Summary
Drosophila melanogaster vuxna flugor har använts i stor utsträckning som modellorganismer för att undersöka de molekylära mekanismer som ligger till grund för värd antimikrobiella medfödda immunsvar och mikrobiella infektionsstrategier. För att främja D. melanogaster larva stadium som ett extra eller alternativt modellsystem beskrivs en larval injektion teknik.
Abstract
Användningen av okonventionella modeller för att studera medfödd immunitet och patogen virulens ger ett värdefullt alternativ till däggdjursmodeller, vilket kan vara kostsamt och väcka etiska frågor. Okonventionella modeller är notoriskt billiga, lätta att hantera och kultur, och tar inte mycket utrymme. De är genetiskt mottagliga och har fullständiga genomsekvenser, och deras användning presenterar inga etiska överväganden. Fruktflugan Drosophila melanogaster, till exempel, har gett stora insikter om en mängd olika beteenden, utveckling, metabolism och immunitetsforskning. Mer specifikt har D. melanogaster vuxna flugor och larver flera medfödda försvarsreaktioner som delas med ryggradsdjur. Mekanismerna som reglerar immunsvar har mestadels avslöjats genom genetiska och molekylära studier i D. melanogaster-modellen . Här tillhandahålls en ny larval injektion teknik, som ytterligare kommer att främja undersökningar av medfödda immunprocesser i D. melanogaster larver och utforska patogenesen vid ett brett spektrum av mikrobiella infektioner.
Introduction
Drosophila melanogaster har använts enormt inom biologisk och biomedicinsk forskning i flera årtionden, eftersom det sofistikerade utbudet av genetiska och molekylära verktyg stadigt har utvecklats för analys av ett brett spektrum av studier1,2,3,4. De evolutionärt bevarade aspekterna av utveckling, homeostas och medfödd immunitet i D. melanogaster har gjort det till en värdefull modellorganism för att studera olika mänskliga och insektssjukdomar5,6. I synnerhet har den grundläggande rollen för D. melanogaster-modellen för att studera immunitet till stor del exemplifierats i studier av vuxna flugor. D. melanogaster larver studier har dock också bidragit till den nuvarande kunskapen och främst utforskat cellulära immunsvar, särskilt för veps- och nematoder infektioner som uppstår genom insekts nagelband7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver har tre olika typer av blodkroppar, gemensamt kallade hemocyter: plasmatocyter, kristallceller och lamellocyter11,12,13. Dessa celler kan montera en rad immunsvar när D. melanogaster larver är infekterade med patogener som bakterier, svampar, virus och parasiter14,15,16. Cellulära immunsvar inkluderar direkt uppslukande (fagocytos) av små molekyler eller bakterier, melanisering, inkapsling av större patogener som parasitoidägg och produktion av reaktiva syrearter (ROS) och kväveoxidsynthaser (NOS)17,18,19.
Däremot har färre studier publicerats om användningen av D. melanogaster larval modell för att analysera humorala immunsvar. Detta beror främst på tillämpningen av utfodringsanalyser för oral infektion av D. melanogaster larver och flera utmaningar i samband med mikroinjektion larver inklusive exakt hantering av larver och korrekt användning av mikroneedle, särskilt under penetration20,21. Således har den begränsade kunskapen om larvinfektion och tekniska svårigheter (dvs. hög dödlighet) ofta gjort D. melanogaster larvmodellen svår att använda. En larvmodell kommer att ha potential att identifiera nya molekylära mekanismer som kommer att ge ytterligare insikter om värdpatogeninteraktioner och induktion av specifika värdfödda immunsvar mot patogena infektioner.
Här beskrivs ett enkelt och effektivt protokoll som kan användas för att injicera D. melanogaster larver med olika patogener, såsom bakterier, i detalj. I synnerhet används D. melanogaster larver för injektioner med den mänskliga patogenen Photorhabdus asymbiotica och de icke-patogena bakterierna Escherichia coli. Denna metod kan användas för manipulering och analys av D. melanogasters immunsvar på olika mikrobiella infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flyguppfostran
OBS: D. melanogaster livscykeln är uppdelad i fyra steg: embryo, larva, pupa och vuxen. Produktionstiden med optimala uppfödningsförhållanden i laboratoriet (~ 25 °C, 60% luftfuktighet och tillräcklig mat) är cirka 10 dagar från befruktat ägg till eclosed vuxen. Honor lägger ~100 embryon per dag, och embryogenes varar ca 24 h22. Larverna genomgår tre utvecklingsstadier (instars; L1-L3) på ~4 dagar (L1 och L2: 24 h och L3: 48 h). De första instar larverna börjar mata omedelbart på mediets yta. Andra instar larver gräva in i mediet, medan tredje instar larver lämnar mediet och vandrar upp injektionsflaskans väggar, letar efter en plats att pupariate för 24-48 h. D. melanogasterlinjen som används för detta protokoll är Oregon R (FBsn0000276).
- Tillsätt torrfoder som innehåller en majsmjöls-sojabaserad diet till en smal polystyrenflaska (25 mm x 95 mm) till en mängd 1/5 till 2/5 volym. Tillsätt sedan 9 ml vatten och låt injektionsflaskan sitta i 1 min tills kosten är helt hydratiserad.
- Tillsätt cirka 10 granuler torr bagerijäst till injektionsflaskan och placera en blandning av minst 20 nyuppkomna manliga och kvinnliga vuxna flugor.
- Inkubera injektionsflaskan vid 25 °C på ett 12:12-h ljus: mörk fotoperiodisk cykel.
- För att säkerställa livscykelprogression, kontrollera flygbladen dagligen och registrera de första utvecklingsstadierna.
2. Val av larver för infektion
- Välj larver med en fin pensel (kamelens hår är bäst) när de når det vandrande tredje instar-stadiet den dag infektionen kommer att utföras (figur 1).
- Tvätta de utvalda larverna med Ringers lösning (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) i en liten Petri-skål (60 mm x 15 mm) vid borttagning från sin ursprungliga injektionsflaska23.
- Placera larverna på filterpapper (150 mm diameter) som är något fuktade med ca 5 ml Ringers lösning i en Petriskål (100 mm x 15 mm) (figur 2A).
- Tillsätt ~1 ml ringers lösning dagligen till filterpapperet efter behov för att undvika torrhet och larv uttorkning.
3. Bakteriell beredning
- Kultur P. asymbiotica bakterier på Luria Bertani (LB) agar media vid 28 °C för 48 h.
- Använd ett biosäkerhetsskåp på nivå 2 för att överföra en enda koloni av P. asymbiotica för att inokulera en flytande kultur i 10 ml LB-media.
- Inkubera P. asymbiotica flytande odling över natten vid 28 °C i en roterande skakapparat inställd på 220 rpm.
- Kultur E. coli bakterier på ett liknande sätt, men utför den första tillväxten på agar media och flytande kultur inkubation vid 37 °C över natten.
- Centrifugera varje bakteriekultur över natten i 3 min vid 13 000 x g och 4 °C.
- Kassera supernatanten och tvätta de resulterande bakteriella pellets tre gånger med 10 ml steril PBS.
- Centrifugera pelletsen igen i 3 min vid 13 000 x g och 4 °C.
- Späd varje pellet med steril PBS för att justera bakteriekoncentrationerna till den optiska densiteten (600 nm) på 0,25 för P. asymbiotica och 0,015 för E. coli, vilket motsvarar 100-300 kolonibildande enheter per larva i varje bakteriepreparat, med hjälp av en spektrofotometer.
4. Injektorpreparat
- Förbered kapillärer med 3,5" kapillärrör av glas och en mikropipettedragare. Ställ in instrumentet på följande sätt: värme: 580; drag: 143; hastighet: 25; försening: 1; tryck: 500.
- Använd raka sågtandade medelpunktstänger för att öppna glaskapillären i den utsträckning som gör det möjligt att leverera de experimentella behandlingarna samtidigt som larverna skadas minimalt (figur 2B). För att optimera denna procedur medan du övar injektioner, använd Trypan Blue-lösningen (späd beståndet 0,4% med PBS till 0,2%) för att enkelt spåra läckage under injektion och överlevnaden av de blå larverna.
- Fyll kapillären med mineralolja med en plastspruta på 20 ml med en hypodermisk nål (22 G, 25 mm längd).
- Sätt upp nanolitinjektorn och mata ut oljan ur kapillären (figur 2C).
- Fyll kapillären med önskat bakteriellt preparat för injektion. Ta lösningen från en droppe (~20 μL) som placeras på parafilm. I detta protokoll injicerades 50,2 nL av två bakteriebestånd.
5. Larver injektion
- Bedöva D. melanogaster larver med koldioxid i ~ 2 min före proceduren.
- Överför försiktigt de sövda larverna till ett filterpapper fuktat i Ringers lösning som förberedelse för injektion under ett stereomikroskop. Larverna kommer att vara slöa eller passiva vid denna tidpunkt.
- För att injicera larver, applicera fast tryck på den bakre sidan av den bakre änden (trakealspiraklesna är uppenbara i den bakre änden jämfört med svarta munstycken i den främre änden) med tång (figur 2D).
- Sätt in nålen horisontellt mot larvernas bakre ände, nära nagelbandet. En lyckad injektion resulterar inte i läckage av den injicerade lösningen från larverna (figur 3).
- Ta bort tångarna som användes för att applicera tryck på larvernas svans innan du drar tillbaka nålen. Om inte avlägsnas först kan tången tvinga hemolymph och/ eller tarmarna ut ur larverna från sårplatsen.
- Infektera lämpligt antal larver för den studie som utförs. I detta särskilda protokoll injicerades 20 larver för varje experimentellt tillstånd.
- Använd tång, överför försiktigt de injicerade larverna till ett separat fuktigt filterpapper i en Petri-maträtt (10 larver per maträtt) eller en matflaska (beroende på syftet med experimentet) för att möjliggöra återhämtning.
- Placera Petri-rätterna eller matflaskan i en inkubator vid 25 °C. Om larver hålls i en Petri-maträtt, tillsätt Ringers lösning vid behov för att förhindra uttorkning.
6. Registrering av överlevnad/dödlighet
- Registrera antalet döda och levande D. melanogaster larver enligt de inställda experimentella tidspunkterna. Levande larver kommer att fortsätta att utvecklas till puppar och vuxna.
- Använd statistiska program, till exempel Prism, för att ange råa överlevnads-/dödlighetsdata, analysera dem med log-rank -testet (Mantel-Cox) och representera resultaten i siffror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När det utförs korrekt visar injektioner av D. melanogaster larver en bakteriespecifik effekt. Överlevnadsdata samlades in vid flera tidpunkter efter infektioner av P. asymbiotica (stam ATCC43943), E. coli (stam K12) och PBS (figur 4). Medan D. melanogaster larver är mottagliga för P. asymbiotica, som äventyrar överlevnad snabbt, larver injiceras med E. coli eller PBS kontroller uppvisar långvariga överlevnadar24,25,26. Särskilt i jämförelse med larver infekterade med P. asymbiotica, som uppvisar en 57% överlevnadsgrad 24 h efter injektion, visar larver injicerade med E. coli en överlevnadsgrad på 85% samtidigt.
Figur 1: Val av Drosophila melanogaster larver för injektion. Livscykeln för Drosophila melanogaster, från äggbefruktning till vuxenlivet, tar cirka 10 dagar. Under larvtillväxt matar larver tills de är redo att poppa och byta till vuxna. För injektionsexperiment väljs tredje instar larver, som lämnar odlingsmediet och vandrar upp på injektionsväggarna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Avbildning av Drosophila melanogaster larval injektion förfarande. (A) Vandrande tredje instar larver väljs, tvättas med Ringers lösning och placeras på filterpapper i en Petri-skål som förberedelse för injektion. (B) Med hjälp av tång bryts kapillären av glas för att möjliggöra leverans av de experimentella behandlingarna. (C) Den programmerbara nanoliterinjektorn är inställd som förberedelse för injektion under ett stereomikroscope. (D) För att injicera larver appliceras tryck på den dorsala sidan av larvernas svans med tång. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Illustration av att leverera bakterieceller till Drosophila melanogaster larver genom mikroinjektion. Den dorsala sidan av den bakre änden stabiliseras med tång. Därefter sätts kapillären horisontellt mot larvernas bakre ände, nära nagelbandet. Efter injektionen avlägsnas tången innan kapillären försiktigt dras tillbaka för att förhindra hemolemfenläckage från sårstället. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Överlevnad av Drosophila melanogaster larver efter injektion av patogena och icke-patogena bakterier. Oregon R larver av D. melanogaster injicerades med 50,2 nL Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12) eller PBS. Medan PBS och E. coli kontroller visade ingen betydelse i överlevnadskvoter, P. asymbiotica injektioner äventyras flyga överlevnad snabbt. Varje överlevnadskurva består av mätningar från tre oberoende försök, var och en med 20 larver (*** p < 0,001). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster är bland de mest värdefulla, experimentellt manipulerade modellerna som används för undersökningar av medfödd immunitet och patogenes av olika mikrobiella infektioner. Detta beror på dess enkla och snabba livscykel, enkla underhåll i ett laboratorium, väletablerad evolutionär genetik och olika genetiska verktygslåda. Tidigare metoder för D. melanogaster larver injektioner, såsom att använda en hybrid mikrofluidic enhet eller en Narishige micromanipulator, kräver högspecialiserad utrustning och kan vara kostsam21,27. I det nuvarande protokollet, för att utöka användningen av D. melanogaster, beskrivs en enkel injektionsteknik som representerar en effektiv och snabb metod för att leverera bakterier till hemocoel av D. melanogaster larver. Den väsentliga delen av tekniken som beskrivs här är den faktiska injektionen av önskad patogen eller andra flytande ämnen med hjälp av en mikroinjektor. Förutom att beskriva denna viktiga operation beskriver vi även tillbehörsmetoder som odling och odling av bakterier och hanteringsmaterial.
Den främsta fördelen med denna metod är att nålen hålls ungefär parallellt med larven, och innehavet görs med mycket lite tryck på larven, vilket minskar risken för hemolymph-läckage, dödlig skada eller otillräcklig leverans av önskat ämne. Nålen sätts sedan in mot larvens bakre ände för att slutföra injektionen. Det exakta sättet att hålla larven, sättet att sätta in nålen, hastigheten med vilken det önskade ämnet injiceras och nålens uttagsriktning är alla frågor som bäst kan förbättras genom praxis. Det mest utmanande steget att övervinna är att dra ut nålen ur larven utan något resulterande läckage av väsentliga organ. Men med exakthet och erfarenhet blir svårigheten som uppstår under detta steg mindre.
Denna teknik är också ett utmärkt verktyg i flera applikationer för att införa en mängd olika ämnen på ett enhetligt sätt som kan upprepas flera gånger, vilket möjliggör konsekventa resultat. Den snabba dödlighet som observerats hos P. asymbiotica-infekterade larver återspeglar den höga virulensen hos denna bakteriestam till insekter24,25,26. P. asymbiotica är väl dokumenterad för att uttrycka virulens gener under infektion som ökar bakteriell överlevnad och patogenicitet mot insekt värdar genom att hämma hemocyt migration och fagocytos24,25. Även larverna förväntas vara resistenta mot injektioner med de icke-patogena bakteriestammarna av E. coli samt injektioner med PBS, vilket bekräftar tidigare resultat inom detta forskningsområde26. Därför uppnås mikroinjektion utan någon negativ effekt på djurens livskraft, vilket gör det möjligt att använda den i molekylära och immunologiska studier för att utforska patogenesen vid ett brett spektrum av mikrobiella infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av institutionen för biologiska vetenskaper vid George Washington University (GWU) för kritisk läsning av manuskriptet. GT fick stöd genom ett Harlan sommarstipendium från GWU. Alla grafiska figurer gjordes med BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
