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Biochemistry

सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63147
Automatic Translation
1, 1, 1
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

Summary

डीएनए लिगैंड के साथ एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलर की बातचीत को सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके वर्णित किया गया है। उत्पन्न चोटियों द्वारा विश्लेषण किए गए जीन प्रमोटर पर प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के तंत्र को समझने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

परिपत्र डाइक्रोइज़म (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी बायोमोलेक्यूल्स की माध्यमिक संरचना और इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक सरल और सुविधाजनक तरीका है। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी में हाल की प्रगति ने विवो में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की बेहतर समझ के लिए विस्तार से विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन और डीएनए की संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम किया है। एक संभावित प्रतिलेखन क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र को प्रतिलेखन होने के लिए अनवाउंड होने की आवश्यकता होती है। यह एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें हिस्टोन संशोधनों के समन्वय की आवश्यकता होती है, डीएनए के लिए प्रतिलेखन कारक का बंधन, और अन्य क्रोमैटिन रीमॉडलिंग गतिविधियों। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके, प्रतिलेखन को बढ़ावा देने के लिए एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलर जैसे नियामक प्रोटीन के कारण प्रमोटर क्षेत्र में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करना संभव है। प्रोटीन में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों की भी निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, अपने लक्ष्य डीएनए और अनुक्रम विशिष्टता के प्रति प्रोटीन की आत्मीयता के बारे में प्रश्नों को लक्ष्य डीएनए में उत्परिवर्तन को शामिल करके संबोधित किया जा सकता है। संक्षेप में, इस संवेदनशील और सस्ती विधि की अनूठी समझ क्रोमैटिन गतिशीलता में परिवर्तन की भविष्यवाणी कर सकती है, जिससे ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की समझ में सुधार हो सकता है।

Introduction

परिपत्र डाइक्रोइज़म (सीडी) एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक है जो जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की अंतर्निहित चिरलता पर निर्भर करती है जो दाएं हाथ और बाएं हाथ के परिपत्र रूप से ध्रुवीकृत प्रकाश के विभेदक अवशोषण की ओर जाता है। इस विभेदक अवशोषण को परिपत्र डाइक्रोइज़म के रूप में जाना जाता है। इसलिए, तकनीक का उपयोग जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना को चित्रित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि प्रोटीन और डीएनए, जिनमें से दोनों में चिरल केंद्र 1,2 होते हैं।

विद्युत चुम्बकीय तरंगों में विद्युत और चुंबकीय दोनों घटक होते हैं। विद्युत और चुंबकीय क्षेत्र दोनों तरंग प्रसार की दिशा के लंबवत दोलन करते हैं। अध्रुवीकृत प्रकाश के मामले में, ये क्षेत्र कई दिशाओं में दोलन करते हैं। जब प्रकाश को गोलाकार रूप से ध्रुवीकृत किया जाता है, तो दो विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र एक दूसरे के लिए 90 ° चरण अंतर पर प्राप्त होते हैं। चिरल अणु परिपत्र ऑप्टिकल रोटेशन (birefringence) दिखाते हैं जैसे कि वे दाएं हाथ के गोलाकार ध्रुवीकृत प्रकाश और बाएं हाथ के गोलाकार ध्रुवीकृत प्रकाश को अलग-अलग हद तक अवशोषित करेंगे। परिणामी विद्युत क्षेत्र को एक दीर्घवृत्त के रूप में खोजा जाएगा, जो तरंग दैर्ध्य का एक कार्य है। इस प्रकार, सीडी स्पेक्ट्रम को अंडाकारता (क्यू) के रूप में दर्ज किया जाता है, और डेटा को तरंग दैर्ध्य के एक कार्य के रूप में माध्य अवशेष इलिप्टिकिटी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।

प्रोटीन के मामले में, अमीनो एसिड (ग्लाइसिन को छोड़कर) का Cα चिरल है, और इस मैक्रोमोलेक्यूल 4 की माध्यमिक संरचना को निर्धारित करने के लिए सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इसका शोषण किया जाता है। प्रोटीन अणुओं के सीडी स्पेक्ट्रा आमतौर पर सुदूर यूवी रेंज में दर्ज किए जाते हैं। α-हेलिकल प्रोटीन में 222 एनएम और 208 एनएम पर दो नकारात्मक बैंड और 193 एनएम 4 पर एक सकारात्मक शिखर होता है। एंटी-समानांतर β-शीट माध्यमिक संरचना वाले प्रोटीन 218 एनएम पर एक नकारात्मक चोटी और 195 एनएम 4 पर एक सकारात्मक चोटी दिखाते हैं। अव्यवस्थित संरचनाओं वाले प्रोटीन 210 एनएम के पास कम अंडाकारता दिखाते हैं और 195 एनएम 4 पर एक नकारात्मक चोटी दिखाते हैं। इस प्रकार, विभिन्न माध्यमिक संरचनाओं के लिए अच्छी तरह से परिभाषित चोटी / बैंड सीडी को विकृतीकरण के साथ-साथ लिगैंड बाइंडिंग के दौरान प्रोटीन की माध्यमिक संरचना में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों को स्पष्ट करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण बनाते हैं।

न्यूक्लिक एसिड में चिरलता के तीन स्रोत होते हैं: चीनी अणु, माध्यमिक संरचना की हेलिसिटी, और पर्यावरण में डीएनए की लंबी दूरी की तृतीयक क्रम5,6। न्यूक्लिक एसिड के सीडी स्पेक्ट्रा को आमतौर पर 190 से 300 एनएम रेंज 5,6 में दर्ज किया जाता है। डीएनए की प्रत्येक संरचना, प्रोटीन की तरह, एक विशेषता स्पेक्ट्रम देती है, हालांकि चोटियों / बैंड विलायक स्थितियों और डीएनए अनुक्रमों में अंतर के कारण कुछ डिग्री से भिन्न हो सकते हैं। बी-डीएनए, सबसे आम रूप, 260-280 एनएम के आसपास एक सकारात्मक चोटी और 245 एनएम 6 के आसपास एक नकारात्मक चोटी की विशेषता है। बी-फॉर्म डीएनए की चोटियां / बैंड आमतौर पर छोटे होते हैं क्योंकि आधार जोड़े डबल हेलिक्स के लंबवत होते हैं, जो अणु को कमजोर चिरलता प्रदान करते हैं। ए-डीएनए 260 एनएम पर एक प्रमुख सकारात्मक शिखर और 210 एनएम 6 के आसपास एक नकारात्मक चोटी देता है। जेड-डीएनए, बाएं हाथ का हेलिक्स, 290 एनएम पर एक नकारात्मक बैंड और 260 एनएम 6 के आसपास एक सकारात्मक चोटी देता है। यह डीएनए भी 205 nm6 पर एक अत्यंत नकारात्मक चोटी देता है।

इन संरचनाओं के अलावा, डीएनए ट्रिपलेक्स, क्वाड्रप्लेक्स और हेयरपिन भी बना सकता है, जिनमें से सभी को सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। समानांतर जी-क्वाड्रप्लेक्स 260 एनएम पर एक प्रमुख सकारात्मक बैंड देता है, जबकि एंटी-समानांतर जी-क्वाड्रप्लेक्स 260 एनएम पर एक नकारात्मक बैंड और 290 एनएम पर एक सकारात्मक चोटी देता है, जिससे क्वाड्रप्लेक्स संरचनाओं के दो रूपों के बीच अंतर करना आसान हो जाता है। Triplexes एक विशेषता स्पेक्ट्रम 8 नहीं देते हैं। उदाहरण के लिए, एक 36 न्यूक्लियोटाइड-लंबे डीएनए का स्पेक्ट्रा एक इंट्रामोलेक्यूलर ट्रिपल हेलिक्स बनाने की क्षमता के साथ जिसमें जीजी.C और टीएटी बेस जोड़े शामिल हैं, ना + की उपस्थिति में 240 एनएम और एक व्यापक सकारात्मक शिखर पर एक मजबूत नकारात्मक बैंड दिखाते हैं। व्यापक सकारात्मक शिखर 266, 273, और 286 एनएम पर योगदान दिखाता है। Na + और Zn + की उपस्थिति में एक ही ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड चार नकारात्मक बैंड (213, 238, 266, और 282 एनएम) और 258 एनएम पर एक सकारात्मक चोटी दिखाता है। इस प्रकार, ट्रिपलेक्स डीएनए का स्पेक्ट्रा नमक की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकता है8।

इन संरचनाओं के अलावा, सीडी स्पेक्ट्रा ने डीएनए के एक अन्य रूप की पहचान को सक्षम किया है जिसे एक्स-डीएनए कहा जाता है। एक्स-डीएनए का गठन तब होता है जब डीएनए अनुक्रम में वैकल्पिक एडेनिन और थाइमिन अवशेष होते हैं। एक्स-डीएनए के सीडी स्पेक्ट्रा में 250 और 280 एनएम पर दो नकारात्मक चोटियां होती हैं। एक्स-डीएनए के बारे में बहुत कम जानकारी उपलब्ध है, हालांकि यह सकारात्मक सुपरकॉइलिंग 6,9 के लिए सिंक के रूप में कार्य करने का अनुमान लगाया गया है। सीडी स्पेक्ट्रा में परिवर्तन लिगैंड-प्रोटीन इंटरैक्शन के बारे में विवरण भी प्रकट कर सकते हैं और इसलिए, ड्रग-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए आणविक तरीकों के शस्त्रागार में जोड़ा गया है10,11,12,13,14। सीडी स्पेक्ट्रा का उपयोग तह प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन की माध्यमिक संरचना में परिवर्तन की निगरानी के लिए भी किया गया है15। इसी तरह, सीडी स्पेक्ट्रा का उपयोग लिगैंड-डीएनए इंटरैक्शन 16,17 की जांच के लिए भी किया जा सकता है।

सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी, इस प्रकार, डीएनए संरचना के विभिन्न रूपों के बीच अंतर करने के लिए एक आसान, सस्ती विधि है, बशर्ते कि गैर-सस्ते उपकरण और सॉफ़्टवेयर तक पहुंच हो। विधि अत्यधिक संवेदनशील और त्वरित है। इसके लिए केवल डीएनए की एक छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, जिससे इसे परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी की वैकल्पिक तकनीक पर एक बढ़त मिलती है। लिगेंड और सब्सट्रेट के साथ अनुमापन भी प्रदर्शन करना आसान है। मुख्य बाधा यह है कि डीएनए अत्यधिक शुद्ध होना चाहिए। पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) -शुद्ध डीएनए का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।

सीडी स्पेक्ट्रा द्वारा प्राप्त जानकारी का उपयोग मुख्य रूप से प्रोटीन संरचनात्मक विशेषताओं को कम करने और अलग-अलग डीएनए संरूपकों की पहचान करने के लिए किया गया है। इस अध्ययन में, सीडी स्पेक्ट्रा का उपयोग इन विवो क्रोमैटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (CHIP) प्रयोग से प्राप्त परिणामों को एकीकृत करने के लिए किया गया है ताकि यह दर्शाया जा सके कि ब्याज / अनुमानित प्रतिलेखन कारक का प्रोटीन इसके प्रभावकारी जीन के प्रमोटर क्षेत्र में एक संरचनात्मक परिवर्तन ला सकता है या नहीं। यह सहयोग एक प्रमोटर के प्रतिलेखन प्रारंभ साइट (टीएसएस) पर और उसके आसपास अनुमानित प्रतिलेखन कारक द्वारा प्रतिलेखन विनियमन के तंत्र की भविष्यवाणी करके पारंपरिक सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकों की प्रगति में सहायता करता है।

क्रोमैटिन रीमॉडलिंग एक अच्छी तरह से परिभाषित तंत्र है जो डीएनए चयापचय प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जाना जाता है, कसकर पैक किए गए क्रोमैटिन को विभिन्न नियामक कारकों जैसे प्रतिलेखन कारकों, डीएनए प्रतिकृति के घटकों, या क्षति मरम्मत प्रोटीन के लिए सुलभ बनाकर। एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलर, जिसे प्रोटीन के एसडब्ल्यूआई / एसएनएफ परिवार के रूप में भी जाना जाता है, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में मौजूद प्रमुख रीमॉडलर प्रोटीन हैं18,19। Phylogenetic clustering ने प्रोटीन के SWI / SNF परिवार को 6 उप-समूहों में वर्गीकृत किया है20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, और दूर। SMARCAL1, इस अध्ययन में रुचि का प्रोटीन, दूर के उप-समूह 20 से संबंधित है। इस प्रोटीन का उपयोग सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के अपने तरीके की जांच करने के लिए किया गया है।

एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन के अधिकांश सदस्यों को या तो न्यूक्लियोसोम को पुनर्स्थापित करने या बेदखल करने या एटीपी-निर्भर तरीके से हिस्टोन वेरिएंट एक्सचेंज की मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है21,22। हालांकि, इस परिवार के कुछ सदस्यों को न्यूक्लियोसोम को फिर से तैयार करने के लिए नहीं दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, SMARCAL1। भले ही अध्ययनों से पता चला है कि SMARCAL1 पॉलीटेन गुणसूत्रों के साथ संबद्ध है, न्यूक्लियोसोम को फिर से तैयार करने की क्षमता के बारे में प्रयोगात्मक साक्ष्य की कमी है23। इसलिए, यह माना गया था कि SMARCAL1 DNA24 की संरचना को बदलकर प्रतिलेखन को विनियमित कर सकता है। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी ने इस परिकल्पना को मान्य करने के लिए एक आसान और सुलभ विधि प्रदान की।

SMARCAL1 एक एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन है जो मुख्य रूप से एक एनीलिंग हेलिकेस 25,26,27 के रूप में कार्य करता है। यह डीएनए conformation24 remodeling द्वारा प्रतिलेखन को संशोधित करने के लिए postulated किया गया है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, डोक्सोरुबिसिन-प्रेरित डीएनए क्षति के दौरान जीन प्रतिलेखन को विनियमित करने में SMARCAL1 की भूमिका का अध्ययन किया गया था। इन अध्ययनों में, SMARCAL1 का उपयोग इन विट्रो assays28,29 के लिए विवो विश्लेषण और ADAAD के लिए किया गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एडीएएडी डीएनए को एक संरचना-निर्भर लेकिन अनुक्रम-स्वतंत्र तरीके से पहचान सकता है30,31। प्रोटीन डीएनए अणुओं को बेहतर ढंग से बांधता है, जिसमें डबल-स्ट्रैंड को एकल-स्ट्रैंड संक्रमण क्षेत्रों में रखा जाता है, स्टेम-लूप डीएनए के समान, और एटीपी 30,31 को हाइड्रोलाइज़ करता है।

विवो प्रयोगों में दिखाया गया है कि SMARCAL1 MYC, DROSHA, DGCR8, और DICER की अभिव्यक्ति को प्रमोटर क्षेत्रों 28,29 के लिए बाध्यकारी द्वारा नियंत्रित करता है। बातचीत के क्षेत्र की पहचान CHIP प्रयोग28,29 द्वारा की गई थी। CHIP तकनीक का उपयोग कोशिका के भीतर अपने संज्ञेय डीएनए के साथ प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। इसका लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि क्या विशिष्ट प्रोटीन, जैसे प्रमोटरों या अन्य डीएनए बाध्यकारी साइटों पर प्रतिलेखन कारक, विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों के लिए बाध्य हैं या नहीं। डीएनए से बंधे प्रोटीन को पहले फॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करके क्रॉस-लिंक किया जाता है। इसके बाद क्रोमैटिन का अलगाव होता है। पृथक क्रोमैटिन को sonication या न्यूक्लिएज पाचन द्वारा 500 बीपी के टुकड़ों में कतरनी की जाती है, और डीएनए से बंधे प्रोटीन को प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके immunoprecipitated किया जाता है। क्रॉस-लिंकिंग को उलट दिया जाता है, और डीएनए का विश्लेषण या तो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) या मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके किया जाता है।

CHIP परिणामों ने इस परिकल्पना को जन्म दिया कि SMARCAL1 संभवतः इन जीनों के प्रमोटर क्षेत्रों में एक संरचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करके ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की मध्यस्थता करता है। QGRS मैपर और Mfold सॉफ़्टवेयर का उपयोग इन प्रमोटर क्षेत्रों की क्षमता की पहचान करने के लिए माध्यमिक संरचनाओं 28,29 बनाने के लिए किया गया था। क्यूजीआरएस मैपर का उपयोग जी-क्वाड्रप्लेक्स 32 की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है, जबकि Mfold33 स्टेम-लूप जैसी माध्यमिक संरचनाओं को बनाने के लिए एक अनुक्रम की क्षमता का विश्लेषण करता है।

माध्यमिक संरचना विश्लेषण के बाद, आगे इन विट्रो प्रयोगों को पुनः संयोजक 6X के साथ किया गया था, उनके द्वारा टैग किए गए सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase A डोमेन (ADAAD), SMARCAL1 का गोजातीय होमोलॉग, Escherichia coli34 से शुद्ध किया गया था। ATPase assays को ADAAD का उपयोग करके यह स्थापित करने के लिए किया गया था कि पहचाने गए डीएनए अनुक्रम effectors28,29 के रूप में कार्य कर सकते हैं। अंत में, सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी को ADAAD28,29 द्वारा डीएनए अणु में प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए किया गया था।

यह साबित करने के लिए कि प्रोटीन की ATPase गतिविधि डीएनए अणु में एक संरचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए आवश्यक थी, या तो ethylenediamine tetraacetic एसिड (EDTA) को चेलेट Mg + 2 या सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase A डोमेन इनहिबिटर नियोमाइसिन (ADAADiN), SWI / SNF प्रोटीन का एक विशिष्ट अवरोधक, जोड़ा गया था35,36 . इस सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक का उपयोग किसी भी शुद्ध प्रोटीन के साथ किया जा सकता है जिसे CHIP या किसी अन्य प्रासंगिक परख द्वारा प्रदर्शित किया गया है ताकि एक प्रमोटर के अनुमानित जीनोमिक क्षेत्र को बांधा जा सके।

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Protocol

1. प्रतिक्रिया घटकों के काम एकाग्रता

  1. सीडी और अन्य प्रतिक्रिया घटकों के लिए बफर की कार्यशील सांद्रता को ताजा तैयार करें ( तालिका 1 देखें) और प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने से पहले उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: इस पेपर में वर्णित सीडी प्रतिक्रियाओं के लिए, घटकों की काम करने वाली सांद्रता निम्नानुसार है: सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.0) 1 एमएम, एटीपी 2 एमएम, डीएनए 500 एनएम, प्रोटीन 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM।

2. ATPase गतिविधि

  1. सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी से पहले, डीएनए अणुओं की उपस्थिति में प्रोटीन की एटीपीएस गतिविधि स्थापित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी में उपयोग किया जाने वाला प्रोटीन सक्रिय है और डीएनए अणुओं की पहचान करने के लिए जो एटीपी हाइड्रोलिसिस को प्राप्त करने में इष्टतम रूप से प्रभावी हैं।
  2. एक NADH-युग्मित ऑक्सीकरण परख निम्नलिखित दो प्रतिक्रियाओं से मिलकर द्वारा विभिन्न डीएनए अणुओं की उपस्थिति में प्रोटीन की ATPase गतिविधि को मापने.
    1. 0.1 μM ADAAD, 2 mM एटीपी, 10 nM डीएनए, और 1x REG बफर को 96-अच्छी तरह से प्लेट में 250 μL की अंतिम मात्रा में मिलाएं।
      नोट: पाइरूवेट किनेज एंजाइम एडीपी और पाई का उपयोग फॉस्फोएनॉलपाइरूवेट को पाइरूवेट में परिवर्तित करने के लिए करता है, इस प्रकार एटीपी को पुनर्जीवित करता है। यह सुनिश्चित करता है कि एटीपी हमेशा प्रतिक्रिया में संतृप्त एकाग्रता में होता है। दूसरी प्रतिक्रिया में, पाइरूवेट किनेज की क्रिया से बनने वाले पाइरूवेट को लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज द्वारा लैक्टेट में परिवर्तित किया जाता है। इस प्रतिक्रिया में, एक NADH अणु को NAD+ में ऑक्सीकरण किया जाता है। एनएडीएच की खपत को 340 एनएम पर अणु के अवशोषण को मापकर मापा जाता है।
    2. एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 340 एनएम पर एनएडी + की मात्रा को मापें।
    4. एनएडी + की मात्रा को मापने के लिए, माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
      1. 340 एनएम पर absorbance को मापने के लिए NADH परख पर क्लिक करें।
      2. उपकरण में प्लेट धारक पर 96-अच्छी तरह से प्लेट रखें। Absorbance रिकॉर्ड करने के लिए रीड प्लेट बटन पर क्लिक करें।
        नोट: NAD+ की सांद्रता की गणना NADH के दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके eq (1) का उपयोग करके 6.3 mM−1 के रूप में की जाती है।
        A = πcl (1)

        यहाँ, A = Absorbance
        ε = दाढ़ विलोपन गुणांक
        c = दाढ़ सांद्रता
        l = सेमी में ऑप्टिकल पथ की लंबाई

3. चुनना और सीडी cuvettes की तैयारी

  1. उच्च पारदर्शिता क्वार्ट्ज cuvettes में सीडी स्पेक्ट्रा ले लीजिए. आयताकार या बेलनाकार क्यूवेट का उपयोग करें।
    नोट: इस पेपर में वर्णित सभी प्रतिक्रियाओं के लिए एक सीडी क्वार्ट्ज क्यूवेट (0.4 मिलीलीटर की नाममात्र मात्रा, 1 मिमी की पथ-लंबाई) का उपयोग किया गया था।
  2. क्यूवेट को साफ करने के लिए एक क्यूवेट सफाई समाधान का उपयोग करें। समाधान के 400 μL बनाने के लिए पानी में 1% क्यूवेट सफाई समाधान जोड़ें, इसे क्यूवेट में डालें, और इसे 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. क्यूवेट को साफ करने के लिए कई बार पानी से क्यूवेट को धोएं। यह जांचने के लिए कि क्या यह साफ है, क्यूवेट में पानी या बफर का स्कैन लें।
    नोट:: पानी या बफ़र 0 से 1 mdeg श्रेणी में एक पठन देना चाहिए।

4. प्रोटीन और डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड की तैयारी

  1. बफर घटकों की मात्रा को कम करने के लिए प्रतिक्रिया में प्रोटीन की मात्रा को 50 μL से नीचे रखें जो कभी-कभी अस्पष्ट चोटियों के गठन का कारण बनते हैं। किसी भी गिरावट से बचने के लिए पूरे प्रयोग के दौरान प्रोटीन को बर्फ पर रखें।
  2. प्रतिक्रियाओं में पृष्ठ-शुद्ध डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करें।
    नोट: यहां वर्णित प्रतिक्रियाओं में, डीएनए का उपयोग देशी के साथ-साथ हीट-कूल्ड रूपों (फास्ट-कूल्ड (एफसी) और स्लो-कूल्ड (एससी)) दोनों में किया गया था। फास्ट कूलिंग डीएनए में इंट्रामोलेक्यूलर बॉन्डिंग को बढ़ावा देती है, जिससे अधिक माध्यमिक संरचनाएं उत्पन्न होती हैं। इसके विपरीत, धीमी गति से ठंडा डीएनए में इंटरमॉलिक्युलर बॉन्डिंग को बढ़ावा देता है, जिसके परिणामस्वरूप कम माध्यमिक संरचनाएं होती हैं।
  3. तेजी से ठंडा करने के लिए, हीटिंग ब्लॉक पर 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए को गर्म करें और तुरंत इसे बर्फ पर ठंडा करें। धीमी गति से ठंडा करने के लिए, 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए को गर्म करें और इसे प्रति मिनट 1 डिग्री सेल्सियस की दर से कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें।

5. बेसलाइन स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों की स्थापना

  1. सभी प्रतिक्रियाओं में प्रतिक्रिया मात्रा को 300 μL पर रखें। 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में कुल 5 बेसलाइन प्रतिक्रियाओं को सेट करें, एक-एक करके, निम्नानुसार: i) बफर + पानी; ii) बफर + MgCl2 + एटीपी + पानी; iii) बफर + MgCl2 + एटीपी + प्रोटीन + पानी; iv) iii + EDTA या ADAADiN; v) बफर + प्रोटीन + पानी।

6. सीडी स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोगों की स्थापना

  1. 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक-एक करके कुल 5 प्रतिक्रियाओं को निम्नानुसार सेट करें: i) बफर + डीएनए + पानी; ii) बफर + डीएनए + MgCl2 + एटीपी + पानी; iii) बफर + डीएनए + MgCl2 + एटीपी + प्रोटीन + पानी; iv) iii + EDTA या ADAADiN; v) बफर + डीएनए + प्रोटीन + पानी।

7. रिकॉर्डिंग स्कैन

  1. गैस को चालू करें और सीडी स्पेक्ट्रोमीटर को चालू करें।
  2. 10-15 मिनट के बाद दीपक को चालू करें। पानी के स्नान पर स्विच करें और धारक का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. CD स्पेक्ट्रम सॉफ़्टवेयर खोलें.
    1. तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. तरंग दैर्ध्य सीमा को 180 - 300 एनएम पर सेट करें।
    3. प्रति बिंदु समय 0.5 सेकंड पर सेट करें।
    4. स्कैन नंबर को 5 पर सेट करें।
    5. प्रो-डेटा व्यूअर पर क्लिक करें, एक नई फ़ाइल बनाएं, और प्रयोग और तिथि के बारे में विवरण के साथ इसका नाम बदलें।
  4. किसी भी गिरावट से बचने के लिए सभी प्रतिक्रिया घटकों को बर्फ पर रखें। बेसलाइन और प्रतिक्रियाएं, एक-एक करके, सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बनाएं और उन्हें पिपेटिंग द्वारा मिलाएं। प्रतिक्रिया मिश्रण को ध्यान से क्यूवेट में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
  5. यदि एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग कर रहा है, तो आवश्यक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें और स्कैन लें। एटीपी हाइड्रोलिसिस को रोकने के लिए डीएनए, एटीपी, एमजी + 2 और प्रोटीन युक्त बफर में ईडीटीए जोड़ें।
  6. ATPase गतिविधि को पूरी तरह से बाधित करने के लिए EDTA और इसके इनक्यूबेशन समय की एकाग्रता में वृद्धि करें।
  7. सॉफ़्टवेयर में संबंधित प्रतिक्रियाओं से बेसलाइन को घटाएं (उदाहरण के लिए, बेसलाइन 1 से प्रतिक्रिया 1 घटाएं)। डेटा को या तो CD स्पेक्ट्रम सॉफ़्टवेयर में या डेटा प्लॉटिंग सॉफ़्टवेयर में चिकना करें. डेटा प्लॉटिंग सॉफ़्टवेयर में डेटा प्लॉट करें.
    नोट: इसी प्रतिक्रियाओं से बेसलाइन घटाने से केवल डीएनए का शुद्ध सीडी स्पेक्ट्रा मिलेगा।

8. डेटा विश्लेषण और व्याख्या

  1. मिलिइडग्रीज में प्राप्त मूल्यों को माध्य अवशेष दीर्घवृत्तीयता में परिवर्तित करने के लिए eq (2) द्वारा दिए गए सूत्र का उपयोग करें।
    Equation 1(2)
    यहां, एस मिलाइडग्रीज में सीडी सिग्नल है, सी मिलीग्राम / एमएल में डीएनए एकाग्रता है, एमआरडब्ल्यू माध्य अवशेष द्रव्यमान है, और एल सेमी में पथ की लंबाई है।
  2. तरंग दैर्ध्य के खिलाफ एक ग्राफ प्लॉट और मतलब अवशेषों ellipticity डेटा प्लॉटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और चोटियों का विश्लेषण.
  3. ग्राफ को प्लॉट करने के लिए, एक्स-अक्ष पर वाई-अक्ष और तरंग दैर्ध्य पर माध्य अवशेष अंडाकारता का चयन करें और एक सीधी रेखा ग्राफ को प्लॉट करें।
    नोट: यह ग्राफ डीएनए के विभिन्न रूपों की विशेषताओं को प्रदान करेगा। चोटियों के अनुरूप डीएनए के रूपों को मौजूदा साहित्य 6 का उपयोग करके पहचाना जा सकता है।

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Representative Results

ADAAD MYC प्रमोटर पर स्टेम-लूप जैसी संरचना को स्थिर करता है
पिछले प्रयोगात्मक साक्ष्य से पता चला है कि SMARCAL1 MYC29 का एक नकारात्मक नियामक है। क्यूजीआरएस मैपर द्वारा एमवाईसी जीन के 159 बीपी लंबे प्रमोटर क्षेत्र के विश्लेषण से पता चला है कि आगे के स्ट्रैंड में जी-क्वाड्रप्लेक्स (तालिका 2) बनाने की क्षमता थी। एमफोल्ड ने दिखाया कि एमवाईसी डीएनए के दोनों स्ट्रैंड एक स्टेम-लूप जैसी संरचना बना सकते हैं (तालिका 2)। एक 34 बीपी लंबा डीएनए अनुक्रम जिसमें जी-क्वाड्रप्लेक्स (जीईसीई) शामिल है, को संश्लेषित किया गया था। GECE ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के आगे और रिवर्स अनुक्रम की Mfold संरचनाओं को चित्र 1A, B में दिखाया गया है।

ATPase assays 6X His-ADAAD का उपयोग करके दिखाया गया है कि तेजी से ठंडा GECE देशी और धीमी गति से ठंडा रूपों की तुलना में एक बेहतर effector था। इसलिए, एटीपी और एडीएएडी की अनुपस्थिति और उपस्थिति में सीडी स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करने के लिए फास्ट-कूल्ड जीईसीई का उपयोग किया गया था। सीडी स्पेक्ट्रा से पता चला है कि एडीएएडी दो सकारात्मक चोटियों को प्रेरित करता है- एक 258 एनएम पर 269 एनएम पर कंधे के साथ और डीएनए में 210 एनएम पर एक बड़ी चोटी (चित्रा 1 सी)। 240 एनएम के आसपास नकारात्मक की ओर एक डुबकी भी देखी गई थी। यह स्पेक्ट्रम प्राप्त एक के समान था जब एक सिंथेटिक स्टेम-लूप डीएनए, एडीएएडी का इष्टतम प्रभावक, प्रोटीन और एटीपी (चित्रा 2 ए, बी) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। ट्रिपलेक्स डीएनए एक समान स्पेक्ट्रम 37 दे सकता है, जिससे यह परिकल्पना हो सकती है कि प्रोटीन इस मामले में इस तरह की संरचना को प्रेरित कर सकता है। एटीपी एमजी + 2 के साथ एक समन्वय परिसर बनाता है, और यह धनायन एटीपी हाइड्रोलिसिस के लिए आवश्यक है। ईडीटीए चेलेट्स एमजी + 2 के अलावा, एटीपी हाइड्रोलिसिस 38 के निषेध के लिए अग्रणी। इसलिए, ईडीटीए को यह समझने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा गया था कि क्या एडीएएडी द्वारा एटीपी हाइड्रोलिसिस संरचनात्मक परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण था। प्रतिक्रिया के लिए ईडीटीए के अलावा इस संरचना को रद्द कर देता है। सीडी स्पेक्ट्रा में अब एक नकारात्मक 210 एनएम पीक और 230 और 250 एनएम (चित्रा 1 सी) पर चोटियों के साथ एक व्यापक सकारात्मक बैंड है।

ATPase गतिविधि के महत्व की पुष्टि भी ADAAD के ATPase-मृत उत्परिवर्ती का उपयोग करके की गई थी। K241A उत्परिवर्तन आकृति I के संरक्षित GKT बॉक्स में होता है, और इस उत्परिवर्ती को पहले DNA31 की उपस्थिति में एटीपी को हाइड्रोलाइज़ करने की क्षमता की कमी के लिए दिखाया गया है। उत्परिवर्ती प्रोटीन को जीएसटी टैग के साथ व्यक्त किया गया था और ग्लूटाथियोन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। इस उत्परिवर्ती द्वारा MYC डीएनए में प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तन जंगली-प्रकार के ADAAD द्वारा प्रेरित से अलग था। उत्परिवर्ती प्रोटीन की उपस्थिति में एमवाईसी डीएनए के सीडी स्पेक्ट्रम में एक सकारात्मक 210 एनएम चोटी और एक नकारात्मक 260 एनएम चोटी (चित्रा 1 डी) थी।

ADAAD DROSHA प्रमोटर में संरचना के ए-रूप को प्रेरित करता है
DROSHA, DGCR8, और DICER के प्रमोटर क्षेत्रों का विश्लेषण भी QGRS मैपर और Mfold सॉफ़्टवेयर द्वारा किया गया था। QGRS और MFold दोनों ने दिखाया कि प्रमोटर क्षेत्रों में G-quadruplex और स्टेम जैसी संरचनाओं (तालिका 2) को बनाने की क्षमता है। आगे और रिवर्स ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की एमफोल्ड संरचनाओं को चित्र 3 ए, बी में दिखाया गया है। ATPase गतिविधि से पता चला है कि देशी और गर्मी ठंडा डीएनए इसी तरह से व्यवहार किया। इसलिए, इन डीएनए अनुक्रमों के धीमे-ठंडे रूप का उपयोग सीडी अध्ययन के लिए किया गया था। सीडी स्पेक्ट्रा से पता चला है कि ADAAD 210 एनएम पर एक नकारात्मक चोटी और DROSHA प्रमोटर (चित्रा 3 C) में 260 एनएम पर एक सकारात्मक चोटी को प्रेरित करता है। यह स्पेक्ट्रम ए-डीएनए 6 की एक विशेषता है।

ADAAD DGCR8 प्रमोटर में B-X संक्रमण और G-quadruplex गठन को प्रेरित करता है
आगे की एमफोल्ड संरचनाओं और उपयोग किए गए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रिवर्स स्ट्रैंड्स को चित्र 4 ए, बी में दिखाया गया है। डीजीसीआर 8 जोड़ी 1 (चित्रा 4 सी) के लिए 210 एनएम पर एक सकारात्मक चोटी और 260 एनएम पर एक व्यापक नकारात्मक चोटी देखी गई थी। यह स्पेक्ट्रम बी-एक्स संक्रमण 6 की विशेषता है। आगे की Mfold संरचनाओं और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रिवर्स स्ट्रैंड्स का उपयोग चित्र 4D, E में दिखाया गया है। DGCR8 जोड़ी 7 के सीडी स्पेक्ट्रा ने 210 और 270 एनएम पर एक मजबूत सकारात्मक शिखर और 250 एनएम (चित्रा 4 एफ) पर एक नकारात्मक शिखर दिखाया। यह स्पेक्ट्रम समानांतर जी-क्वाड्रप्लेक्स डीएनए संरचनाओं की विशेषता है6।

ADAAD DICER प्रमोटर में A-X संक्रमण को प्रेरित करता है
आगे और रिवर्स ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की Mfold संरचनाओं को चित्र 5A, B में दिखाया गया है। 210 एनएम पर एक सकारात्मक चोटी और दो नकारात्मक चोटियां- एक 230 एनएम पर और दूसरा 260 एनएम पीक पर- DICER जोड़ी 1 (चित्रा 5 C) के लिए मनाया गया था। ये चोटियां ए-एक्स डीएनए संक्रमण 6,9 की विशेषता हैं। प्रतिलेखन प्रक्रिया में विशिष्ट भूमिकाओं वाले सभी सीडी स्पेक्ट्रा चोटियों और डीएनए के रूपों को तालिका 3 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: ADAAD GECE डीएनए की संरचना को बदल देता है। (ए) फॉरवर्ड स्ट्रैंड और (बी) रिवर्स स्ट्रैंड के लिए एमफोल्ड संरचनाओं की भविष्यवाणी की गई थी। (सी) अकेले जीईसीई का सीडी स्पेक्ट्रा (काला), जीईसीई एटीपी और एडीएएडी के साथ इनक्यूबेट (लाल) से पहले और ईडीटीए (नीला) जोड़ने के बाद। (घ) एटीपी और जीएसटी-टैग किए गए एडीएएडी के साथ इनक्यूबेट किए गए जीईसीई के सीडी स्पेक्ट्रा को (काले) से पहले और ईडीटीए (लाल) के साथ-साथ एटीपी और जीएसटी-टैग किए गए के 241 ए उत्परिवर्ती (नीले) के साथ इनक्यूबेट किए गए जीईसीई के सीडी स्पेक्ट्रा को जोड़ने के बाद। इस आंकड़े को 29 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ADAAD = सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase एक डोमेन; CD = Circular dichroism कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ADAAD slDNA की संरचना को बदल देता है। (A) स्टेम-लूप डीएनए के लिए भविष्यवाणी की गई Mfold संरचना। (बी) अकेले slDNA (काला), एटीपी और ADAAD (लाल) के साथ incubated slDNA के सीडी स्पेक्ट्रा. इस आंकड़े को 29 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ADAAD = सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase एक डोमेन; slDNA = स्टेम-लूप डीएनए; CD = Circular dichroism कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ADAAD DROSHA जोड़ी 5 डीएनए की संरचना को बदल देता है। (ए) फॉरवर्ड स्ट्रैंड और (बी) रिवर्स स्ट्रैंड के लिए भविष्यवाणी की गई एमफोल्ड संरचना। (C) DROSHA जोड़ी का CD स्पेक्ट्रा अकेले 5 DNA (काला), DROSHA जोड़ी 5 DNA ATP और ADAAD (लाल) के साथ इनक्यूबेट किया गया है। इस आंकड़े को 28 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ADAAD = सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase एक डोमेन; CD = Circular dichroism कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ADAAD DGCR8 जोड़ी 1 और 7 डीएनए की संरचना को बदल देता है। Mfold संरचनाओं (ए) आगे स्ट्रैंड और (बी) DGCR8 जोड़ी 1 oligonucleotide के रिवर्स स्ट्रैंड के लिए भविष्यवाणी की. (C) DGCR8 युग्म 1 का CD स्पेक्ट्रा अकेले (काला), DGCR8 युग्म 1 एटीपी और ADAAD (लाल) के साथ इनक्यूबेट किया गया है। Mfold संरचनाओं (डी) आगे स्ट्रैंड और (ई) DGCR8 जोड़ी 7 oligonucleotide के रिवर्स स्ट्रैंड के लिए भविष्यवाणी की. (च) अकेले डीजीसीआर8 जोड़ी 7 (काला), डीजीसीआर 8 जोड़ी 7 का सीडी स्पेक्ट्रा एटीपी और एडीएएडी (लाल) के साथ इनक्यूबेट किया गया है। इस आंकड़े को 28 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ADAAD = सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase एक डोमेन; CD = Circular dichroism कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ADAAD DICER जोड़ी 1 डीएनए की संरचना को बदल देता है। (ए) फॉरवर्ड स्ट्रैंड और (बी) डीआईसीईआर जोड़ी 1 ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के रिवर्स स्ट्रैंड के लिए भविष्यवाणी की गई एमफोल्ड संरचना। (C) DICER युग्म 1 का CD स्पेक्ट्रा अकेले (काला), DICER युग्म 1 एटीपी और ADAAD (लाल) के साथ इनक्यूबेट किया गया। इस आंकड़े को 28 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: ADAAD = सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase एक डोमेन; CD = Circular dichroism कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5x REG बफ़र
घटक कार्यशील एकाग्रता
लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) 50 इकाई/एमएल
मैग्नीशियम एसीटेट (Mg(OAc)2) 30 mM
फॉस्फोएनॉलपाइरूवेट (पीईपी) 6.8 mg/mL
Pottasium एसीटेट (KOAc) 300 mM
पाइरूवेट किनेज (पीके) 50 इकाई/एमएल
Tris एसीटेट (Tris-OAc) 125 mM
β-mercaptoethanol (β-ME) 25 mM

तालिका 1: बफ़र घटक.

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स अग्रेषित अनुक्रम ΠG (m-Fold) Kcal/mol जी स्कोर (QGRS मैपर) रिवर्स अनुक्रम ΠG kcal/mol (Mfold prediction) जी स्कोर (QGRS मैपर)
slDNA GCGCAATTGCGCTCGA
CGATTTTTTAGCGCAA
TTGCGC		 -16.36 - - - -
MYC GECE CGCGCGTGGCGTGG
CGGTGGGCGCGCA
GTGCGTT		 -8.64 19 AACGCACTGCGCGCC
CACCGCCCCACGCCA
CGCGCG		 -5.74 -
DROSHA जोड़ी 5 GGCCAGGCACGGTG
GCTTATGCCTGTAAT
CCCAGCCCTTTGGGA
GGCTGAGGCAGG		 -10.18 19, 19 CCTGCCTCAGCCTCC
CAAAGGGCTGGGATT
ACAGGCATAAGCCAC
CGTGCCTGGCC		 -10.95 -
DGCR8 जोड़ी 1 GCCACCGTGCCCGG
CCGAACCACCGTGC
CCGGCCGAACCC		 -7.9 - GGGTTCGGCCGGGGG
CACGGTGGTTCGG
CCGGGCACGGGGTGGC		 -9.4 21
DGCR8 जोड़ी 7 TCATACTGCCGCTG
GGTTGGGCGGGAG
GCTGCAGCGGGAG		 -7.99 33 TCCCGCTGCAGCCT
CCCGCCCAACCCAG
CGGCAGTATGAC		 -5.43 -
DICER जोड़ी 1 AAGTGCTCAGGAG
CCATGTGGGGGGCTG
GTGGCCCCAAACTG		 -8.82 19 CAGTTTGGGGCCCCAC
CAGCCCCACATGGC
TCCTGAGCACTT		 -9.16 -

तालिका 2: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम। सभी अनुक्रम 5'-3' दिशा में हैं। संक्षिप्त रूप: slDNA = स्टेम-लूप डीएनए।

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स एनएम में सीडी स्पेक्ट्रा चोटियों (एटीपी और ADAAD के साथ incubating के बाद) DNA का रूप प्रतिलेखन में भूमिका
slDNA +215, +250, +272 ट्रिपलेक्स दमन
MYC GECE +210, +258, +269 ट्रिपलेक्स दमन
DROSHA जोड़ी 5 -210, +260 A-DNA प्रारंभ/सक्रियण
DGCR8 जोड़ी 1 +210,-260 B-X संक्रमण सकारात्मक सुपरकोइलिंग/
DGCR8 जोड़ी 7 +210, -250, +270 G-quadruplex सक्रियण
DICER जोड़ी 1 +210, -230, -257 A-X संक्रमण सकारात्मक सुपरकोइलिंग/

तालिका 3: सीडी स्पेक्ट्रा चोटी प्रतिलेखन में उनकी भूमिका के साथ डीएनए के विभिन्न रूपों के अनुरूप है। संक्षेप: ADAAD = सक्रिय डीएनए-निर्भर ATPase एक डोमेन; CD = Circular dichroism

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Discussion

इस लेख का उद्देश्य एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन की उपस्थिति में डीएनए में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने और जीन अभिव्यक्ति के लिए इन संरचनात्मक परिवर्तनों को जोड़ने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक को पेश करना है। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी डीएनए में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक तेज और आसानी से सुलभ विधि प्रदान करता है।

इस तकनीक के लिए विचार किए जाने वाले एक महत्वपूर्ण बिंदु डीएनए और प्रोटीन की शुद्धता है। यह सुनिश्चित करने की सलाह दी जाती है कि डीएनए और प्रोटीन दोनों >95% शुद्ध हैं। पृष्ठ-शुद्ध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग परख में किया जाना चाहिए, और प्रोटीन को अधिमानतः >95% शुद्धता के लिए आत्मीयता-शुद्ध किया जाना चाहिए। अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर यह है कि क्यूवेट को साफ किया जाना चाहिए जैसे कि बेसलाइन रीडिंग 1 एमडीईजी से अधिक न हो। बफ़र्स को ऑटोक्लेव्ड पानी का उपयोग करके बनाया जाना चाहिए, और बफर की बेसलाइन रीडिंग 1 एमडीईजी से अधिक नहीं होनी चाहिए। प्रमोटर की संरचना का अध्ययन करने के लिए, उन क्षेत्रों की पहचान करना आवश्यक है जहां प्रोटीन बांधता है। इसलिए, ब्याज के प्रोटीन का उपयोग करके CHIP प्रयोग करने की सलाह दी जाती है क्योंकि यह प्रक्रिया प्रोटीन द्वारा बाध्य प्रभावकारी जीन के प्रमोटर क्षेत्र में मौजूद डीएनए अनुक्रमों की पहचान करने में मदद करती है। एक बार क्षेत्र की पहचान हो जाने के बाद, विशिष्ट संरचनाओं को अपनाने के लिए अनुक्रम की क्षमता का विश्लेषण उपलब्ध जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि CHIP प्राइमर आमतौर पर 200 बीपी लंबे होते हैं और इसमें कई संरचनाएं हो सकती हैं। इसलिए, संरचनाओं की पहचान करने के लिए जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करने से एक संरचना के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की लंबाई को कम करने में मदद मिलेगी।

अंत में, यदि ब्याज का प्रोटीन एक एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन है, तो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की क्षमता को एक प्रभावक के रूप में कार्य करने के लिए ATPase assays का उपयोग करके जांचा जाना चाहिए। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी और ATPase assays दोनों में, यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि प्रतिक्रिया में लिगैंड की संतृप्त सांद्रता का उपयोग किया जाता है। यदि संभव हो, तो सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन के लिए पृथक्करण स्थिरांक (केडी) की गणना की जानी चाहिए। बाइंडिंग पैरामीटर की गणना करने के लिए कई विधियाँ उपलब्ध हैं. ATPase assays का उपयोग करते हुए, Michaelis-Menten constant (KM) की गणना डीएनए की बढ़ती सांद्रता को टाइटरेट करके की जा सकती है। केएम, कई मामलों में, बाध्यकारी स्थिरांक के लिए अनुमानित किया जा सकता है। यदि प्रोटीन फ्लोरोसेंट है, तो प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके बाध्यकारी स्थिरांक की गणना की जा सकती है। यदि इन तकनीकों में से कोई भी संभव नहीं है, तो वैद्युतकणसंचलन गतिशीलता शिफ्ट परख (ईएमएसए) का उपयोग किया जा सकता है।

सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ मुख्य समस्या तब उत्पन्न होती है जब क्यूवेट को साफ नहीं किया जाता है या जब अभिकर्मक अशुद्ध होते हैं। यदि बेसलाइन बहुत अधिक है, तो क्यूवेट को साफ करने की सलाह दी जाती है। कई cuvette सफाई समाधान उपलब्ध हैं. 16-24 घंटे के लिए एक पतला एसिड समाधान में cuvettes रखने से भी cuvette को साफ करने में मदद मिलती है। अभिकर्मकों को खरीदने की सलाह दी जाती है जो >95% शुद्ध हैं और डबल-आसुत और ऑटोक्लेव्ड पानी का उपयोग करें। बेसलाइन बहाव एक और संभावित समस्या है। यदि एक दीर्घकालिक प्रयोग कर रहे हैं, तो समय-समय पर बेसलाइन की जांच करने की सलाह दी जाती है। प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का अध्ययन करते समय डीएनए की चोटियां अकेले डीएनए के साथ प्राप्त चोटियों / बैंड के अनुरूप नहीं हो सकती हैं। प्रोटीन चोटियों को आमतौर पर 190 और 230 एनएम के बीच सुदूर यूवी रेंज में देखा जाता है। इसलिए, 250 एनएम से नीचे की चोटियों में प्रोटीन शिखर से हस्तक्षेप हो सकता है और विश्वसनीय जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है। डीएनए अनुक्रम के आधार पर विभिन्न प्रकार के गैर-बी संरचनाओं को अपना सकता है। डीएनए अनुक्रम जितना लंबा होता है, डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के भीतर सह-मौजूद कई संरचनाओं की संभावना उतनी ही अधिक होती है। यह विश्लेषण को मुश्किल बना सकता है। इसलिए, जैव सूचना विज्ञान उपकरणों द्वारा भविष्यवाणी की गई संभावित संरचनाओं के अनुरूप छोटे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।

सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का अन्य प्रमुख दोष यह है कि यह परमाणु-स्तरीय संरचना विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है, और प्राप्त स्पेक्ट्रम केवल व्यवहार्य संरचना की पहचान करने के लिए अपर्याप्त है। उदाहरण के लिए, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और प्रोटीन एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी दोनों परमाणु रिज़ॉल्यूशन डेटा प्रदान करते हैं, जबकि सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी कम विस्तृत संरचनात्मक जानकारी प्रदान करती है। हालांकि, सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी एक तेजी से दृष्टिकोण है जिसके लिए प्रोटीन या काफी डेटा प्रसंस्करण की भारी मात्रा की आवश्यकता नहीं होती है। नतीजतन, सीडी का उपयोग विलायक चर की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए किया जा सकता है जैसे कि तापमान, पीएच, लवणता, और विभिन्न कोफ़ैक्टर्स की उपस्थिति। इसका उपयोग गतिशील प्रणालियों में संरचनात्मक परिवर्तनों (जटिल गठन, तह / खुलासा, तापमान, विकृतियों और अमीनो एसिड अनुक्रम / उत्परिवर्तन में परिवर्तन के कारण विकृतीकरण) की निगरानी के लिए भी किया जा सकता है। इसे स्टॉप-फ्लो उपकरण से जोड़कर, इसका उपयोग प्रोटीन / डीएनए-लिगैंड इंटरैक्शन के कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

अच्छी तरह से विशेषता वाले डीएनए संरूपकों में ए / बी / जेड डीएनए, ट्रिपलेक्स, हेयरपिन और जी-क्वाड्रप्लेक्स शामिल हैं। डीएनए के ये सभी रूप एक खुले डीएनए संरचना से जुड़े होते हैं, यानी, अनवाउंड डीएनए जो नकारात्मक सुपरकोइलिंग के लिए सिंक के रूप में कार्य करता है। प्रतिलेखन नकारात्मक सुपरकोइलिंग के साथ जुड़ा हुआ है क्योंकि एक खुले परिसर का गठन आरएनए पोलीमरेज़ के आंदोलन के लिए एक शर्त है। इसलिए, अधिकांश जीनों के प्रतिलेखन में प्रमोटर क्षेत्र में नकारात्मक सुपरकोइलिंग में वृद्धि शामिल है। अध्ययनों से पता चला है कि न्यूक्लियोसोम खुलासा ए-डीएनए संरचना की ओर जाता है, जो हालांकि, अस्थिर है39। एक संभावना यह है कि ब्याज का प्रोटीन, उदाहरण के लिए, SMARCAL1, ऐसी संरचनाओं को बांधता है और उन्हें स्थिर करता है, इस प्रकार प्रतिलेखन की सुविधा प्रदान करता है, जैसा कि DROSHA प्रमोटरों के मामले में देखा गया है। Guanine quadruplex Guanine tetrads पर आधारित है जो हुगस्टीन हाइड्रोजन बांड द्वारा बाध्य है। सिलिको विश्लेषण में पुष्टि की गई है कि जी 4-बनाने वाले अनुक्रम विशेष रूप से जीन प्रमोटरों के समीपस्थ और प्रतिलेखन शुरू साइटों पर समृद्ध होते हैं। ये G4 अनुक्रम प्रतिलेखन को सक्रिय और दबा सकते हैं।

MYC प्रमोटर 40 के मामले में, जी-क्वाड्रप्लेक्स का गठन एक दमनकारी के रूप में कार्य करता है, जबकि मानव संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) के मामले में, जी-क्वाड्रप्लेक्स संरचना प्रतिलेखन कारकों के लिए डॉकिंग साइट के रूप में कार्य करती है41, इस प्रकार इस जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करती है। SMARCAL1 के मामले में, G-quadruplex संरचना देखी गई थी जब ADAAD ने DGCR8 जोड़ी 7 प्रमोटर अनुक्रमों के साथ बातचीत की थी। जैसा कि इस प्राइमर जोड़ी पर SMARCAL1 और RNAPII के अधिभोग में वृद्धि हुई है, यह परिकल्पना की जाती है कि G-quadruplex का गठन, इस मामले में, इस जीन के प्रतिलेखन सक्रियण के साथ सहसंबंधित है। डीएनए को सकारात्मक रूप से सुपरकॉइल भी किया जा सकता है, और आरएनए पोलीमरेज़ की प्रगति को इसके सामने सकारात्मक सुपरकॉइलिंग उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है। यह प्रतिलेखन-जनित (+) सुपरकोइलिंग सड़क-ब्लॉक प्रोटीन को बाधित या खत्म कर सकता है, डीएनए को आरएनए पोलीमरेज़ के लिए अधिक सुलभ बनाने के लिए न्यूक्लियोसोम संरचनाओं को अस्थिर कर सकता है। एक्स-डीएनए डीएनए की एक संरचना है जो सकारात्मक सुपरकोइलिंग के लिए सिंक के रूप में कार्य करती है। एक्स-डीएनए की हड़ताली विशेषता यह है कि यह जीन के प्रमोटर पर अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से बन सकता है। SMARCAL1 के मामले में, ADAAD ने क्रमशः DICER और DGCR8 प्रमोटरों में एटीपी-निर्भर तरीके से A-X और B-X संक्रमण को प्रेरित किया। विवो डेटा के साथ संयुक्त जहां डॉक्सोरुबिसिन-प्रेरित डीएनए क्षति की उपस्थिति में इन प्रवर्तकों पर SMARCAL1 और RNAPII अधिभोग में वृद्धि हुई थी, यह परिकल्पना की जा सकती है कि एक्स-डीएनए गठन बाधाओं / ब्लॉकों को हटाकर प्रतिलेखन की सुविधा प्रदान करता है। ट्रिपल डीएनए हेलिसेस में एक विशेषता स्पेक्ट्रम नहीं होता है। एमवाईसी प्रमोटर और सिंथेटिक स्टेम-लूप डीएनए में मौजूद डीएनए अनुक्रमों के सीडी स्पेक्ट्रा ने दो सकारात्मक चोटियों को दिखाया- एक 258 एनएम पर 269 एनएम पर कंधे के साथ और डीएनए में 210 एनएम पर एक बड़ी चोटी। इस प्रकार के स्पेक्ट्रम को ट्रिपलेक्स 37 के मामले में प्राप्त किया जा सकता है। ट्रिपलेक्स को खोलना मुश्किल है और इसलिए, ट्रांसक्रिप्शन 42 को ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है। इसलिए, यह परिकल्पना की जाती है कि SMARCAL1 द्वारा c-MYC प्रमोटर में इस संरचना का गठन प्रतिलेखन के दमन की ओर जाता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एटीपी एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन को भी बांधता है। इन प्रोटीनों के हेलिकेस डोमेन के मोटिफ VI में मौजूद संरक्षित आर्जिनिन प्रोटीन 43 के γ-फॉस्फेट के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से बातचीत करता है। एडीएडी के मामले में, प्रोटीन-एटीपी इंटरैक्शन का केडी (1.5 ± 0.1) × 10-6 एम 38 है। एटीपी का बंधन प्रोटीन में एक संरचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करता है जैसे कि डीएनए की आत्मीयता बढ़ जाती है। डीएनए का बंधन भी प्रोटीन में एक संरचना परिवर्तन को प्रेरित करता है जिससे एटीपी 31 के लिए 10 गुना आत्मीयता में वृद्धि होती है। उदाहरण के लिए, ADAAD के मामले में, बैंड / चोटियों को -212 एनएम और -222 एनएम पर देखा जाता है। एटीपी 197 एनएम, +210 एनएम, -222 एनएम, -247 एनएम और -270 एनएम पर भी बैंड देता है। इन्हें लिगैंड की उपस्थिति में डीएनए की "शुद्ध" संरचना प्राप्त करने के लिए डीएनए + एडीएएडी + एटीपी के स्पेक्ट्रा से घटाया जाना चाहिए।

इस प्रकार, यह पेपर एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन की उपस्थिति में डीएनए में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों के अध्ययन के लिए सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी की सुविधा को दर्शाता है। CHIP डेटा के साथ डीएनए संरचना में परिवर्तन ों को सहसंबंधित करने से जांचकर्ताओं को इस बारे में जानकारी प्रदान की जा सकती है कि डीएनए संरूपक प्रतिलेखन को कैसे सक्रिय / दबाते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक सीडी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए उन्नत इंस्ट्रूमेंटेशन रिसर्च फैसिलिटी, जेएनयू को धन्यवाद देना चाहते हैं। वीजे और एडी को सीएसआईआर की एक फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Fisher scientific O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigmaaldrich A2383
CD Quartz Cuvette STARNA 21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer Applied Photophysics Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate SRL 43272
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare 17-0756-01 Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution Hellma 9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase Sigmaaldrich  L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher scientific BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher scientific M33-500
NADH disodium salt Sigmaaldrich 10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt SRL 40083
Potassium Acetate Fisher scientific P178-3
Pyruvate Kinase Sigmaaldrich P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher scientific S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Fisher scientific S369-500
Synergy HT microplate reader BioTek Not available
Tris Base Fisher scientific BP152-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Arya, V., Dutta, A., Muthuswami, R. CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (180), e63147, doi:10.3791/63147 (2022).

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