı mikroskobun altına yerleştirin ve göz merceği kullanarak numuneyi ayarlayın.
- Kameranın deklanşörini açmak için göz merceği kapatın.
- Bağlı bilgisayardaki yazılımı açın.
- Doğru objektif lensleri seçin, canlı düğmeye tıklayın ve açıklayıcı zaman ayarı ile standart ayarı seçin.
- CCR bölgesine odaklanın ve anlık görüntüyü alın.
- Anlık görüntü penceresini sağ tıklatın ve .tif dosyası olarak kaydedin.
- Fiji yazılımını kullanarak görüntüleri hizalayın ve işleyin.
- Fiji yazılımında .tif dosyasını içe aktarın ve ilgisiz arka planı temizleyin.
- CCR ve diğer bağırsak bölgelerini optimize etmek için yoğunluğu ve kontrastı ayarlayın.
- Ölçek çubuğunu ekleyin ve .tif dosyası olarak kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oregon R dişi sineklerini 20 saatten fazla aç bıraktık ve daha önce açıklandığı gibi ~ 12 saat boyunca BPB (% 2) ile desteklenmiş yiyecekleri besledik. Bromofenol mavisi (BPB) pH algılayan bir boyadır. pH 3.0'da sarıdan pH 4.6 ve üzeri maviye dönüşür. Bağırsak diseksiyonunun ardından, daha önce bildirildiği gibi, bazı sineklerin bağırsak CCR'sinde sarı renkle belirtildiği gibi asit ürettiği bulunmuştur (Şekil 1B). Şaşırtıcı bir şekilde, yayınlanan sonuçların aksine, bazı sineklerin bağırsakları maviydi, bu da bağırsaklarını asitleştirmede başarısız olduklarını gösteriyordu. Bu tutarsız sonuçlar, tutarlı ve yorumlanabilir sonuçlar için en iyi duruma getirmek için protokolün değiştirilmesi gerektiğini gösterdi.
BPB protokolünü optimize etmek için iki yeni değişiklik dahil edildi. İlk olarak, beslenmenin başlangıcını daha iyi kontrol etmek için, sinekler aç bırakıldı ve daha sonra bir tabağın ortasında BPB ile yiyecek noktalarına yerleştirildi (Şekil 1A). İkincisi, beslenmenin başlangıcına daha yakın noktalarda bağırsak asitlenmesi için test etmeye başladık. Dişi sinekler >20 saat aç bırakıldı, küçük bir Petri plakalı arenada BPB ile sinek yemi sağlandı ( bkz. Şekil 1A) ve bağırsakları 1 saat aralıklarla parçalarken 4 saate kadar çeşitli zaman noktaları için beslenmesine izin verildi. Asitleşmiş bağırsak sayısı (sarı renk) ve asitlenmemiş bağırsak (mavi renk) belirlendi ve her zaman noktası için bağırsak asitlenmesi gösteren sineklerin yüzdesi hesaplandı (Şekil 1B). 30 dakika içinde sineklerin ~%20'si bağırsaklarını asitleştirmişti. Bir saat sonra, bağırsakların ~ % 40'ı asitleşme kanıtı gösterirken, 2 saat ve 3 saat beslenmeden sonra, asitlenmiş bağırsakların yüzdesi sırasıyla ~ % 60 ve ~ % 70'e yükseldi (Şekil 1B). Bu, zamanla bağırsak asitleşmesini gösteren sineklerin yüzdesinde bir artış olduğunu gösterir. Sinekler 4 saat boyunca beslendiğinde bağırsakların neredeyse% 90-95'i asitlendi (Şekil 1B). Sonraki deneyler için 4 h besleme bu optimize edilmiş protokolü kullandık.
Beslenmenin etkisine ek olarak, sineklerin yükseltilen sıcaklığın bağırsak asitleşmesi üzerindeki etkisi incelendi. Sinekler 23 °C ve 30 °C'de yetiştirildi ve dişi sinekler ~ 20 saat boyunca aç bırakıldı. Sinekler daha sonra 4 saat boyunca BPB ile takviye edilen sinek gıdaları ile beslendi ve bağırsak asitleşmesinin yüzdesi yukarıda açıklandığı gibi belirlendi. Bu iki sıcaklık için bağırsak asitlenmesinde bir fark gözlemlemedik (Şekil 1C), sıcaklığın beslenmenin aksine bağırsak asitleşmesini etkilemediğini düşündürdü.
Model olmayan organizmalar için bağırsak asitleştirme protokolü gösterimi
Drosophilae türleri milyonlarca yıl boyunca filogenetik olarak ayrılır (bkz. Şekil 2A). Bu geniş dönemde, farklı habitatlara ve diyetlere adapte oldular12, bazı türlerin bağırsaklarını D. melanogaster ile aynı şekilde asitlendirmeme olasılığını artırdılar. D. melanogaster (meyve), D. sechecllia (morinda meyvesi), D. erecta (pandanus meyvesi), D. pseudoosubcura & D. virilis (bitki özsuyu) ve D. mojavensis (kaktüs meyveleri) kullandık (Şekil 2B). Bu protokolün diğer Drosophila türleri için kullanılabileceğini göstermek için, bu türler 4 saat boyunca BPB ile desteklenmiş sinek yiyecekleri ile beslendi ve bağırsak asitleşmesinin yüzdesi yukarıda açıklandığı gibi belirlendi. Test edilen tüm türler için sağlam bağırsak asitlenmesi gözlenmiştir (Şekil 2B). Bu sonuç, bağırsak asitlenmesinin evrimsel olarak çeşitli Drosophila türleri arasında korunduğunun ve bu protokolün diğer organizmalar için kolayca uygulanabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Bağırsak asitleştirme izleme. (A) Beslenme arenasının şematik çizimi. Mavi nokta, bromofenol mavisi (pH gösteren bir boya) ile sinek yiyeceklerini temsil eder. Diğer noktalar meyve sineklerini temsil eder. (B) 4 saatin üzerinde farklı sürelerde beslenen bağırsak asitleşmesini gösteren sineklerin yüzdesinin grafiksel gösterimi. Asitlenmiş bir bağırsak ve asitlenmemiş bir bağırsak temsili bağırsak görüntüleri. Kırmızı ok, midgut'un bakır hücre bölgesinde asidik salınımı gösterir. n = 4 deney, deney başına 25-30 dişi sinek. Ölçek çubuğu = her biri 500 μm. Yıldız işaretleri kontrol grubundan önemli farklılıklar olduğunu gösterir (tek yönlü ANOVA, ardından Bonferroni testi) *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.0001. (C) Sinekler BPB ile 23 °C veya 30 °C'de 4 saat boyunca sinek yemi ile beslendi. Bağırsak asitleşmesini gösteren sineklerin yüzdesi (%). n = 4 deney, deney başına 25-30 dişi sinek (eşleşmemiş t testi ve ardından parametrik olmayan Mann-Whitney U testi ve Wilcoxon sıralama toplamı testi. Kısaltma: ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bağırsak asitleşme olgusunun filogeneni. (A) Drosophila türlerinin beslenme alışkanlıkları ve habitatları ile birlikte filogenetik ilişkisi. 1 mm çubuk 1 milyon yılı gösterir. (B) Bağırsak asitleşmesini gösteren sineklerin (Drosophila türleri) yüzdesi, BPB ile 4 saat boyunca sinek yemi ile beslendi. Kısaltma: ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde kritik bir adım, asitleşme fenotipi için CCR'yi görselleştirmek için bağırsakların uygun şekilde diseksiyonudur. Bakır hücrelerden salınan asit, bağırsak sağlam olduğunda CCR ile sınırlıdır. Bununla birlikte, diseksiyon sırasında, bağırsağın yırtılmasından kaynaklanan sızıntı, CCR'den asitin yayılmasına neden olabilir ve yanlışlıkla asitleşme için negatif olarak puanlanan bir bağırsakla sonuçlanabilir. Ek olarak, asitleşmenin sarı rengi diseksiyondan sonra 5-10 dakika içinde kaybolur ve izolasyondan kısa bir süre sonra asitleşme fenotipi için bağırsakların puanlanması öneminin altını çizer. Son olarak, sinek bağırsağındaki asitleşme durumunu test eden mevcut protokoller7,8,9,10,11, hayvanların beslenme durumu dikkate alınmadan, sinek mamalarının BPB ile takviyesine dayanır. Bununla birlikte, çalışmalarımız sırasında, bağırsak asitlenmesinin konstrüktif olmadığını, daha önce açlıktan sonra beslenmeye bağlı olduğunu gördük. Bu nedenle, bağırsak pH'ının bir göstergesi olarak BPB kullanılarak bağırsak asit durumunun doğru bir şekilde değerlendirilmesi, dikkate alınması gereken diğer değişkenlerle birlikte sineğin beslenme durumunun da dikkate alınmasını gerektirir.
Bağırsak asitleşmesi alt çok hücreli organizmalardan daha yüksek organizmalara korunur. Bununla birlikte, çoğu hayvandaki işlevi ve onu düzenleyen moleküler ve hücresel yolların tam kapsamı hakkında çok az şey bilinmektedir. İnsanlarda, bağırsak asitlenmesi eksikliği besinlerin malabsorpsiyonu ile ilişkilidir, bağırsaktaki fazla asit ise bağırsak ülserlerine neden olabilir13. Bu nedenle, bağırsak asitlenmesi ile ilgili araştırmalardan elde edilen içgörülerin, asit salgısının düzenlenmesindeki kusurların neden olduğu bağırsak hastalıklarının tedavisi ve tedavisi hakkında yeni içgörüler sağlaması muhtemeldir.
Drosophila son zamanlarda bağırsak asitlenmesi çalışması için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır2,5,6. Genetik çalışmalar, asit salgılayan hücrelerin ve asit üretiminde yer alan makinelerin kurulması için gerekli genleri tanımlamıştır. Uyuşturucu çalışmaları da yapılmıştır. Örneğin, sinekler karbonik bir anhidraz (CAH) inhibitörü7 olan asetazolamid ile beslendiğinde, CAH'ın asit üretimi için gerekli protonların üretiminde oynadığı merkezi rol ile tutarlı olarak bağırsak asitleşmesi önlenir. Bu protokolün araştırmacılara ilaç inhibitörlerini veya bağırsak asitliğinin aktivatörlerini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde keşfetmelerine yardımcı olmasını bekliyoruz. Ek olarak, bu yöntemin genetik ve biyokimyasal yaklaşımlarla birlikte uygulanması, asit salgısında yer alan hücresel yolların ortaya çıkarılmasına yardımcı olacak ve bağırsak asitleşmesinin bağırsak ve organizma homeostazındaki rolünü tam olarak belirleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, yazarın laboratuvarındaki çalışmalara verilen desteğin, UT Southwestern Tıp Merkezi'ndeki Çocuk Araştırma Enstitüsü'nden HHMI Fakülte Akademik Ödülü ve başlangıç fonları tarafından sağlandığını kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
