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Biochemistry

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63147
Automatic Translation
1, 1, 1
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

Summary

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Abstract

La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es un método simple y conveniente para investigar la estructura secundaria y las interacciones de las biomoléculas. Los avances recientes en espectroscopia de CD han permitido el estudio de las interacciones ADN-proteína y la dinámica conformacional del ADN en diferentes microambientes en detalle para una mejor comprensión de la regulación transcripcional in vivo. El área alrededor de una zona de transcripción potencial necesita ser desenrollada para que ocurra la transcripción. Este es un proceso complejo que requiere la coordinación de modificaciones de histonas, la unión del factor de transcripción al ADN y otras actividades de remodelación de la cromatina. Utilizando la espectroscopia de CD, es posible estudiar los cambios conformacionales en la región promotora causados por proteínas reguladoras, como los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, para promover la transcripción. Los cambios conformacionales que ocurren en la proteína también pueden ser monitoreados. Además, las consultas sobre la afinidad de la proteína hacia su ADN objetivo y la especificidad de la secuencia se pueden abordar mediante la incorporación de mutaciones en el ADN objetivo. En resumen, la comprensión única de este método sensible y económico puede predecir cambios en la dinámica de la cromatina, mejorando así la comprensión de la regulación transcripcional.

Introduction

El dicroísmo circular (CD) es una técnica espectroscópica que se basa en la quiralidad inherente de las macromoléculas biológicas que conduce a la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente diestra y zurda. Esta absorción diferencial se conoce como dicroísmo circular. La técnica, por lo tanto, se puede utilizar para delinear la conformación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ADN, que contienen centros quirales1,2.

Las ondas electromagnéticas contienen componentes eléctricos y magnéticos. Tanto el campo eléctrico como el magnético oscilan perpendicularmente a la dirección de propagación de la onda. En el caso de la luz no polarizada, estos campos oscilan en muchas direcciones. Cuando la luz está polarizada circularmente, se obtienen dos campos electromagnéticos a 90° de diferencia de fase entre sí. Las moléculas quirales muestran rotación óptica circular (birrefringencia) tal que absorberán la luz polarizada circularmente diestra y la luz polarizada circularmente zurda en diferentes grados3. El campo eléctrico resultante se trazará como una elipse, una función de la longitud de onda. El espectro de CD se registra, por lo tanto, como elipticidad (q), y los datos se presentan como elipticidad de residuo medio en función de la longitud de onda.

En el caso de las proteínas, el Cα de los aminoácidos (excepto la glicina) es quiral, y este es explotado por espectroscopia de CD para determinar la estructura secundaria de esta macromolécula4. Los espectros de CD de las moléculas de proteínas se registran típicamente en el rango UV lejano. α las proteínas helicoidales tienen dos bandas negativas a 222 nm y 208 nm y un pico positivo a 193 nm4. Las proteínas con estructura secundaria antiparalela de lámina β muestran un pico negativo a 218 nm y un pico positivo a 195 nm4. Las proteínas con estructuras desordenadas muestran baja elipticidad cerca de 210 nm y un pico negativo a 195 nm4. Por lo tanto, los picos / bandas bien definidos para diferentes estructuras secundarias hacen que la EC sea una herramienta conveniente para dilucidar los cambios conformacionales que ocurren en la estructura secundaria de las proteínas durante la desnaturalización, así como la unión al ligando.

Los ácidos nucleicos tienen tres fuentes de quiralidad: la molécula de azúcar, la helicidad de la estructura secundaria y el ordenamiento terciario de largo alcance del ADN en el medio ambiente5,6. Los espectros de CD de los ácidos nucleicos se registran típicamente en el rango de 190 a 300 nm5,6. Cada conformación de ADN, al igual que las proteínas, da un espectro característico, aunque los picos/bandas pueden variar en algunos grados debido a las condiciones de los disolventes y las diferencias en las secuencias de ADN7. El ADN-B, la forma más común, se caracteriza por un pico positivo alrededor de 260-280 nm y un pico negativo alrededor de 245 nm6. Los picos/bandas de ADN en forma de B son generalmente pequeños porque los pares de bases son perpendiculares a la doble hélice, lo que confiere una quiralidad débil a la molécula. El ADN-A da un pico positivo dominante a 260 nm y un pico negativo alrededor de 210 nm6. Z-DNA, la hélice zurda, da una banda negativa a 290 nm y un pico positivo alrededor de 260 nm6. Este ADN también da un pico extremadamente negativo a 205 nm6.

Además de estas conformaciones, el ADN también puede formar tríplex, cuadrúplex y horquillas, todos los cuales se pueden distinguir mediante espectroscopia de CD. El G-quadruplex paralelo da una banda positiva dominante a 260 nm, mientras que el G-quadruplex antiparalelo da una banda negativa a 260 nm y un pico positivo a 290 nm, lo que facilita la distinción entre las dos formas de estructuras cuadrúplex6. Los tríplex no dan un espectro característico8. Por ejemplo, los espectros de un ADN de 36 nucleótidos de largo con el potencial de formar una triple hélice intramolecular que contiene pares de bases G.G.C y T.A.T en presencia de Na+ muestran una fuerte banda negativa a 240 nm y un amplio pico positivo. El amplio pico positivo muestra contribuciones en 266, 273 y 286 nm. El mismo oligonucleótido en presencia de Na+ y Zn+ muestra cuatro bandas negativas (213, 238, 266 y 282 nm) y un pico positivo a 258 nm. Por lo tanto, los espectros del ADN triplex pueden variar dependiendo de las condiciones de sal8.

Además de estas conformaciones, los espectros de CD han permitido la identificación de otra forma de ADN llamada X-DNA. El ADN-X se forma cuando la secuencia de ADN contiene residuos alternativos de adenina y timina. Los espectros CD de X-DNA contienen dos picos negativos a 250 y 280 nm. Se dispone de muy poca información sobre el ADN-X, aunque se ha especulado que funciona como un sumidero para el superboling positivo6,9. Los cambios en los espectros de CD también pueden revelar detalles sobre las interacciones ligando-proteína y, por lo tanto, se han agregado al arsenal de métodos moleculares para detectar interacciones fármaco-proteína10,11,12,13,14. Los espectros de CD también se han utilizado para monitorizar los cambios en la estructura secundaria de las proteínas durante el proceso de plegamiento15. Del mismo modo, los espectros de CD también se pueden utilizar para sondear las interacciones ligando-ADN16,17.

La espectroscopia de CD, por lo tanto, es un método fácil y económico para distinguir entre las diferentes formas de conformación del ADN, siempre que haya acceso a equipos y software no tan económicos. El método es extremadamente sensible y rápido. Solo requiere una pequeña cantidad de ADN, lo que le da una ventaja sobre la técnica alternativa de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Las valoraciones con ligandos y sustratos también son fáciles de realizar. La principal limitación es que el ADN debe ser altamente puro. Es aconsejable utilizar ADN purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

La información obtenida por los espectros de CD se ha utilizado principalmente para deducir las características estructurales de las proteínas y para identificar distintos conformadores de ADN. En este estudio, los espectros de CD se han utilizado para integrar los resultados obtenidos de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) in vivo para delinear si la proteína de interés / factor de transcripción predicho puede provocar un cambio conformacional en la región promotora de sus genes efectores. Esta colaboración ayuda en el progreso de las técnicas espectroscópicas tradicionales de CD al predecir el mecanismo de regulación de la transcripción por el factor de transcripción predicho en y alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de un promotor.

La remodelación de la cromatina es un mecanismo bien definido conocido por regular los procesos metabólicos del ADN al hacer que la cromatina estrechamente empaquetada sea accesible a varios factores reguladores, como factores de transcripción, componentes de replicación del ADN o proteínas de reparación de daños. Los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, también conocidos como la familia de proteínas SWI/SNF, son proteínas remodeladoras clave presentes en las células eucariotas18,19. La agrupación filogenética ha categorizado la familia de proteínas SWI/SNF en 6 subgrupos20: similar a Snf2, similar a Swr1, similar a SSO1653, similar a Rad54, similar a Rad5/16 y distante. SMARCAL1, la proteína de interés en este estudio, pertenece al subgrupo distante20. Esta proteína se ha utilizado para investigar su modo de regulación transcripcional mediante espectroscopia de CD.

Se ha demostrado que la mayoría de los miembros de las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP reposicionan o desalojan nucleosomas o median el intercambio de variantes de histonas de manera dependiente de ATP21,22. Sin embargo, no se ha demostrado que algunos miembros de esta familia remodelen nucleosomas, por ejemplo, SMARCAL1. A pesar de que los estudios han demostrado que SMARCAL1 se asocia con cromosomas de politeno, falta evidencia experimental sobre su capacidad para remodelar nucleosomas23. Por lo tanto, se postuló que SMARCAL1 puede regular la transcripción alterando la conformación del ADN24. La espectroscopia de CD proporcionó un método fácil y accesible para validar esta hipótesis.

SMARCAL1 es una proteína remodeladora de cromatina dependiente de ATP que funciona principalmente como una helicasa de recocido25,26,27. Se ha postulado modular la transcripción mediante la remodelación de la conformación del ADN24. Para probar esta hipótesis, se estudió el papel de SMARCAL1 en la regulación de la transcripción de genes durante el daño al ADN inducido por doxorrubicina. En estos estudios, se utilizó SMARCAL1 para el análisis in vivo y ADAAD para los ensayos in vitro28,29. Estudios previos han demostrado que ADAAD puede reconocer el ADN de una manera dependiente de la estructura pero independiente de la secuencia30,31. La proteína se une de manera óptima a las moléculas de ADN que poseen regiones de transición de doble cadena a una sola cadena, similar al ADN del asa del tallo, e hidroliza ATP 30,31.

Los experimentos in vivo mostraron que SMARCAL1 regula la expresión de MYC, DROSHA, DGCR8 y DICER al unirse a las regiones promotoras28,29. La región de interacción fue identificada por experimentos ChIP28,29. La técnica ChIP se utiliza para analizar la interacción de una proteína con su ADN cognado dentro de la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas, como los factores de transcripción en los promotores u otros sitios de unión al ADN, están unidas a áreas genómicas específicas. La proteína unida al ADN se reticula primero usando formaldehído. Esto es seguido por el aislamiento de la cromatina. La cromatina aislada se cizalla a fragmentos de 500 pb, ya sea por sonicación o digestión de nucleasas, y la proteína unida al ADN se inmunoprecipita utilizando anticuerpos específicos de la proteína. La reticulación se invierte y el ADN se analiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR cuantitativa en tiempo real.

Los resultados de ChIP llevaron a la hipótesis de que SMARCAL1 posiblemente media la regulación transcripcional al inducir un cambio conformacional en las regiones promotoras de estos genes. Se utilizaron el mapeador QGRS y el software Mfold para identificar el potencial de estas regiones promotoras para formar estructuras secundarias28,29. El mapeador QGRS se utiliza para predecir G-quadruplexes32, mientras que Mfold33 analiza la capacidad de una secuencia para formar estructuras secundarias como los bucles de tallo.

Después del análisis de la estructura secundaria, se realizaron más experimentos in vitro con el dominio ATPasa A dependiente del ADN activo (ADAAD) recombinante 6X His-tagged, el homólogo bovino de SMARCAL1, purificado de Escherichia coli34. Los ensayos de ATPasa se realizaron utilizando ADAAD para establecer que las secuencias de ADN identificadas podían actuar como efectores28,29. Finalmente, se realizó espectroscopia de CD para monitorizar los cambios conformacionales inducidos en la molécula de ADN por ADAAD28,29.

Para demostrar que la actividad atpasa de la proteína era esencial para inducir un cambio conformacional en la molécula de ADN, se añadió ácido tetraacético etilendiamina (EDTA) a quelato Mg+2 o neomicina inhibidor del dominio ATPasa A dependiente activo del ADN (ADAADiN), un inhibidor específico de la proteína SWI/SNF35,36 . Esta técnica espectroscópica de CD se puede utilizar con cualquier proteína purificada que haya sido demostrada por ChIP o cualquier otro ensayo relevante para unirse a una región genómica predicha de un promotor.

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Protocol

1. Concentración de trabajo de los componentes de reacción

  1. Preparar las concentraciones de trabajo de tampones para CD y otros componentes de reacción recientemente (ver Tabla 1) y mantenerlas a 4 °C antes de configurar las reacciones.
    NOTA: Para las reacciones de CD descritas en este trabajo, las concentraciones de trabajo de los componentes son las siguientes: Tampón de fosfato de sodio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Actividad atPasa

  1. Antes de la espectroscopia de CD, establezca la actividad ATPasa de la proteína en presencia de las moléculas de ADN para garantizar que la proteína utilizada en la espectroscopia de CD esté activa e identificar las moléculas de ADN que son óptimamente efectivas para provocar hidrólisis de ATP.
  2. Medir la actividad atPasa de la proteína en presencia de diferentes moléculas de ADN mediante un ensayo de oxidación acoplado a NADH que consiste en las siguientes dos reacciones.
    1. Mezcle 0,1 μM de ADAAD, 2 mM de ATP, 10 nM de ADN y 1x tampón REG en una placa de 96 pocillos hasta un volumen final de 250 μL.
      NOTA: La enzima piruvato quinasa utiliza el ADP y el Pi para convertir el fosfoenolpiruvato en piruvato, regenerando así el ATP. Esto asegura que el ATP esté siempre en una concentración saturante en la reacción. En la segunda reacción, el piruvato formado por la acción de la piruvato quinasa se convierte por la lactato deshidrogenasa en lactato. En esta reacción, una molécula de NADH se oxida a NAD+. El consumo de NADH se mide midiendo la absorbancia de la molécula a 340 nm.
    2. Incubar durante 30 min a 37 °C en una incubadora.
    3. Mida la cantidad de NAD+ a 340 nm utilizando un lector de microplacas.
    4. Para medir la cantidad de NAD+, utilice el software proporcionado junto con el lector de microplacas.
      1. Haga clic en el ensayo NADH para medir la absorbancia a 340 nm.
      2. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa en el instrumento. Haga clic en el botón Leer placa para registrar la absorbancia.
        NOTA: La concentración de NAD+ se calcula utilizando el coeficiente de extinción molar de NADH como 6,3 mM−1 utilizando eq (1).
        A = εcl (1)

        Aquí, A = absorbancia
        ε = Coeficiente de extinción molar
        c = Concentración molar
        l = Longitud de la trayectoria óptica en cm

3. Elección y preparación de cubetas de CD

  1. Recopile espectros de CD en cubetas de cuarzo de alta transparencia. Use cubetas rectangulares o cilíndricas.
    NOTA: Se utilizó una cubeta de cuarzo CD (volumen nominal de 0,4 mL, longitud de trayectoria de 1 mm) para todas las reacciones descritas en este documento.
  2. Use una solución de limpieza de cubeta para limpiar la cubeta. Agregue la solución limpiadora de cubeta al 1% en agua para hacer 400 μL de la solución, viértala en la cubeta e incube a 37 ° C durante 1 h.
  3. Lave la cubeta con agua varias veces para limpiar la cubeta. Tome un escaneo del agua o tampón en la cubeta para verificar si está limpia.
    NOTA: El agua o el tampón deben dar una lectura en el rango de 0 a 1 mdeg.

4. Preparación de proteínas y oligonucleótidos de ADN

  1. Mantenga el volumen de la proteína por debajo de 50 μL en la reacción para minimizar las cantidades de los componentes tampón que a veces causan la formación de picos ambiguos. Mantenga la proteína en el hielo durante todo el experimento para evitar cualquier degradación.
  2. Utilice oligonucleótidos de ADN purificados con PAGE en las reacciones.
    NOTA: En las reacciones descritas aquí, el ADN se utilizó tanto en formas nativas como enfriadas por calor (enfriamiento rápido (FC) y enfriamiento lento (SC)). El enfriamiento rápido promueve la unión intramolecular en el ADN, produciendo más estructuras secundarias. Por el contrario, el enfriamiento lento promueve el enlace intermolecular en el ADN, lo que resulta en menos estructuras secundarias.
  3. Para un enfriamiento rápido, caliente el ADN a 94 ° C durante 3 minutos en el bloque de calentamiento e inmediatamente enfríelo en hielo. Para un enfriamiento lento, caliente el ADN a 94 ° C durante 3 minutos y deje que se enfríe a temperatura ambiente a una velocidad de 1 ° C por minuto.

5. Configuración de experimentos de control para registrar los espectros de referencia

  1. Mantenga el volumen de reacción en 300 μL en todas las reacciones. Configure un total de 5 reacciones basales en tubos centrífugos de 1,5 ml, uno por uno, de la siguiente manera: i) Tampón + Agua; ii) Tampón + MgCl2 + ATP + Agua; iii) Tampón + MgCl2 + ATP + Proteína + Agua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampón + Proteína + Agua.

6. Configuración de los experimentos para grabar espectros de CD

  1. Configure un total de 5 reacciones, una por una, en tubos centrífugos de 1,5 ml de la siguiente manera: i) Tampón + ADN + Agua; ii) Tampón + ADN + MgCl2 + ATP + Agua; iii) Tampón + ADN + MgCl2 + ATP + Proteína + Agua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampón + ADN + Proteína + Agua.

7. Escaneo de grabación

  1. Encienda el gas y encienda el espectrómetro de CD.
  2. Encienda la lámpara después de 10-15 min. Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del soporte a 37 °C.
  3. Abra el software del espectro de CD .
    1. Ajuste la temperatura a 37 °C.
    2. Establezca el rango de longitud de onda en 180 - 300 nm.
    3. Establezca el tiempo por punto en 0,5 s.
    4. Establezca el número de escaneo en 5.
    5. Haga clic en Pro-Data Viewer, cree un nuevo archivo y cámbiele el nombre con detalles sobre el experimento y la fecha.
  4. Mantenga todos los componentes de reacción en hielo para evitar cualquier degradación. Hacer las líneas de base y las reacciones, una por una, en tubos de centrífuga y mezclarlas mediante pipeteo. Transfiera la mezcla de reacción a la cubeta con cuidado, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
  5. Si realiza un experimento de curso de tiempo, incube las reacciones a 37 ° C durante el tiempo requerido y realice el escaneo. Agregue EDTA al tampón que contiene el ADN, ATP, Mg + 2 y proteína para detener la hidrólisis de ATP.
  6. Aumentar la concentración de EDTA y su tiempo de incubación para inhibir completamente la actividad de la ATPasa.
  7. Reste las líneas de base de las reacciones correspondientes en el software (por ejemplo, reste la reacción 1 de la línea de base 1). Suavizar los datos en el software de espectro de CD o en el software de trazado de datos. Trazar los datos en el software de trazado de datos.
    NOTA: Restando las líneas de base de las reacciones correspondientes se obtendrán los espectros netos de CD de solo ADN.

8. Análisis e interpretación de datos

  1. Utilice la fórmula dada por eq (2) para convertir los valores obtenidos en milidos en elipticidad media de residuos.
    Equation 1(2)
    Aquí, S es la señal de CD en mil imperios, c es la concentración de ADN en mg/mL, mRw es la masa residual media y l es la longitud de la trayectoria en cm.
  2. Trazar un gráfico contra la longitud de onda y la elipticidad media de los residuos utilizando el software de trazado de datos y analizar los picos.
  3. Para trazar el gráfico, seleccione la elipticidad media del residuo en el eje Y y la longitud de onda en el eje X y trace un gráfico en línea recta.
    NOTA: Este gráfico proporcionará los picos característicos de las diferentes formas de ADN. Las formas de ADN correspondientes a los picos pueden identificarse utilizando la literatura existente6.

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Representative Results

ADAAD estabiliza una estructura similar a un bucle de vástago en el promotor MYC
La evidencia experimental previa mostró que SMARCAL1 es un regulador negativo de MYC29. El análisis de la región promotora larga de 159 pb del gen MYC por el mapeador QGRS mostró que la hebra delantera tenía el potencial de formar un G-quadruplex (Tabla 2). Mfold mostró que ambas hebras del ADN MYC podrían formar una estructura similar a un bucle de tallo (Tabla 2). Se sintetizó una secuencia de ADN de 34 pb de largo que contenía el G-quadruplex (GECE). Las estructuras Mfold de la secuencia hacia adelante y hacia atrás del oligonucleótido GECE se muestran en la Figura 1A,B.

Los ensayos de ATPasa utilizando 6X His-ADAAD mostraron que el GECE de enfriamiento rápido era un mejor efector que las formas nativas y de enfriamiento lento. Por lo tanto, se utilizó GECE de enfriamiento rápido para registrar los espectros de CD en ausencia y presencia de ATP y ADAAD. Los espectros de CD mostraron que ADAAD induce dos picos positivos: uno a 258 nm con un hombro a 269 nm y un pico más grande a 210 nm en el ADN (Figura 1C). También se observó una caída hacia el negativo alrededor de 240 nm. Este espectro fue similar al obtenido cuando se incubó un ADN sintético de asa de tallo, el efector óptimo de ADAAD, con la proteína y ATP (Figura 2A, B). El ADN triplex puede dar un espectro similar37, lo que lleva a la hipótesis de que la proteína podría estar induciendo tal estructura en este caso. El ATP forma un complejo de coordinación con Mg+2, y este catión es esencial para la hidrólisis del ATP. La adición de quelatos de EDTA Mg+2, dando lugar a la inhibición de la hidrólisis de ATP38. Por lo tanto, se agregó EDTA a la mezcla de reacción para comprender si la hidrólisis de ATP por ADAAD era importante para el cambio conformacional. La adición de EDTA a la reacción abroga esta conformación. Los espectros de CD ahora tienen un pico negativo de 210 nm y una amplia banda positiva con picos de 230 y 250 nm (Figura 1C).

La importancia de la actividad de la ATPasa también se confirmó utilizando un mutante muerto en ATPasa de ADAAD. La mutación K241A ocurre en la caja GKT conservada del motivo I, y se ha demostrado previamente que este mutante carece de la capacidad de hidrolizar ATP en presencia de ADN31. La proteína mutante se expresó con una etiqueta GST y se purificó mediante cromatografía de afinidad de glutatión. El cambio conformacional inducido en el ADN de MYC por este mutante fue diferente del inducido por el ADAAD de tipo salvaje. El espectro de CD del ADN MYC en presencia de la proteína mutante poseía un pico positivo de 210 nm y un pico negativo de 260 nm (Figura 1D).

ADAAD induce la forma A de conformación en el promotor de DROSHA
Las regiones promotoras de DROSHA, DGCR8 y DICER también fueron analizadas por el mapeador QGRS y el software Mfold. Tanto QGRS como MFold mostraron que las regiones promotoras poseen el potencial de formar estructuras G-quadruplex y stem-like (Tabla 2). Las estructuras Mfold de los oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás se muestran en la Figura 3A,B. La actividad de la ATPasa mostró que el ADN nativo y enfriado por calor se comportó de manera similar. Por lo tanto, la forma de enfriamiento lento de estas secuencias de ADN se utilizó para los estudios de EC. Los espectros de CD mostraron que ADAAD induce un pico negativo a 210 nm y un pico positivo a 260 nm en el promotor DROSHA (Figura 3C). Este espectro es una característica de A-DNA6.

ADAAD induce la transición B-X y la formación de G-quadruplex en el promotor DGCR8
Las estructuras Mfold de las hebras delantera y inversa de los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Figura 4A,B. Se observó un pico positivo a 210 nm y un pico negativo amplio a 260 nm para dgCR8 par 1 (Figura 4C). Este espectro es característico de la transición B-X6. Las estructuras Mfold de las hebras delantera y inversa de los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Figura 4D,E. Los espectros de CD del par DGCR8 7 mostraron un fuerte pico positivo a 210 y 270 nm y un pico negativo a 250 nm (Figura 4F). Este espectro es característico de las estructuras paralelas de ADN G-quadruplex6.

ADAAD induce la transición A-X en el promotor DICER
Las estructuras Mfold de los oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás se muestran en la Figura 5A,B. Se observó un pico positivo a 210 nm y dos picos negativos, uno a 230 nm y el otro a 260 nm pico, para el par DICER 1 (Figura 5C). Estos picos son característicos de la transición del ADN A-X6,9. Todos los picos de espectros de CD y las formas de ADN que tienen funciones específicas en el proceso de transcripción se han resumido en la Tabla 3.

Figure 1
Figura 1: ADAAD altera la conformación del ADN GECE. Se predijeron estructuras Mfold para la hebra (A) delantera y (B) hebra inversa. (C) Espectros de CD de GECE solo (negro), GECE incubado con ATP y ADAAD antes (rojo) y después de agregar EDTA (azul). (D) Espectros de CD de GECE incubados con ATP y ADAAD marcado con GST antes (negro) y después de agregar EDTA (rojo), así como espectros de CD de GECE incubados con ATP y mutante K241A marcado con GST (azul). Esta cifra se ha modificado de 29. Abreviaturas: ADAAD = Dominio ATPasa A dependiente del ADN activo; CD = dicroísmo circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ADAAD altera la conformación del slDNA. (A) Estructura Mfold predicha para el ADN del asa del tallo. (B) Espectros de CD de slDNA solo (negro), slDNA incubado con ATP y ADAAD (rojo). Esta cifra ha sido modificada a partir de29. Abreviaturas: ADAAD = Dominio ATPasa A dependiente del ADN activo; slDNA = ADN del asa del tallo; CD = dicroísmo circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: ADAAD altera la conformación del ADN del par 5 de DROSHA . Estructura Mfold predicha para la hebra (A) hacia adelante y (B) la hebra inversa. (C) Espectros de CD de DROSHA par 5 ADN solo (negro), DROSHA par 5 ADN incubado con ATP y ADAAD (rojo). Esta cifra ha sido modificada a partir de 28. Abreviaturas: ADAAD = Dominio ATPasa A dependiente del ADN activo; CD = dicroísmo circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: ADAAD altera la conformación del ADN DGCR8 par 1 y 7. Estructuras Mfold predichas para la hebra (A) hacia adelante y (B) la hebra inversa del oligonucleótido DGCR8 par 1. (C) Espectros de CD de DGCR8 par 1 solo (negro), DGCR8 par 1 incubado con ATP y ADAAD (rojo). Estructuras Mfold predichas para la hebra (D) delantera y (E) la hebra inversa del oligonucleótido DGCR8 par 7. (F) Espectros de CD de DGCR8 par 7 solo (negro), DGCR8 par 7 incubado con ATP y ADAAD (rojo). Esta cifra ha sido modificada a partir de 28. Abreviaturas: ADAAD = Dominio ATPasa A dependiente del ADN activo; CD = dicroísmo circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: ADAAD altera la conformación del ADN del par 1 de DICER . Estructura Mfold predicha para la hebra (A) hacia adelante y (B) la hebra inversa del oligonucleótido DICER par 1. (C) Espectros CD del par DICER 1 solo (negro), dicer par 1 incubado con ATP y ADAAD (rojo). Esta cifra ha sido modificada a partir de 28. Abreviaturas: ADAAD = Dominio ATPasa A dependiente del ADN activo; CD = dicroísmo circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5x búfer REG
Componente Concentración de trabajo
Lactato deshidrogenasa (LDH) 50 unidades/ml
Acetato de magnesio (Mg(OAc)2) 30 mM
Fosfoenolpiruvato (PEP) 6,8 mg/ml
Acetato de pottasio (KOAc) 300 mM
Piruvato quinasa (PK) 50 unidades/ml
Acetato de tris (Tris-OAc) 125 metros
β-mercaptoetanol (β-ME) 25 mM

Tabla 1: Componentes del búfer.

Oligonucleótidos Secuencia de avance ΔG (m-Fold) Kcal/mol G-score (mapeador QGRS) Secuencia inversa ΔG kcal/mol (predicción de Mfold) G-score (mapeador QGRS)
slDNA GCGCAATTGCGCTCGA
CGATTTTTTAGCGCAA
TTGCGC		 -16.36 - - - -
MYC GECE CGCGCGCGTGGCGTGG
CGGTGGGCGCGCA
GTGCGTT		 -8.64 19 AACGCACTGCGCGCC
CACCGCCACGCCA
CGCGCG		 -5.74 -
DROSHA Par 5 GGCCAGGCACGGTG
GCTTATGCCTGTAAT
CCCAGCCCTTTGGGA
GGCTGAGGCAGG		 -10.18 19, 19 CCTGCCTCAGCCTCC
CAAAGGGCTGGGATT
ACAGGCATAAGCCAC
CGTGCCTGGCC		 -10.95 -
DGCR8 Par 1 GCCACCGTGCCCGG
CCGAACCACCGTGC
CCGGCCGAACCC		 -7.9 - GGGTTCGGCCGGG
CACGGTGGTTCGG
CCGGGCACGGTGGC		 -9.4 21
DGCR8 Par 7 TCATACTGCCGCTG
GGTTGGGCGGGAG
GCTGCAGCGGGAG		 -7.99 33 TCCCGCTGCAGCCT
CCCGCCCAACCCAG
CGGCAGTATGAC		 -5.43 -
DICER Par 1 AAGTGCTCAGGAG
CCATGTGGGGCTG
GTGGCCCCAAACTG		 -8.82 19 CAGTTTGGGGCCAC
CAGCCCCACATGGC
TCCTGAGCACTT		 -9.16 -

Tabla 2: Secuencias de oligonucleótidos. Todas las secuencias están en la dirección 5'-3'. Abreviaturas: slDNA = ADN de asa del tallo.

Oligonucleótidos Picos de espectros de CD en nm (después de incubar con ATP y ADAAD) Forma del ADN Papel en la transcripción
slDNA +215, +250, +272 Ternario Represión
MYC GECE +210, +258, +269 Ternario Represión
DROSHA Par 5 -210, +260 ADN A Iniciación/Activación
DGCR8 Par 1 +210,-260 Transición B-X Superbobinado positivo/Activación
DGCR8 Par 7 +210, -250, +270 G-quadruplex Activación
DICER Par 1 +210, -230, -257 Transición A-X Superbobinado positivo/Activación

Tabla 3: Pico de espectros de CD correspondiente a diferentes formas de ADN con su papel en la transcripción. Abreviaturas: ADAAD = Dominio ATPasa A dependiente del ADN activo; CD = dicroísmo circular.

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Discussion

El propósito de este artículo es introducir la técnica de espectroscopia de CD como un enfoque para estudiar los cambios conformacionales que ocurren en el ADN en presencia de proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP y vincular estos cambios conformacionales a la expresión génica. La espectroscopia de CD proporciona un método rápido y de fácil acceso para estudiar los cambios conformacionales en el ADN.

Un punto crucial a considerar para esta técnica es la pureza del ADN y la proteína. Es recomendable asegurarse de que tanto el ADN como la proteína sean >95% puros. Los oligonucleótidos purificados con PAGE deben usarse en el ensayo, y la proteína debe purificarse preferiblemente con afinidad para >95% de pureza. El otro parámetro crítico es que la cubeta debe estar limpia de tal manera que la lectura basal no exceda 1 mdeg. Los tampones deben hacerse con agua en autoclave, y la lectura de referencia del tampón no debe exceder 1 mdeg. Para estudiar la conformación del promotor, es esencial identificar las regiones donde se une la proteína. Por lo tanto, es recomendable realizar experimentos ChIP utilizando la proteína de interés, ya que este proceso ayuda a identificar secuencias de ADN presentes en la región promotora del gen efector unido por la proteína. Una vez que se identifica la región, la capacidad de la secuencia para adoptar estructuras específicas se puede analizar utilizando las herramientas bioinformáticas disponibles. Esto es importante ya que los cebadores ChIP suelen tener 200 pb de largo y pueden tener múltiples conformaciones. Por lo tanto, el uso de herramientas bioinformáticas para identificar las estructuras ayudaría a acortar la longitud del oligonucleótido a una estructura.

Finalmente, si la proteína de interés es una proteína remodeladora de cromatina dependiente de ATP, la capacidad de los oligonucleótidos para actuar como efector debe verificarse mediante ensayos de ATPasa. Tanto en la espectroscopia de CD como en los ensayos de ATPasa, se debe tener cuidado para garantizar que se utilicen concentraciones saturantes de ligandos en la reacción. Si es posible, la constante de disociación (Kd) para la interacción proteína-ligando debe calcularse antes de proceder con la espectroscopia de CD. Existen numerosos métodos disponibles para calcular el parámetro de enlace. Usando ensayos de ATPasa, la constante de Michaelis-Menten (KM) se puede calcular titulando las concentraciones crecientes de ADN. El KM, en muchos casos, se puede aproximar a la constante de enlace. Si la proteína es fluorescente, las constantes de unión se pueden calcular mediante espectroscopia de fluorescencia. Si ninguna de estas técnicas es factible, se puede utilizar el ensayo de cambio de movilidad por electroforesis (EMSA).

El principal problema con la espectroscopia de CD surge cuando las cubetas no se limpian o cuando los reactivos son impuros. Si la línea de base es demasiado alta, es recomendable limpiar las cubetas. Numerosas soluciones de limpieza de cubetas están disponibles. Colocar las cubetas en una solución ácida diluida durante 16-24 h también ayuda a limpiar la cubeta. Es recomendable comprar reactivos que sean >95% puros y utilizar agua doble destilada y en autoclave. La deriva de referencia es otro problema potencial. Si se realiza un experimento a largo plazo, es aconsejable verificar periódicamente la línea de base. Los picos de ADN al estudiar las interacciones proteína-ADN pueden no corresponder exactamente a los picos / bandas obtenidos con ADN solo. Los picos de proteínas generalmente se observan en el rango UV lejano entre 190 y 230 nm. Por lo tanto, los picos por debajo de 250 nm pueden tener interferencia del pico de proteína y podrían no proporcionar información confiable. El ADN puede adoptar una variedad de conformaciones no B dependiendo de la secuencia. Cuanto más larga sea la secuencia de ADN, mayor será la probabilidad de que coexistan múltiples conformaciones dentro del oligonucleótido de ADN. Esto puede dificultar el análisis. Por lo tanto, es aconsejable utilizar oligonucleótidos más cortos correspondientes a las estructuras potenciales predichas por las herramientas bioinformáticas.

El otro gran inconveniente de la espectroscopia de CD es que no permite el análisis de la estructura a nivel atómico, y el espectro obtenido es insuficiente para identificar la única estructura viable. Por ejemplo, tanto la cristalografía de rayos X como la espectroscopia de RMN de proteínas proporcionan datos de resolución atómica, mientras que la espectroscopia de CD proporciona información estructural menos detallada. Sin embargo, la espectroscopia de CD es un enfoque rápido que no requiere grandes cantidades de proteínas o un procesamiento de datos considerable. Como resultado, la EC se puede utilizar para investigar una amplia gama de variables de disolventes, como la temperatura, el pH, la salinidad y la presencia de varios cofactores. También se puede utilizar para monitorear cambios estructurales (debido a la formación de complejos, plegamiento / despliegue, desnaturalización debido a la temperatura, desnaturalizantes y cambios en la secuencia / mutación de aminoácidos) en sistemas dinámicos. Al conectarlo al aparato de flujo de parada, también se puede utilizar para estudiar la cinética de las interacciones proteína/ADN-ligando.

Los conformadores de ADN bien caracterizados incluyen ADN A / B / Z, triplex, horquilla y G-quadruplexes. Todas estas formas de ADN están asociadas con una conformación abierta del ADN, es decir, ADN desenrollado que sirve como sumidero para el superbol negativo. La transcripción se asocia con el superbrollo negativo, ya que la formación de un complejo abierto es un requisito previo para el movimiento de la ARN polimerasa. Por lo tanto, la transcripción de la mayoría de los genes implica un aumento del superboil negativo en la región promotora. Los estudios han demostrado que el despliegue de nucleosomas conduce a la conformación del ADN-A, que, sin embargo, es inestable39. Una posibilidad es que la proteína de interés, por ejemplo, SMARCAL1, se una a tales estructuras y las estabilice, facilitando así la transcripción, como se ve en el caso de los promotores de DROSHA . El cuadrúplex de guanina se basa en tétradas de guanina unidas por enlaces de hidrógeno de Hoogsteen. El análisis in silico ha confirmado que las secuencias formadoras de G4 están notablemente enriquecidas proximal a los promotores de genes y en los sitios de inicio de la transcripción. Estas secuencias G4 pueden activar y reprimir la transcripción.

En el caso del promotor MYC40, la formación de G-quadruplex actúa como represor, mientras que en el caso del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), la estructura G-quadruplex funciona como un sitio de acoplamiento para factores de transcripción41, activando así la expresión de este gen. En el caso de SMARCAL1, se observó la estructura G-quadruplex cuando ADAAD interactuó con secuencias promotoras DGCR8 par 7. A medida que la ocupación de SMARCAL1 y RNAPII aumentó en este par de cebadores, se plantea la hipótesis de que la formación de G-quadruplex, en este caso, se correlaciona con la activación de la transcripción de este gen. El ADN también puede ser superenrollado positivamente, y se sabe que el progreso de la ARN polimerasa genera una superbobina positiva frente a él. Este superenrollo generado por la transcripción (+) puede interrumpir o eliminar las proteínas de bloqueo de carretera, desestabilizando las estructuras de los nucleosomas para hacer que el ADN sea más accesible a la ARN polimerasa. El ADN-X es una conformación de ADN que actúa como sumideros para el superbrollo positivo. La característica sorprendente de un X-DNA es que puede formarse de una manera específica de la secuencia en el promotor de un gen. En el caso de SMARCAL1, ADAAD indujo transiciones A-X y B-X de manera dependiente de ATP en los promotores DICER y DGCR8, respectivamente. Combinado con datos in vivo donde se encontró una mayor ocupación de SMARCAL1 y RNAPII en estos promotores en presencia de daño en el ADN inducido por doxorrubicina, se puede plantear la hipótesis de que la formación de ADN X facilita la transcripción al eliminar barreras / bloqueos. Las hélices de ADN triple no tienen un espectro característico. Los espectros de CD de las secuencias de ADN presentes en el promotor MYC y el ADN sintético del asa del tallo mostraron dos picos positivos: uno a 258 nm con un hombro a 269 nm y un pico más grande a 210 nm en el ADN. Este tipo de espectro se puede obtener en el caso de los tríplex37. Los tríplex son difíciles de desenrollar y, por lo tanto, se sabe que bloquean la transcripción42. Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la formación de esta estructura en el promotor c-MYC por SMARCAL1 conduce a la represión de la transcripción.

Cabe señalar que el ATP también se une a las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP. La arginina conservada presente en el motivo VI del dominio helicasa de estas proteínas interactúa a través de interacciones electrostáticas con el γ-fosfato de la proteína43. En el caso de ADAAD, el Kd de la interacción proteína-ATP es (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. La unión de ATP induce un cambio conformacional en la proteína tal que aumenta la afinidad del ADN. La unión del ADN también induce un cambio de conformación en la proteína que conduce a una mayor afinidad de 10 veces por ATP31. Por ejemplo, en el caso de ADAAD, las bandas/picos se observan a -212 nm y -222 nm. ATP también da bandas a 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm y -270 nm. Estos deben restarse de los espectros de ADN + ADAAD + ATP para obtener la conformación "neta" del ADN en presencia de los ligandos.

Por lo tanto, este artículo muestra la conveniencia de la espectroscopia de CD para el estudio de los cambios conformacionales que ocurren en el ADN en presencia de proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP. La correlación de los cambios en la conformación del ADN con los datos de ChIP puede proporcionar a los investigadores información sobre cómo los conformadores de ADN activan / reprimen la transcripción.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, por el espectrofotómetro CD. V.J. y A.D. fueron apoyados por una beca de CSIR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Fisher scientific O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigmaaldrich A2383
CD Quartz Cuvette STARNA 21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer Applied Photophysics Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate SRL 43272
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare 17-0756-01 Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution Hellma 9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase Sigmaaldrich  L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher scientific BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher scientific M33-500
NADH disodium salt Sigmaaldrich 10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt SRL 40083
Potassium Acetate Fisher scientific P178-3
Pyruvate Kinase Sigmaaldrich P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher scientific S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Fisher scientific S369-500
Synergy HT microplate reader BioTek Not available
Tris Base Fisher scientific BP152-500

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Bioquímica Número 180 espectroscopia de CD remodelación de cromatina dependiente de ATP interacción ADN-proteína dinámica de la cromatina remodelación de la cromatina regulación transcripcional
Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína
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