Summary
Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.
Abstract
L’utilisation de modèles non conventionnels pour étudier l’immunité innée et la virulence des agents pathogènes constitue une alternative précieuse aux modèles de mammifères, ce qui peut être coûteux et soulever des questions éthiques. Les modèles non conventionnels sont notoirement bon marché, faciles à manipuler et à cultiver, et ne prennent pas beaucoup de place. Ils sont génétiquement disponibles et possèdent des séquences complètes du génome, et leur utilisation ne présente aucune considération éthique. La mouche des fruits Drosophila melanogaster, par exemple, a fourni d’excellentes informations sur une variété de recherches sur le comportement, le développement, le métabolisme et l’immunité. Plus précisément, les mouches adultes et les larves de D. melanogaster possèdent plusieurs réactions de défense innées qui sont partagées avec les animaux vertébrés. Les mécanismes régulant les réponses immunitaires ont été principalement révélés par des études génétiques et moléculaires dans le modèle de D. melanogaster . Ici, une nouvelle technique d’injection larvaire est fournie, qui favorisera davantage les recherches sur les processus immunitaires innés chez les larves de D. melanogaster et explorera la pathogenèse d’un large éventail d’infections microbiennes.
Introduction
Drosophila melanogaster a été immensément utilisé dans la recherche biologique et biomédicale pendant plusieurs décennies, car la gamme sophistiquée d’outils génétiques et moléculaires a progressivement évolué pour l’analyse d’un large éventail d’études1,2,3,4. Les aspects du développement, de l’homéostasie et de l’immunité innée conservés sur le plan évolutif chez D. melanogaster en ont fait un organisme modèle précieux pour l’étude de diverses maladies humaines et d’insectes5,6. Notamment, le rôle fondamental du modèle de D. melanogaster pour l’étude de l’immunité a été largement illustré dans les études sur les mouches adultes. Cependant, les études sur les larves de D. melanogaster ont également contribué aux connaissances actuelles et ont principalement exploré les réponses immunitaires cellulaires, en particulier pour les infections à guêpes et aux nématodes qui se produisent par la cuticule de l’insecte7,8,9,10. Les larves de Drosophila melanogaster possèdent trois types différents de cellules sanguines, collectivement appelées hémocytes : plasmatocytes, cellules cristallines et lamellocytes11,12,13. Ces cellules peuvent monter un éventail de réponses immunitaires lorsque les larves de D. melanogaster sont infectées par des agents pathogènes tels que des bactéries, des champignons, des virus et des parasites14,15,16. Les réponses immunitaires cellulaires comprennent l’engloutissement direct (phagocytose) de petites molécules ou bactéries, la mélanisation, l’encapsulation d’agents pathogènes plus gros tels que les œufs parasitoïdes et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de synthases d’oxyde nitrique (NOS)17,18,19.
En revanche, moins d’études ont été publiées sur l’utilisation du modèle larvaire de D. melanogaster pour analyser les réponses immunitaires humorales. Cela est principalement dû à l’application de tests d’alimentation pour l’infection orale des larves de D. melanogaster et à plusieurs défis associés à la microinjection des larves, y compris la manipulation précise des larves et l’utilisation appropriée de la micro-aiguille, en particulier pendant la pénétration20,21. Ainsi, la connaissance limitée de l’infection larvaire et les difficultés techniques (c.-à-d. mortalité élevée) ont souvent rendu le modèle larvaire de D. melanogaster difficile à utiliser. Un modèle larvaire aura le potentiel d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires qui fourniront des informations supplémentaires sur les interactions hôte-pathogène et l’induction de réponses immunitaires innées spécifiques de l’hôte contre les infections pathogènes.
Ici, un protocole simple et efficace qui peut être utilisé pour injecter aux larves de D. mélanogasster divers agents pathogènes, tels que des bactéries, est décrit en détail. En particulier, les larves de D. melanogaster sont utilisées pour les injections avec l’agent pathogène humain Photorhabdus asymbiotica et la bactérie non pathogène Escherichia coli. Cette méthode peut être utilisée pour la manipulation et l’analyse des réponses immunitaires de D. melanogaster à diverses infections microbiennes.
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Protocol
1. Élevage à la mouche
REMARQUE: Le cycle de vie de D. melanogaster est divisé en quatre étapes: embryon, larve, nymphe et adulte. Le temps de génération avec des conditions d’élevage optimales en laboratoire (~ 25 ° C, 60% d’humidité et suffisamment de nourriture) est d’environ 10 jours entre l’œuf fécondé et l’adulte éclos. Les femelles pondent environ 100 embryons par jour et l’embryogenèse dure environ 24 h22. Les larves subissent trois stades de développement (instars; L1-L3) en ~4 jours (L1 et L2: 24 h, et L3: 48 h). Les larves du premier stade commencent à se nourrir immédiatement à la surface du milieu. Les larves du deuxième stade s’enfouissent dans le milieu, tandis que les larves du troisième stade quittent le milieu et errent le long des parois du flacon, à la recherche d’un endroit pour périmer pendant 24 à 48 h. La lignée D. melanogaster utilisée pour ce protocole est Oregon R (FBsn0000276).
- Ajouter les aliments secs contenant un régime à base de semoule de maïs et de soja à un flacon étroit de polystyrène (25 mm x 95 mm) à un volume d’aboue de 1/5 à 2/5. Ajoutez ensuite 9 mL d’eau et laissez reposer le flacon pendant 1 min jusqu’à ce que le régime alimentaire soit complètement hydraté.
- Ajouter environ 10 granules de levure de boulangerie sèche au flacon et placer un mélange d’au moins 20 mouches adultes mâles et femelles nouvellement émergées.
- Incuber le flacon à 25 °C sur un cycle photopériodique clair de 12:12 h : sombre.
- Pour assurer la progression du cycle de vie, vérifiez quotidiennement les flacons de mouche et enregistrez les étapes initiales de développement.
2. Sélection des larves pour l’infection
- Sélectionnez les larves avec un pinceau fin (les poils de chameau sont les meilleurs) une fois qu’elles atteignent le stade errance du troisième stade le jour où l’infection sera effectuée (Figure 1).
- Laver les larves sélectionnées avec la solution de Ringer (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) dans une petite boîte de Petri (60 mm x 15 mm) après avoir été retirées de leur flacon d’origine23.
- Placer les larves sur du papier filtre (150 mm de diamètre) légèrement humidifié avec environ 5 mL de solution de Ringer dans une boîte de Pétri (100 mm x 15 mm) (Figure 2A).
- Ajouter environ 1 mL de solution de Ringer par jour au papier filtre au besoin pour éviter la sécheresse et la dessiccation larvaire.
3. Préparation bactérienne
- Culture de la bactérie P. asymbiotica sur un milieu de gélose Luria Bertani (LB) à 28 °C pendant 48 h.
- Utiliser une armoire de niveau de biosécurité 2 pour transférer une seule colonie de P. asymbiotica afin d’inoculer une culture liquide dans 10 mL de milieu LB.
- Incuber la culture liquide de P. asymbiotica pendant la nuit à 28 °C dans un agitateur rotatif réglé à 220 tr/min.
- Cultiver les bactéries E. coli de la même manière, mais effectuer la croissance initiale sur un milieu de gélose et une incubation de culture liquide à 37 ° C pendant la nuit.
- Centrifuger chaque culture bactérienne pendant 3 min à 13 000 x g et 4 °C.
- Jetez le surnageant et lavez les granulés bactériens résultants trois fois avec 10 mL de PBS stérile.
- Centrifuger à nouveau les pastilles pendant 3 min à 13 000 x g et 4 °C.
- Diluer chaque pastille avec du PBS stérile pour ajuster les concentrations bactériennes à la densité optique (600 nm) de 0,25 pour P. asymbiotica et de 0,015 pour E. coli, qui correspondent à 100-300 unités formant des colonies par larve de chaque préparation bactérienne, à l’aide d’un spectrophotomètre.
4. Préparation de l’injecteur
- Préparez les capillaires à l’aide de tubes capillaires en verre de 3,5 pouces et d’un extracteur de micropipette. Réglez l’instrument comme suit: chaleur: 580; tirer: 143; vitesse: 25; délai: 1; pression: 500.
- Utilisez des pinces à point moyen dentelées droites pour ouvrir le capillaire en verre dans la mesure qui permettra l’administration des traitements expérimentaux tout en causant un minimum de dommages aux larves (figure 2B). Pour optimiser cette procédure lors de la pratique des injections, utilisez la solution trypan blue (diluer le stock de 0,4% avec du PBS à 0,2%) pour suivre facilement les fuites lors de l’injection et la survie des larves bleues.
- Remplissez le capillaire avec de l’huile minérale à l’aide d’une seringue jetable en plastique de 20 mL avec une aiguille hypodermique (22 G, 25 mm de longueur).
- Installez l’injecteur de nanolitres et éjectez l’huile du capillaire (Figure 2C).
- Remplissez le capillaire avec la préparation bactérienne souhaitée pour injection. Prenez la solution d’une goutte (~20 μL) qui est placée sur un parafilm. Dans ce protocole, 50,2 nL de deux souches bactériennes ont été injectées.
5. Injection de larves
- Anesthésier les larves de D. melanogaster en utilisant du dioxyde de carbone pendant environ 2 minutes avant la procédure.
- Transférer doucement les larves anesthésiées dans un papier filtre humidifié dans la solution de Ringer en vue de l’injection sous stéréomicroscope. Les larves seront léthargiques ou passives à ce stade.
- Pour injecter les larves, appliquez une pression ferme sur la face dorsale de l’extrémité postérieure (les spiracles trachéaux sont apparents à l’extrémité postérieure par rapport aux pièces buccales noires à l’extrémité antérieure) à l’aide d’une pince (figure 2D).
- Insérez l’aiguille horizontalement vers l’extrémité postérieure des larves, près de la cuticule. Une injection réussie n’entraînera pas une fuite de la solution injectée des larves (Figure 3).
- Retirez les pinces qui ont été utilisées pour exercer une pression sur la queue des larves avant de retirer l’aiguille. Si elle n’est pas retirée en premier, la pince peut forcer l’hémolymphe et / ou l’intestin hors des larves du site de la plaie.
- Infecter le nombre approprié de larves pour l’étude en cours. Dans ce protocole particulier, 20 larves pour chaque condition expérimentale ont été injectées.
- À l’aide de pinces, transférer doucement les larves injectées dans un papier filtre humide séparé dans une boîte de Pétri (10 larves par plat) ou un flacon de nourriture (selon le but de l’expérience) pour permettre la récupération.
- Placer les boîtes de Petri ou les flacons de nourriture dans un incubateur à 25 °C. Si les larves sont conservées dans une boîte de Pétri, ajoutez la solution de Ringer si nécessaire pour éviter la dessiccation.
6. Enregistrement de la survie/mortalité
- Enregistrez le nombre de larves mortes et vivantes de D. melanogaster en fonction des points temporels expérimentaux définis. Les larves vivantes continueront de se développer en pupes et en adultes.
- Utilisez des programmes statistiques, tels que Prism, pour entrer les données brutes de survie / mortalité, les analyser avec le test log-rank (Mantel-Cox) et représenter les résultats en chiffres.
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Representative Results
Lorsqu’elles sont effectuées correctement, les injections de larves de D. melanogaster montrent un effet spécifique à la bactérie. Les données de survie ont été recueillies à plusieurs moments à la suite d’infections à P. asymbiotica (souche ATCC43943), à E. coli (souche K12) et à PBS (figure 4). Alors que les larves de D. melanogaster sont sensibles à P. asymbiotica, ce qui compromet rapidement la survie, les larves injectées avec E. coli ou des témoins PBS présentent des survies prolongées24,25,26. En particulier, par rapport aux larves infectées par P. asymbiotica, qui présentent un taux de survie de 57% 24 heures après l’injection, les larves injectées avec E. coli montrent un taux de survie de 85% au même moment.
Figure 1 : Sélection des larves de Drosophila melanogaster pour injection. Le cycle de vie de Drosophila melanogaster, de la fécondation des ovules à la vie adulte, prend environ 10 jours. Pendant la croissance larvaire, les larves se nourrissent jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à se nymphoser et à devenir adultes. Aux fins des expériences d’injection, les larves du troisième stade, qui quittent le milieu de culture et se promènent le long des parois du flacon, sont sélectionnées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Représentation de la procédure d’injection larvaire de Drosophila melanogaster. (A) Les larves errantes du troisième stade sont sélectionnées, lavées avec la solution de Ringer et placées sur du papier filtre dans une boîte de Pétri en vue de l’injection. (B) À l’aide de pinces, le capillaire en verre est cassé pour permettre la livraison des traitements expérimentaux. (C) L’injecteur programmable à nanolitres est mis en place en vue de l’injection sous stéréomicroscope. (D) Pour injecter les larves, une pression est appliquée sur la face dorsale de la queue des larves à l’aide d’une pince. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Illustration de l’administration de cellules bactériennes dans les larves de Drosophila melanogaster par microinjection. La face dorsale de l’extrémité postérieure est stabilisée à l’aide d’une pince. Ensuite, le capillaire est inséré horizontalement vers l’extrémité postérieure des larves, près de la cuticule. Après l’injection, les pinces sont retirées avant de retirer soigneusement le capillaire pour éviter les fuites d’hémolymphe du site de la plaie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Survie des larves de Drosophila melanogaster après injection de bactéries pathogènes et non pathogènes. Les larves R de l’Oregon de D. melanogaster ont reçu l’injection de 50,2 nL de Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), d’Escherichia coli (K12) ou de PBS. Alors que les témoins de PBS et d’E. coli n’ont montré aucune signification dans les rapports de survie, les injections de P. asymbiotica ont compromis rapidement la survie des mouches. Chaque courbe de survie est composée de mesures provenant de trois essais indépendants, chacun comprenant 20 larves (*** p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Drosophila melanogaster est l’un des modèles les plus précieux et les plus manipulés expérimentalement utilisés pour étudier l’immunité innée et la pathogenèse de diverses infections microbiennes. Cela est dû à son cycle de vie simple et rapide, à son entretien simple en laboratoire, à sa génétique évolutive bien établie et à sa boîte à outils génétique diversifiée. Les méthodes antérieures d’injection de larves de D. melanogaster, telles que l’utilisation d’un dispositif microfluidique hybride ou d’un micromanipulateur Narishige, nécessitent un équipement hautement spécialisé et peuvent être coûteuses21,27. Dans le protocole actuel, pour élargir l’utilisation de D. melanogaster, une technique d’injection simple qui représente une méthode efficace et rapide pour délivrer des bactéries dans l’hémocèle des larves de D. melanogaster est décrite. La partie essentielle de la technique décrite ici est l’injection réelle de l’agent pathogène souhaité ou d’autres substances liquides à l’aide d’un micro-injecteur. En plus de décrire cette opération essentielle, nous décrivons également des méthodes accessoires telles que la culture et la culture de bactéries et la manipulation de matériaux.
Le principal avantage de cette méthode est que l’aiguille est maintenue approximativement parallèlement à la larve et que la rétention se fait avec très peu de pression sur la larve, réduisant ainsi la possibilité de fuite d’hémolymphe, de blessure mortelle ou d’administration inadéquate de la substance souhaitée. L’aiguille est ensuite insérée vers l’extrémité postérieure de la larve pour compléter l’injection. La façon précise de tenir la larve, la manière d’insérer l’aiguille, la vitesse à laquelle la substance souhaitée est injectée et la direction de retrait de l’aiguille sont toutes des questions qui peuvent être améliorées par la pratique. L’étape la plus difficile à surmonter est de retirer l’aiguille de la larve sans aucune fuite d’organes essentiels. Cependant, avec la précision et l’expérience, la difficulté rencontrée lors de cette étape devient moindre.
Cette technique est également un excellent outil dans de multiples applications pour introduire une variété de substances de manière uniforme qui peut être répétée plusieurs fois, permettant ainsi des résultats cohérents. La mortalité rapide observée chez les larves infectées par P. asymbiotica reflète la forte virulence de cette souche bactérienne pour les insectes24,25,26. P. asymbiotica est bien documenté pour exprimer des gènes de virulence au cours de l’infection qui augmentent la survie bactérienne et la pathogénicité contre les insectes hôtes en inhibant la migration des hémocytes et la phagocytose24,25. On s’attend également à ce que les larves soient résistantes aux injections de souches bactériennes non pathogènes d’E. coli ainsi qu’aux injections de PBS, confirmant ainsi les résultats antérieurs dans ce domaine de recherche26. Par conséquent, la microinjection est réalisée sans aucun effet néfaste sur la viabilité animale, ce qui permet son utilisation dans des études moléculaires et immunologiques pour explorer la pathogenèse d’un large éventail d’infections microbiennes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington (GWU) pour leur lecture critique du manuscrit. GT a été soutenu par une bourse d’été Harlan de GWU. Toutes les figures graphiques ont été réalisées à l’aide de BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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