Summary
Protokol, portal ven perfüzyonu yoluyla metabolik çalışmalar için sağlam bir fare karaciğerini rezeke etmenin basit bir yöntemini açıklar.
Abstract
Diyabet, pre-diyabet, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ve alkolsüz steatohepatit (NASH) gibi metabolik hastalıklar giderek yaygınlaşmaktadır. Ex vivo karaciğer perfüzyonları, titizlikle kontrol edilebilen beslenme koşullarında nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanarak karaciğer metabolizmasının kapsamlı bir analizine izin verir. Siliko simülasyonları, hormon eylemlerini ve farmasötik müdahalenin etkilerini değerlendirmenin birincil teorik bir aracı olmaya devam ettiğinden, perfüze edilmiş karaciğer, hepatik metabolizmayı anlamak için en değerli test yataklarından biri olmaya devam etmektedir. Bu çalışmalar hepatik fizyolojiye ilişkin temel anlayışlara rehberlik ettiğinden, sonuçlar doğru ve tekrarlanabilir olmalıdır. Ex vivo hepatik perfüzyonun tekrarlanabilirliğinde en büyük faktör cerrahinin kalitesidir. Bu nedenle, in situ NMR deneyleri bağlamında ex vivo fare karaciğer perfüzyonlarını gerçekleştirmek için organize ve kolaylaştırılmış bir yöntem sunduk. Ayrıca benzersiz bir uygulamayı tanımlıyoruz ve bu çalışmalarda karşılaşılan ortak sorunları tartışıyoruz. Genel amaç, in situ NMR deneyleri bağlamında hepatik rezeksiyonlarda ve perfüzyonlarda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için altın standart olarak gördüğümüz birkaç yıl boyunca rafine ettiğimiz bir tekniğe karmaşık olmayan bir rehber sağlamaktır. Mıknatıs için alanın merkezine olan mesafe ve NMR deneyi sırasında dokunun müdahaleye erişilememesi, yöntemlerimizi yeni kılmaktadır.
Introduction
Ex vivo perfüzyonlar hepatik metabolizma çalışmasında çok önemlidir ve portal ven yoluyla perfüzyon bu çalışmalar için standarttır. Hepatik metabolizmayı izole olarak incelemek için, diğer organlardaki metabolizmadan (yani tüm vücut metabolizması) kaynaklanan komplikasyonları önlemek ve hormon mevcudiyeti (insülin, glukagon vb.) üzerinde kontrol sağlamak için karaciğer vücuttan rezeke edilmelidir. Bu yaklaşım, diyabet, NAFLD ve NASH gibi hastalıkların hepatik metabolizma üzerindeki etkilerini ve ilaç etki mekanizmalarını anlamak için gerekli olabilir. Bu makale hepatik rezeksiyon ve perfüzyon için bir rehber niteliğindedir. Bu metabolik karaciğer çalışmalarını yeterli titizlik ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmek için kolaylaştırılmış bir prosedür geliştirdik. Ameliyat doğru yapılmazsa, elde edilen metabolik verilerde belirgin değişkenlik vardır. Literatür 1,2,3,4,5'te tanımlandığı gibi, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrometresinde in situ metabolik çalışmalar bağlamında portal ven kateterizasyonu ve karaciğer rezeksiyonu yapmak için organize bir yöntem tanımladık.
Şu anda, bir NMR içinde bir cam sütun kullanılarak ex vivo hepatik perfüzyonu tanımlayan bir literatür yoktur. Ayrıca, prosedürün fare karaciğeri ile nasıl gerçekleştirileceğine dair net bir örnek sunan, özellikle portal venin nasıl kateterize edileceğini, bir karaciğerin nasıl rezeke edileceğini, aktarılacağını ve karaciğerin bir cam sütuna nasıl asılacağını gösteren bir video veya metin yayını da yoktur. Genetiği değiştirilmiş fare, karaciğer metabolizmasını incelemek için her yerde kullanıldığından, bu tam bir açıklamayı hak eden önemli bir prosedürdür. Karaciğer perfüzyon ameliyatları yeni değildir, ancak bu makale, bu prosedürle ilgilenen herkese yardımcı olmak için bu makalede açıklanan teknik mükemmelliği gösteren bir video eşliğinde altın standart bir yöntemdir. Burada sunulan yöntem, hastalık modellerinde metabolitlerin işlevini ve döngüsünü tespit etmek için gerçek zamanlı metabolizmaya en iyi şekilde uygulanacaktır.
Bu yöntem, karaciğerin bir NMR tüpü içinde perfüzyonla kapsüllenmiş kanülün dibinde asılı kalmasını sağlayan 100 cm'lik su ceketli bir cam sütun kullanır. Cam ceket içindeki ısıtılmış su, perfüzyon sıcaklığını kontrol etmek için kullanılır. İnce tabakalı bir oksijenatör, pH kontrolü için% 95 / % 5 O 2 / CO2 ile basınçlandırılır. Üç ayrı pompa kullanılarak, karaciğere sabit basınç sağlayan perfüzyon kolon yüksekliği ayarlanır. Akış hızları, sabit basınç uygulamasının ötesinde kontrol edilmez (Şekil 1). Karaciğerin uygun şekilde çalıştığını doğrulamak için, oksijen ölçümleri akış hızları ile birlikte alınır. Ellerimizde, bu ön koşullar kümesi, karaciğer metabolik fonksiyonunun değerlendirilmesi için oldukça tekrarlanabilir NMR deneylerine yol açmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareleri içeren deneyler, Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol numarası #201909320) ile uyumlu olarak ele alınmıştır. Kullanılan fare suşu C57BL/6J idi; tüm fareler erkekti. Bu yöntem genellikle diğer standart fare suşlarını kullanan çalışmalar için de geçerlidir. Bu ameliyat, birlikte çalışan iki kişi tarafından en uygun şekilde gerçekleştirilir.
1. İlk kurulum
- Krebs-Henseleit elektrolitleri 6 (25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM her biri MgSO4, KH 2 PO4 ve 0.5 mM sodyum-EDTA,1.25mM CaCl2),6 mM sodyum laktat, 0.6 mM sodyum piruvat, 0.2 mM [U-13 C] sodyum propiyonat, % 10(v / v) D2O, ve 0.63 mM karışık yağ asitleri (palmitik asit (toplamın% 22.1'i), palmitoleik asit (% 5.2), stearik asit (% 2.7), oleik asit (% 27), linoleik asit (% 37.7), γ-linolenik asit (% 2.4) ve dekosaheksanoik asit (% 2.8) içeren) ile birlikte% 2 (w / v) sığır serum albümini içerir. HCl (ve gerekirse NaOH) kullanarak perfüzyonatın nihai pH'ını 7.3'e ayarlayın.
2. Ameliyat öncesi kurulum
- 19.05 mm uzunluğunda 23G iğneli iki adet 1 mL şırınga monte edin. Bir şırıngayı 0,01 mL 1000 ünite/mL heparin ve 0,19 mL tuzlu su (%0,9 (w/v) NaCl ile suda doldurun; Tablo 1).
- İkinci şırıngayı 0.2 mL% 2 lidokain ve% 0.6 mL% 0.9 salin ile doldurun (Tablo 1). 27 G 38.1 mm iğneli başka bir 1 mL şırıngada, perfüzyonla doldurun ve 37 ° C'de muhafaza edin.
3. Sütun kurulumunu karıştırın
- 500 mL perfüzyon içeren cam şişeyi su banyosuna yerleştirin (Şekil 1B). Su banyosunu açın ve sıcaklığı ~ 42 ° C'ye ayarlayın. Su banyosundaki yüksek sıcaklık, perfüzyon kolonunda 37 °C'nin korunmasını sağlar.
- Su 42 °C'ye kadar ısındığında, şişedeki perfüzyonu ince film oksijenatörü ve su ceketli 100 cm'lik cam sütun boyunca dolaştırmak için iki pompayı açın (Şekil 1A-E).
- Oksijenatör7'yi basınçlandırmak için oksijenlendirici gazı (%95 oksijen ve %5 karbondioksit) açın (Şekil 1C). Kateter takılıyken 8 mL/dak debi elde etmek için perfüzyon kolon yüksekliğini ayarlayın (akış hızı ölçümü için adım 9'a bakın)5,8,9.
NOT: Akış hızı, perfüzyonun karaciğer tarafından atıldığı hızı ifade eder.
4. Farenin anestezi altına alınması
- IACUC protokolü ve diğer uygun güvenlik yönergelerinin gerektirdiği şekilde KKD'yi donlayın.
NOT: Aşağıdaki adımlar 9-13 haftalık fareler için optimize edilmiştir. - Fareyi izofluran odasına yerleştirin. Dağıtım gazını% 100 oksijene, 1 L / dak akış hızına ve izofluranı% 2'ye10'a çevirin. Nefes yavaşlayana ve sabit olana kadar bekleyin.
NOT: Farenin sabit bir cerrahi düzleme ulaşması için, yavaş ve sabit bir solunum hızı ve ayak parmağı sıkışma refleksi eksikliği ile kanıtlandığı gibi, oksijen akış hızı ~ 1.5 L / dak ila ~ 3 L / dak'ya ve izofluran konsantrasyonu% 1 - 3 arasında ayarlanabilir. Taşıyıcı gaz ve izofluran konsantrasyonunun veriliş hızı, hayvanın yaşına ve ağırlığına ve gürültü ve ışık gibi faktörlere bağlıdır. - Karnı% 70 alkolle dezenfekte edin. Heparini abdominal yağ tabakasına derin bir deri altı enjeksiyonu ile uygulayın (Şekil 2). Fareyi 10 dakika boyunca anestezi odasına geri yerleştirin.
NOT: Bu prosedür terminal olduğu için tıraş gerekli değildir.
5. Selyotomi
- Fareyi anestezi odasından ameliyat platformuna aktarın ve sırtüstü pozisyona yerleştirin (Şekil 3).
- Farenin burnunu bir burun konisine yerleştirin ve pençeleri aşağı doğru bantlayın. Boyna boğulmaya yol açabilecek herhangi bir gerginlik uygulamamaya dikkat edin.
- Lidokaini, anterior iliak krest bölgesi11'e bilateral subkutan enjeksiyon yoluyla uygulayın (Şekil 3). Tüm ağrı reflekslerinin yokluğunu doğrulamak için bir ayak parmağı sıkışma testi yapın.
- İç organları açığa çıkarmak için çöliyotomi yapın (Şekil 4). 3 cm genişliğinde bir kesi yapın (farenin tüm karnının genişliği).
NOT: Genişlik, farenin yaşına ve diyetine göre değişecektir. - Ksifoid süreci sıkıştırarak traksiyonu çeken bir hemostat kullanarak insizyonu genişletin (Şekil 4).
6. Portal venin kanülasyonu
- Portal damarı kaplayan ince ve kalın bağırsakları temizlemek için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Portal venin kemerinin altına karaciğere proksimal olarak ipek bir sütür yerleştirin (Şekil 4A).
- Anatomik yapıya bağlı olarak, ikinci ipek sütürü karaciğerden inferior mezenterik ven distalinin proksimal veya distalini yerleştirin (Şekil 4A)12,13. Her iki dikiş için de 2-0 dikiş kullanın.
- Dikişler yerine oturduğunda, portal veni 22G kateter14 ile kanüle edin (Şekil 4B). Kateteri yerleştirirken, eğimi sivri tutun. Portal damarına en fazla 15° açı ile girin.
- Kateter tapperinden geçen ilk dikişi bağlayın. Portal ven kanüle edildikten sonra kateteri portal venin dalından 2-3 mm distal olarak ipek dikiş ile sabitleyin (Şekil 4B).
NOT: Asistan, kateterin yerinden çıkmasını veya portal venin yırtılmasını önlemek için omuzlarını ve bileklerini yuvarlamalıdır. Her dikiş iki düğüm gerektirir. - Daha sonra, kateterin alt kısmını ikinci dikişle sabitleyin. Cerrahi asistanın yardımıyla, kateteri portal venin distal kısmına ve çevresindeki dokuya sabitlemek için dikişle bir düğüm bağlayın.
7. Portal ven kanülasyonu sonrası karaciğer rezeksiyonu
- Kateter sabitlendikten sonra, kan ve hava kabarcıklarını temizlemek için kateterin içine 38.1 mm uzunluğunda 27G iğneli 1 mL'lik bir şırınga yerleştirin.
NOT: Genellikle kateterden basınçtan kan geri akışı vardır. - Perfüzyon kolonunu (Şekil 1A) kateterle eşleştirmek için sabit bir stopcock ile 1 mm ID. x 5 mm O.D. silikon tüp kullanın ve tamponun perfüzyonun başlangıcını işaretleyen karaciğere akışına izin verin. Perfüzyonun başlangıcını işaretlemek için bu noktada bir zamanlayıcı başlatın.
- İnferior vena kavaya makas kullanarak bir kesi yaparak artan vasküler basıncı hafifletin.
- Karaciğer rengindeki homojen değişimi pembe / kırmızıdan soluk sarıya doğru gözlemleyerek karaciğerden perfüzyon akışını onaylayın. Akış onaylandıktan sonra, mideyi, ince bağırsağı, kalın bağırsağı ve sağ böbreği çevreleyen dokudan çıkarın.
- Cerrahi asistanın yardımıyla, cerrah karaciğeri rezeke etmek için parietal periton ve torasik dokuyu keserken karaciğeri karın ve göğüs boşluğu etrafında manevra yapın.
- Son olarak, karaciğeri yukarı doğru kaldırın ve karaciğeri makasla yerinde tutan kalan bağ dokularını kesin. Görüş kolaylığı için karaciğeri yavaşça manipüle edin. Karaciğere yapışan kürkleri, NMR tüpü içinde kapsüllemeden önce perfüzyonla durulayarak çıkarın.
NOT: Bu prosedürde sadece karaciğer çıkarılır. Diğer tüm organlar hayvanın vücudunda bırakılır. Safra kanalı, deneyin protokolüne göre çıkarılabilir. Bu deney için olmasına rağmen, yerinde bırakıldı.
8. Karaciğeri kolondan asmak
- Cerrah karaciğeri ve tüpü asistana verdiğinde, asistan tüpün kateter ve kolondan bağlantısını keser.
- Kateterin üstünde bir menisküs oluşana kadar kateteri perfüzyonla doldurun. Kateteri karaciğerin asılması ve perfüzyonu için kolona takın.
NOT: Kateter üzerindeki perfüzyon boncuğu, karaciğerin bağlanana kadar çalışması için yeterli hacim sağlar. Karaciğere bağlı kateter, kolonun dibine takılarak preslenir. - Karaciğeri kapsüllemek için 100 cm'lik cam kolona 20 mm'lik bir NMR tüpü vidalayın (Şekil 5). Karaciğer ve portal venin burulmasını önlemek için, NMR tüpünü yavaşça vidalayın. Burulma meydana gelirse ve akış durdurulursa, NMR tüpünü sökün ve yeniden vidalayın. Bu, tıkanıklığı giderecek ve akış geri dönecektir.
- Çalışmanın ayrıntılarına dayanarak karaciğeri 30-60 dakika boyunca perfüze edin.
NOT: Zaman, perfüzyon deneyine dayanmaktadır. Bu deney için, metabolik ciro 30 dakika içinde ölçüldü. Karaciğer perfüzyonunun sabit bir duruma ulaşması 10 dakika kadar sürebilir. Kararlı duruma geçme zamanı, inferior vena kava kesildikten ve hepatik akış sağlandıktan sonra başlar.
9. Akış ölçümü
- Bir tartım teknesini üstten yüklemeli bir teraziye yerleştirin ve teraziyi sıfırlayın. Boruyu, NMR'den eferentat çeken makaralı pompadan tartım teknesine yerleştirin ve zamanlayıcıyı çalıştırın.
- Karaciğerin akış hızını veren 1 dakikadan fazla biriken sıvı kütlesini tartın. Tüpü tekrar atık/toplama kabına yerleştirin.
10. Oksijen Ölçümü
NOT: Oksijen sayacı ölçümleri üreticinin talimatlarına göre ayarlanmıştır15.
- Platin kubbeye 20 μL% 50 KCl doymuş çözelti içeren elektrodu yerleştirin ve elektrotun alt platin halkasının etrafına beş adet 10 μL damla yerleştirin.
- Yapıştırıcıyı sigara kağıdından çıkarın. Sigara kağıdının üzerine bir parça politetrafloroetilen membran koyun.
- İki parçayı elektrotun üzerine yerleştirin. Elektrotun üst kısmına küçük bir O-ring takın. Kağıdı, elektrot üzerindeki alt platin halkaya düz bir şekilde yerleştirmek için kesin.
NOT: Bazı çıkıntılar kabul edilebilir. Elektrotun gümüşünü örtmek çok önemlidir. - Daha büyük O-ringi elektrot üzerine yerleştirin. Elektrodu su odasına takın ve elektrodu yerinde tutmak için tabanı sıkın. Su banyosunu açın ve 37 ° C'ye kadar ısınmaya bırakın.
- Açık oksijen ölçer yazılımı. Havaya Doymuş Su > Kalibre Et'e tıklayın. Karıştırıcı hızını 75'e ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
- 50 mL'lik bir şişeyi yarıya kadar suyla doldurun ve 2 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Bu havaya doymuş sudur,% 100 standart olarak kullanın. Oksijen ölçer haznesini ~ 2 mL su ile doldurun ve iki parçalı tıpayı üzerine yerleştirin.
- Ekranda Tamam'a tıklayın ve sinyalin plato yapmasına izin verin. Sinyal bir platoya ulaştığında, Tamam'ı tıklayın. Sıvıyı odaya atın ve kağıt mendille kurulayın.
- 10.6-10.7 arasındaki adımları tekrarlayın, ancak 200 mM sodyum sülfit (% 0 standart) ile. Kalibrasyonu kaydet'e tıklayın.
NOT: %0 standardı için kuvvetli bir sarsıntı gerekmez. - Perfüzyon sırasında iki adet 5 mL şırınga kullanın. Dolaşımdaki perfüzyonat (oksijen girişi) için bir şırınga ve ikincisi NMR tüpünden efferent perfüzyonat (oksijen çıkışı) için.
- Hem giriş hem de çıkış ölçümleri için perfüzyon hazırlarken, her seferinde 3-4 mL çizin.
NOT: Bu sütun, karaciğerden akan perfüzyonu geri çekmek için NMR tüpüne erişime izin veren cam boruya sahiptir. - Dolaşımdaki perfüzyonu ölçün, önce adım 10.6'daki su gibi ve adım 10.7'de atın. Efferent perfüzyon için aynı adımları tekrarlayın.
- Her 10 dakikada bir oksijen ölçümleri yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karaciğer fonksiyonu öncelikle oksijen tüketimi ve akış hızı ile değerlendirilir. 4-8 mL/dak akış hızı ve 1 μmol/min.g oksijen tüketimi tipiktir. Bu önlemler, belirli deneysel koşullara ve biyolojik farklılıklara bağlı olarak değişecektir.
Kullanılan izofluran'ın tam miktarı, kullanılan anestezi sisteminin tipine, farenin ortamına ve yaşına / ağırlığına bağlı olacaktır. Ameliyat sırasında, izofluran ve dağıtım gazı değişmez, ancak cerrahi alanın özelliklerine bağlı olarak bazı değişiklikler gerekebilir (örneğin, arka plan gürültüsü)10. Heparin deri altından derin enjekte edildiğinde, etkinin başlangıcı 20-40 dakikaya kadar gecikebilir. Heparin sonrası 10 dakikalık bir bekleme süresi, eylemin başlamasını sağlar16. Lidokainin 2 dakikalık bir eylem başlangıcı vardır11.
Kateteri yerleştirirken, eğimi yukarı doğru tutun ve portal damardan en fazla 15 ° açıyla girin. Her iki dikişin de iki düğümü vardır. İlk dikiş kateter tapperinden geçirilmelidir. Portal venin kanülasyonu başarılı olursa, karaciğer flush'tan ağarır. Cerrah karaciğeri rezeke ederken, asistan rezeke edilen içeriği pamuk uçlu bir aplikatör ile temizler. Karaciğerin kirlenmesini önlemek ve loblara çentik takılmasını önlemek için mideyi kesmeyin. Portal venin yerinden çıkmasını veya yırtılmasını önlemek için kateteri tutarken portal ven veya karaciğere çok fazla gerginlik uygulamayın.
Perfüzyon donanım kurulumu, ayrıntılara büyük özen gösterilmesini gerektirir (Şekil 1). Heparin enjeksiyonları (Şekil 2) deney için gereklidir. Kan pıhtılaşırsa, portal ven içine yerleştirilen kateteri tıkayarak akışı önler. Lidokain enjeksiyonu (Şekil 3), ağrı kesici alanın duyarsızlaştırılmasına yardımcı olmaktır. Tablo 1 , salin ile heparin ve lidokain için basit bir dozaj çizelgesi sunmaktadır. Çöliyotomi ve dikiş (Şekil 4) başarılı bir portal ven kateterizasyonu, karaciğer rezeksiyonu ve perfüzyon donatına başarılı bir transfer için gereklidir. Akış hızı ve oksijen tüketimi ölçümleri, karaciğerin sağlığını ve işlevini izlemek için hayati öneme sahiptir (Şekil 6). Beslenen ve oruç tutan karaciğerler arasındakiO2 tüketiminde genellikle hafif bir fark vardır, bu da oruç tutan karaciğerde glukoneogenez tarafından dayatılan artan enerji taleplerine atfedilir.
Şekil 1. Perfüzyon kolon ve pompalar. A. Karaciğerin dibinde asılı olduğu 100 cm'lik su ceketli cam sütun. B. Su pompası, suyu cam kolondan geçirir ve perfüzyonu ısıtır. C. Cam ince tabakalı oksijenatör, perfüzyonu oksijenlendiren% 95 / 5% O2 / CO2 ile basınçlandırılır. D. Bilyalı yataklı pompa, su banyosundan ince tabakalı oksijenatöre ve cam kolona perfüzyon yapar. E. Bilyalı yataklı pompa, dağıtım pompasından kolona verilen perfüzyonu sirküle eder ve perfüzyonu oksijenli tutar ve 8 mL/dk. F akışını korur. Bilyalı rulmanlı pompa, NMR tüpünden efferent perfüzyonu giderir. G. Karaciğerin akış hızını elde etmek için NMR tüpünden sızan tartımı tartmak için tartım terazisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Heparin enjeksiyonu. Derin deri altı heparin enjeksiyonu, farenin alt karın yağ tabakasında verilir. Fareyi alırken, iğnenin cilde kolaylıkla nüfuz etmesini sağlamak için cildi sıkıca çekmek önemlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Lidokain enjeksiyonu. Fare, cerrahi platformda sırtüstü pozisyonda, pençeleri bantlanmış ve burnu burun konisinde olacak şekilde yerleştirilir. Lidokain, iliak krest bölgesinde deri altından uygulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Selyotomi ve dikiş. Çöliyotomi iç organları açığa çıkarır ve bir hemostat, insizyonun daha fazla açılmasına yardımcı olmak için ksifoid süreç boyunca çekişi çeker. Portal venin etrafına iki dikiş yerleştirilir, kateter yerleştirilir ve dikişler bağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. NMR tüpü. Karaciğer, kateter ile birlikte vücuttan çıkarılır ve daha sonra cam kolona tutturulmuş silikon boruya tutturulur. Karaciğer kolondan asılır ve NMR tüpü tarafından kapsüllenir. 20 mm'lik bir NMR tüpü daha sonra karaciğeri kapsülleyen kolona dikkatlice vidalanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Oksijen tüketimi ve akış hızı. Beslenen ve oruç tutan karaciğerler arasındaki hepatik oksijen tüketimi ve akış hızı ölçümlerinin karşılaştırılmasından elde edilen temsili veriler. N = 3 ve hata çubukları standart sapmadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Heparin 1000 adet/mL | Tuzlu su 0.9% | Toplam |
| 0,01 mL | 0,19 mL | 0,2 mL |
| Lidokain 2% | Tuzlu su 0.9% | Toplam |
| 0,2 mL | 0,6 mL | 0,8 mL |
Tablo 1. Heparin ve lidokain salin ile dozu. Tablo, heparin ve lidokain konsantrasyonunu ve her ilacın salin ile dozunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu cerrahi prosedür zordur ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kapsamlı bir uygulama gerektirir. İzofluran ve taşıyıcı gaz, hayvanın yaşayabilirliğini cerrahi prosedürün mümkün olduğunca büyük bir kısmı boyunca korumak için gerektiği gibi ayarlanmalıdır. Çevre, günün saati, yaş, kilo ve diğer bazı faktörler anesteziyi etkileyecektir. Kilo, diyet, farelerin suşu ve yaş, yağ birikimi portal venin görselleştirilmesine müdahale edebileceğinden ameliyatı etkileyebilir. Pençeleri bantlarken, boyunda boğulmaya neden olabilecek herhangi bir gerginlik uygulanmamasına dikkat edilmelidir. Ayrıca, fare ne kadar yağlı olursa, lipitlerin neden olduğu kateter ve ven arasındaki sürtünme katsayısındaki azalmaya karşı koymak için dikişin kateterin etrafında olması gerekecektir. Heparin için etki süresinin başlangıcı esastır, çünkü izoflurana aşırı maruz kalmak organlarda artefaktlar üretir17. Heparin ve lidokain enjeksiyonlarının uygulanması, enjeksiyon sırasında iç organlara travma olmamasını sağlayan 19.05 mm uzunluğunda bir 23G iğne gerektirir. Dikiş ilmeği, kateterin konikliğinin üzerinde olmalıdır, aksi takdirde sıkıldığında damarı tıkar. Kateter yerleştirildikten sonra, genellikle kateterden basınçtan bir kan geri akışı vardır, bu da doğru yerleşimin pozitif bir işaretidir. Kateter, kateter ucunun ilk dikişten yeterince uzakta olduğunu görsel olarak doğrulamak için yukarı doğru çekilebilir. Bilekleri ve omuzları yuvarlamak, asistan dikişi bağladığında dikişin konik uçtan kaymamasını sağlayacaktır. Karaciğeri silikon perfüzyon borusundan kolona aktarırken, kateterin üstünde bir perfüzyonat boncuğu bırakılır. Perfüzyon boncuğu, herhangi bir hava kabarcığının kateterin içine girmesini ve karaciğere girmesini önleyecektir. Kateterin üstündeki perfüzyon menisküsu, karaciğerin bağlanana kadar çalışması için yeterli hacim sağlar. Karaciğer ve portal venin burulmasını önlemek için, NMR tüpü yavaşça vidalanır. Ek olarak, bu deneyde kullanılan perfüzyon sistemi bir basınç valfi gerektirmez. Pompaların akış hızları, cam perfüzyon kolonunun ~ 12 cm yükseklikte perfüzyonat içereceği şekilde korunur. Karaciğer, Krebs tamponunu yerçekimi ile alır ve karaciğerin akış hızı üzerinde hiçbir etkisi olmadan iki pompa arasındaki basınç farkını reddeder. Karaciğer yerçekimi yoluyla perfüze edildiğinden, karaciğer tarafından alınan perfüzyon miktarı karaciğerin doğal biyolojik aktivitesi tarafından belirlenir. Bu sistemde portal ven basıncı ölçülemediğinden perfüzyon basıncı için veri toplanmamıştır.
Çöliyotominin ilk kesisi bir açıklık oluşturmak için sığdır ve sonraki kesikler karaciğerin loblarını tıkamaktan kaçınmak için daha derindir. Çöliyotomi için insizyonun toplam uzunluğu, bu yaş ve büyüklükteki fareler için 3 cm'dir, ancak gerginliğe, yaşa ve ağırlığa bağlı olarak değişecektir. Açıklanan çalışmada 9-13 haftalık fareler kullanılsa da, sıçanların yanı sıra daha yaşlı veya daha genç fareler de incelenebilir. NMR tüpünün ve portal ven kateterinin boyutunun, ilgili çalışma için karaciğer ve portal venin anatomik boyutuna göre değiştirilmesi gerekecektir. Portal ven düz değilse, pamuk uçlu bir aplikatör, kateteri yerleştirirken damarın manipüle edilmesine yardımcı olabilir. Safra kanalı çıkarılmamasına rağmen, yokluğu için deneysel bir ihtiyaç varsa, kanal ince cımbızla çıkarılabilir. Dikiş yerleştirilirken portal venin aşırı manipülasyonu daralmaya neden olacak ve kateter yerleşimini zorlaştıracaktır. Karaciğere yapışan herhangi bir kürk, kateteri kolona takmadan ve NMR tüpü içinde kapsüllemeden önce perfüzyonla durulanır. Perfüzyon için 30 dakikalık zaman dilimi 20 dakikadan 60 dakikaya değiştirilebilir, ancak tüm güvenilir veriler ilk 10 dakikalık perfüzyondan sonra toplanacaktır.
Başarılı hepatik doku rezeksiyonunun bir belirteci, perfüzyondan sonra karaciğerde herhangi bir deformite veya başka herhangi bir bütünlük sorunu olmamasıdır. Baştan sona homojen olarak soluk sarıdır. Doku ameliyat sırasında bir nick gibi yaralanırsa, etrafında koyu sarı lekeler olurdu. Ayrıca, karaciğer perfüzyondan zarar görmüşse, perfüzyon olmazdı. Doku, Krebs tamponunun zayıf perfüzyonunu yaşamışsa, doku ölümüne yol açan açlığın bir sonucu olarak organ boyunca koyu sarı çizgiler olacaktır. Karaciğer sağlığını izlemenin bir başka yöntemi hepatik oksijen tüketimidir (Şekil 6). Farelerin karaciğerlerinin daha yüksek lipit ve glikojen miktarları içerdiği, ancak benzer toplam protein miktarlarına sahip olduğu gösterilmiştir, bu nedenle karaciğer kütlesine normalleştirildiğinde hepatik oksijen tüketiminin benzer bir değere sahip olması beklenmektedir. Üçüncü bir yöntem, metabolik cironun gerçek zamanlı verilerinin NMR verileridir.
Yöntemin ana sınırlaması terminal cerrahinin kendisidir. Farelerde, ekipmanda, zamanda ve personelde önemli bir maliyet vardır. Bu nedenle, bu prosedürleri uygularken ve veri toplarken azami özen gösterilmelidir. Fare modelindeki biyolojik varyasyon ameliyatta zorluk yaratabilir. Ayrıca, optik geliştirmelerden kaçınmak zorunludur. Tüm anatomi çıplak gözle görülebildiği için optik iyileştirmelere gerek yoktur. Optik geliştirmeler, cerrah ve asistanın sınırlı bir görüş alanına sahip olması, karaciğerde knicklere veya portal vende istenmeyen gerginliğe yol açarak kateter çekilirse başarısızlığa neden olan hataların ortaya çıkma potansiyelini arttırır. Bu yöntemlerin doğru uygulanması, C57BL/6J farede %95'lik > cerrahi başarı oranı ile sonuçlanacaktır. Dikkate alınması gereken bir diğer sınırlama, karaciğerin kararlı bir duruma ulaşması için gereken 10 dakikalık süredir. Burada açıklanan çalışma için veya diğerlerinde bir sınırlama değildir, ancak ilk 10 dakikalık veriyi garanti eden herhangi bir deney için bu yöntem yeterli olmayacaktır. Tüm vücut metabolizması ile ilişkili karmaşık hormonal imzanın eksikliği de bir sınırlama görevi görür, ancak glukagon , insülin vb. ve bunların herhangi bir kombinasyonu perfüzyona geri eklenebilir.
Bu teknik için gelecekteki birkaç potansiyel uygulama vardır. NASH tedavisi için daha fazla ilaç geliştirildikçe, karaciğer enerji metabolizmasını değerlendirmek için standart yöntemler geniş bir uygulama alanı bulabilir. NASH karaciğer kanseri ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğundan, bu kanserlerin modelleri de çalışma konusudur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Fon verenlerin çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; veya sonuçları yayınlama kararında.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889) finansmanıyla desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir kısmı, Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı'nın Ulusal Bilim Vakfı İşbirliği Anlaşması No tarafından desteklenen İleri Manyetik Rezonans Görüntüleme ve Spektroskopi (AMRIS) Tesisi'ndeki McKnight Beyin Enstitüsü'nde gerçekleştirildi. DMR-1644779 ve Florida Eyaleti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
