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Neuroscience

उत्तेजक और ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क में वयस्क न्यूरोजेनेसिस का विश्लेषण

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63182
Automatic Translation
1,2,3, 3, 1,3
1Genetics Graduate Training Program, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, 2Science and Medicine Graduate Research Scholars Program, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, 3Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health

Summary

यह लेख वयस्क ड्रोसोफिला को मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (पीटीबीआई) देने और परिणामी न्यूरोजेनेसिस की जांच करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Abstract

रोग या चोट के जवाब में न्यूरोजेनेसिस अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। हालांकि, इन तंत्रों को समझना तंत्रिका पुनर्योजी उपचार विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर तंत्रिका विकास के अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल है, लेकिन ऐतिहासिक रूप से वयस्क मस्तिष्क पुनर्जनन की जांच करने के लिए शोषण नहीं किया गया है। यह मुख्य रूप से इसलिए है क्योंकि वयस्क मस्तिष्क बहुत कम माइटोटिक गतिविधि प्रदर्शित करता है। फिर भी, वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क के लिए मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (पीटीबीआई) नए न्यूरॉन्स और नए ग्लिया की पीढ़ी को ट्रिगर करती है। ड्रोसोफिला में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण यहां वर्णित सरल लेकिन कठोर चोट प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त रूप से अब वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क को तंत्रिका पुनर्जनन अनुसंधान के लिए एक मजबूत मॉडल बनाते हैं। यहां प्रदान किया गया है कि (1) वयस्क केंद्रीय मस्तिष्क को मर्मज्ञ चोटों और (2) विच्छेदन, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग पोस्ट-चोट के लिए विस्तृत निर्देश दिए गए हैं। ये प्रोटोकॉल अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देते हैं और तंत्रिका पुनर्जनन के अंतर्निहित तंत्र को विच्छेदित करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की सुविधा प्रदान करेंगे।

Introduction

मस्तिष्क और तंत्रिका तंत्र को नुकसान दुनिया भर में मृत्यु और विकलांगता का एक प्रमुख कारण है। लगभग 1.5 मिलियन अमेरिकियों को हर साल दर्दनाक मस्तिष्क की चोटों (टीबीआई) का सामना करना पड़ता है, जबकि अकेले संयुक्त राज्य अमेरिका में अनुमानित 6 मिलियन व्यक्ति पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से पीड़ित हैं। मस्तिष्क को बीमारी और चोट दोनों तंत्रिका अध: पतन का कारण बन सकते हैं, जिससे संवेदी, संज्ञानात्मक और मोटर दोष हो सकते हैं3। मानव मस्तिष्क की मरम्मत के लिए चिकित्सीय रणनीतियों का विकास करना मस्तिष्क के जटिल शरीर विज्ञान के कारण मुश्किल हो गया है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जैसे मॉडल जीव न्यूरोडीजेनेरेशन और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों के अंतर्निहित मौलिक तंत्र की पहचान करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करते हैं।

फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक सदी से अधिक समय से एक शक्तिशाली मॉडल जीव रहा है, जो आनुवांशिकी, विकासात्मक जीव विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्रों को आगे बढ़ाता है5,6। ड्रोसोफिला मस्तिष्क में केवल ~ 90,000 न्यूरॉन्स 7 शामिल हैं, जो औसत मानव मस्तिष्क 8 की तुलना में एक मिलियन गुना कम है, फिर भी उनके पास कई समानताएं हैं। मानव और मक्खी दिमाग दोनों न्यूरोट्रांसमीटर गाबा, ग्लूटामेट, एसिटाइलकोलाइन, और बायोजेनिक अमीन्स डोपामाइन और सेरोटोनिन 9 का उपयोग करते हैं। ड्रोसोफिला और मानव न्यूरॉन्स भी एक साझा सिनैप्टिक आर्किटेक्चर और अनुरूप तंत्रिका कोशिका प्रकार 10 के साथ समान रूप से कार्य करते हैं। ड्रोसोफिला के छोटे मस्तिष्क का आकार और उन्नत आनुवांशिकी तकनीकों की उपलब्धता, ड्रोसोफिला और स्तनधारियों के बीच आणविक, सेलुलर और शारीरिक तंत्र के संरक्षण के साथ संयोजन में, ड्रोसोफिला शोधकर्ताओं को ऐसे प्रश्न पूछने की अनुमति देती है जो स्तनधारी मॉडल में अव्यावहारिक या जवाब देने के लिए मुश्किल हैं।

ड्रोसोफिला में वयस्क न्यूरोजेनेसिस की हमारी वर्तमान समझ, होमियोस्टैसिस के दौरान और चोट के बाद दोनों, सीमित रहती है। सामान्य विकास के दौरान न्यूरोजेनेसिस के बारे में अधिक जाना जाता है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स और ग्लिया अग्रदूत कोशिकाओं से विकास के दौरान बनाए जाते हैं, जिन्हें न्यूरोब्लास्ट्स 10,11 कहा जाता है। केंद्रीय मस्तिष्क में कम से कम तीन अलग-अलग प्रकार के न्यूरोब्लास्ट्स को प्रतिष्ठित किया गया है। दोनों प्रकार I और प्रकार II वंश neuroblasts सेल चक्र से बाहर निकलें ~ 20-30 ज puparium गठन के बाद 12. इसके विपरीत, मशरूम बॉडी न्यूरोब्लास्ट्स सेल डिवीजन को समाप्त करने के लिए अंतिम हैं और प्यूपेरियम गठन के बाद रीपर-निर्भर एपोप्टोसिस ~ 85-90 एच के माध्यम से ऐसा करते हैं। Eclosion के बाद, वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क में कुछ विभाजित कोशिकाएं (~ 1 सेल / मस्तिष्क) होती हैं, मुख्य रूप से ग्लिया 14। वयस्क ऑप्टिक लोब में धीरे-धीरे साइकलिंग न्यूरोब्लास्ट होते हैं जो न्यूरोजेनेसिस 15 में सक्षम होते हैं, जबकि वयस्क केंद्रीय मस्तिष्क में कोई ज्ञात न्यूरोब्लास्ट नहीं होता है। तंत्रिका पूर्वजों की कमी और सीमित कोशिका प्रसार वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में स्थिति से मिलती-जुलती है, जो मनुष्यों के लिए ड्रोसोफिला में वयस्क न्यूरोजेनेसिस के तंत्र की संभावित प्रासंगिकता को रेखांकित करती है।

चोट 15 के बाद वयस्क ड्रोसोफिला ऑप्टिक लोब में वयस्क न्यूरोजेनेसिस के निम्न स्तर की खोज ने इस परिकल्पना को जन्म दिया कि वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क भी वयस्क न्यूरोजेनेसिस 16 में सक्षम हो सकता है। यह प्रोटोकॉल वयस्क ड्रोसोफिला में केंद्रीय मस्तिष्क की चोट का एक कठोर, पुनरुत्पादक मॉडल बनाने का वर्णन करता है जिसका उपयोग वयस्क केंद्रीय मस्तिष्क में न्यूरोजेनेसिस की जांच करने के लिए किया जा सकता है। मानव और ड्रोसोफिला मस्तिष्क वास्तुकला और कार्य के बीच समानताओं को देखते हुए, इन खोजों से घायल और रोगग्रस्त मानव दिमाग में चिकित्सीय न्यूरोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्यों की पहचान हो सकती है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल UW-मैडिसन के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. PTBI के लिए वयस्क ड्रोसोफिला उत्पन्न

  1. मानक क्रॉस के लिए, 20 कुंवारी y[1] w[1] रखें; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 वयस्क मादाएं और 10 y[1] w[1]17 वयस्क नर शीशियों में एक साथ उड़ते हैं (सामग्री की तालिका देखें) जिसमें भोजन होता है। तुल्यकालिक संतानों की बड़ी संख्या के लिए, एक ही समय में 10-20 क्रॉस सेट करें। मानक क्रॉस जीनोटाइप की F1 संतानों को जन्म देता है: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
    1. संभोग और अंडे देने के लिए शीशियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें। संतानों को अधिकतम करने के लिए, माता-पिता को हर 2-4 दिनों में नई शीशियों में स्थानांतरित करें, 25 डिग्री सेल्सियस पर पहले की शीशियों को बनाए रखें। माता-पिता को पहली बार इसमें रखे जाने के 18 दिनों के बाद प्रत्येक शीशी को छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई एफ 2 संतान नहीं है।
      नोट: संतानों के 3 सेट ("ब्रूड्स") माता-पिता के प्रत्येक सेट से उत्पन्न किए जा सकते हैं।
    2. ~ 10 दिनों के बाद जांचें, जब F1 संतान ों को eclose करने के लिए शुरू हो जाएगा।
  2. वंश अध्ययन के लिए, जीनोटाइप के F1 परमा-जुड़वां पुरुषों 15 का उपयोग करें: डब्ल्यू; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. स्थिरता के लिए, हर बार एक ही दिशा में इस क्रॉस को करें।
    1. परमा-जुड़वां पुरुषों को उत्पन्न करने के लिए, 20 कुंवारी डब्ल्यू रखें; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; टब-GAL80ts / TM6B महिलाओं और 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; अधिनियम-GAL4 UAS-flp / TM6B15 वयस्क पुरुषों को एक साथ भोजन युक्त शीशियों में।
    2. संभोग और अंडे देने के लिए शीशियों को 17 डिग्री सेल्सियस पर रखें। माता-पिता को हर 7 दिनों में नए भोजन की शीशियों में स्थानांतरित करें, 17 डिग्री सेल्सियस पर सभी शीशियों को बनाए रखें। माता-पिता को पहली बार इसमें रखे जाने के 35 दिनों के बाद प्रत्येक शीशी को छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई एफ 2 संतान नहीं है।
    3. ~ 21 दिनों के बाद की जाँच करें, जब F1 संतान ों को eclose करने के लिए शुरू हो जाएगा।

2. दर्दनाक मस्तिष्क की चोट मर्मज्ञ (PTBI;  चित्र 1)

  1. सॉर्ट नए eclosed F1 मक्खियों. 6 ज के बाद eclosion के भीतर युवा पुरुषों का चयन करें। इन पुरुषों को भोजन युक्त साफ शीशियों में रखें, जिसमें प्रति शीशी 40 या उससे कम मक्खियां हों।
    नोट: यह सबसे आसानी से सुबह के मध्य में सीओ 2 पैड पर मक्खियों को बेहोश करके और वयस्क पुरुषों की पहचान करके पूरा किया जाता है जिनके पास अभी भी मेकोनियम (पेट की दीवार के माध्यम से एक गहरे हरे रंग की जगह के रूप में दिखाई देता है) उनकी हिम्मत में है।
  2. चोट से पहले 6 ज के लिए 5-एथिल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूर्व-फ़ीड यदि ईडीयू के साथ विभाजित कोशिकाओं को लेबल करने की योजना बना रहा है। विवरण के लिए चरण 3 देखें।
  3. 70% इथेनॉल से भरे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ~ 100 पिन रखकर कम से कम 5 मिनट के लिए मिनुटिन पिन ( सामग्री की तालिका देखें) को सैनिटाइज करें।
  4. 70% इथेनॉल का छिड़काव करके सीओ 2 पैड और पेंटब्रश को सैनिटाइज करें और एक साफ लिंट-मुक्त ऊतक के साथ सूखी पोंछें। एक बार जब उपकरण साफ और सूखे हो जाते हैं, तो 40 या उससे कम सॉर्ट किए गए F1 पुरुषों को साफ पैड पर वापस स्थानांतरित करें।
  5. फ्लाई पैड पर F1 पुरुषों को 2 समूहों में विभाजित करें। एक समूह एक नियंत्रण के रूप में काम करेगा, अनियंत्रित मक्खियों। दूसरे प्रयोगात्मक समूह को पीटीबीआई के अधीन किया जाएगा।
  6. संदंश का उपयोग करते हुए, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से 4-5 नए मिनुटिन पिन खींचें और उन्हें सीओ 2 पैड के किनारे के पास रखें। विच्छेदन क्षेत्र के तहत, एक तेज बिंदु के साथ एक सीधा मिनुटिन पिन चुनें।
    नोट:: एक प्रयोग के लिए एक एकल Minutien पिन का उपयोग परिवर्तनशीलता को कम कर देगा। तेज पिन का पुन: उपयोग करें. सुरक्षित निपटान के लिए 70% इथेनॉल युक्त एक अलग 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में क्षतिग्रस्त या कुंद पिन रखें।
  7. यदि मानक क्रॉस से मक्खियों के साथ काम कर रहे हैं, तो हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (जीएफपी) के लिए उचित उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर से लैस स्टीरियो माइक्रोस्कोप प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) लैंप पर स्विच करें। यह 440-460 nM पर उत्तेजना की अनुमति देता है और 500-560 nM के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
    नोट: इस दीपक और फिल्टर सेट के साथ, मशरूम शरीर के सेल निकायों सिर छल्ली (चित्रा 1 सी) के माध्यम से हरे रंग के fluoresce होगा। अन्य जीनोटाइप के परमा-जुड़वां मक्खियों या मक्खियों के लिए, स्टीरियो माइक्रोस्कोप के लिए एक मानक सफेद प्रकाश प्रकाशक का उपयोग मशरूम शरीर को चोट को लक्षित करने के लिए सिर छल्ली पर स्थलों की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 1 सी)।
  8. एक हाथ में चयनित मिनुटिन पिन को लेने और पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें (दाएं हाथ के लोगों के लिए, यह आमतौर पर दाहिना हाथ होता है) और दूसरे (आमतौर पर बाएं) हाथ में पेंटब्रश। प्रयोगात्मक समूह से एक मक्खी चुनें और मक्खी को इस तरह से रखें कि आपके पास दाईं ओर मक्खी के सिर के साथ सिर कैप्सूल का पृष्ठीय दृश्य हो। ब्रश को पृष्ठीय वक्ष के पूर्वकाल पर रखें और मक्खी को स्थिर करने के लिए धीरे से नीचे धकेलें।
  9. सिर के दाईं ओर मशरूम शरीर के सेल निकायों पर मिनुटिन पिन की नोक का लक्ष्य रखें और सिर कैप्सूल में प्रवेश करें। यदि स्थलों का उपयोग कर रहे हैं, तो ओसेली और आंख के पृष्ठीय रिम के बीच पृष्ठीय सिर छल्ली को लक्षित करें (चित्रा 1)।
  10. चोट को पूरा करने के बाद, पेंटब्रश का उपयोग करें ताकि सिर को धीरे से मिनुटियन पिन से धक्का दिया जा सके।
  11. यदि आरएनए-सेक या क्यूआरटी-पीसीआर के लिए मस्तिष्क का उपयोग कर रहे हैं, तो सिर के बाईं ओर दूसरी चोट लगाएं।
  12. प्रयोगात्मक समूह में सभी मक्खियों को घायल करने के लिए चरण 2.8-2.10 को दोहराएं।
  13. एक बार जब सभी मक्खियों को घायल कर दिया जाता है, तो नियंत्रण और घायल मक्खियों को लेबल, भोजन युक्त अलग-अलग शीशियों में रखें। शीशियों को क्षैतिज रूप से (यानी, उनके किनारों पर) रखें, जबकि मक्खियां संज्ञाहरण से ठीक हो जाती हैं और बाद की उम्र बढ़ने के दौरान मक्खियों को भोजन में पकड़े जाने से रोकने के लिए।
  14. मानक क्रॉस मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और उम्र के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर परमा-जुड़वां मक्खियों को रखें।
  15. 24 घंटे से अधिक उम्र की मक्खियों के लिए, उन्हें हर 1-2 दिनों में साफ भोजन पर रखें।

3. EdU लेबलिंग

  1. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 10 mM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) का स्टॉक तैयार करें। इसे 12 महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 10% सुक्रोज में 50 μM EdU के 200 μL तैयार करें। पीटीबीआई से पहले 6 घंटे के लिए ईडीयू के साथ प्री-फीड मक्खियों।
  3. एक अन्यथा खाली शीशी में एक 23 मिमी दौर ग्रेड 3 फिल्टर पेपर ( सामग्री की मेज देखें) पर 10% सुक्रोज में 50 μM EdU के 200 μL रखें।
  4. मक्खियों को शीशी में रखें। फिर एक कपास प्लग के साथ शीशी को सील करें।
  5. शीशी को 6 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में क्षैतिज रूप से रखें।
  6. चरण 2.3-2.10 में वर्णित के रूप में PTBI बाहर ले जाएँ।
  7. ईडीयू युक्त शीशी में मक्खियों को वापस रखें। एक कपास प्लग के साथ शीशी सील.
  8. 24 घंटे तक के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में क्षैतिज रूप से शीशी बिछाएं। नीचे वर्णित चरणों में से एक का पालन करें (चरण 3.8.1-3.8.3)।
    1. विच्छेदन और फिक्स दिमाग के रूप में चरण 4 में वर्णित फिक्सेटिव, वॉश बफर का उपयोग करके, और एज़ाइड के बिना बफर को अवरुद्ध करना और एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले किए गए ईडीयू डिटेक्शन प्रतिक्रिया के साथ।
    2. मक्खियों को एक साफ शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें एक नया फिल्टर पेपर और 10% सुक्रोज में 50 μM EdU के 200 μL शामिल हैं। शीशी को क्षैतिज रूप से 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। लेबलिंग की अवधि के दौरान हर 24 घंटे में दोहराएं। फिर, विच्छेदन और मस्तिष्क को ठीक करें जैसा कि चरण 4 में वर्णित है, एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले किए गए ईडीयू डिटेक्शन प्रतिक्रिया के साथ एज़ाइड के बिना बफर का उपयोग करके।
    3. EdU के साथ पल्स-चेस लेबल के लिए, पल्स अवधि के लिए EdU फ़ीड करें, मक्खियों को हर 24 घंटे में एक साफ शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें एक नया फिल्टर पेपर और 10% सुक्रोज में 50 μM का 200 μL होता है। नाड़ी अवधि (जैसे, 4 दिन) के बाद, मक्खियों को मानक ड्रोसोफिला भोजन युक्त शीशी में स्थानांतरित करें। एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अपनी तरफ शीशी रखें। फिर, विच्छेदन और मस्तिष्क को ठीक करें जैसा कि चरण 4 में वर्णित है, एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले किए गए ईडीयू डिटेक्शन प्रतिक्रिया के साथ एज़ाइड के बिना बफर का उपयोग करके।

4. विच्छेदन, immunohistochemistry, और बढ़ते

  1. फिक्सेटिव के 100 μL के साथ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब तैयार करें: PEM में 4% फॉर्मेल्डिहाइड (100 mM piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0) ( सामग्री की तालिका देखें) और बर्फ पर रखें।
    नोट: एक एकल जीनोटाइप और स्थिति के 20 दिमागों को एक ही ट्यूब में संसाधित किया जा सकता है।
  2. 70% इथेनॉल के एक छोटे पूल (~ 100 μL) और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS; K2HPO4 के 100 mM, NaCl के 140 mM, pH 7.0) के तीन छोटे पूलों के साथ एक विच्छेदन प्लेट तैयार करें।
  3. Anesthetize ~ 10 नियंत्रण या प्रयोगात्मक एक CO2 पैड है कि 70% इथेनॉल के साथ sanitized किया गया है पर मक्खियों.
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करके प्रत्येक मक्खी के ट्रंक से सिर को अलग करें।
  5. 70% इथेनॉल में गीला एक पेंटब्रश के साथ सिर ले लीजिए और विच्छेदन प्लेट पर इथेनॉल पूल में 2-5 मिनट के लिए सिर रखें।
    नोट: यह दिमाग को थोड़ा निर्जलित करता है और उन्हें सिर छल्ली से दूर विच्छेदन करना आसान बनाता है।
  6. पीबीएस के ~ 100 μL पूल में सिर को स्थानांतरित करें और दिमाग को विच्छेदित करें, प्रत्येक मस्तिष्क को पीबीएस के एक साफ ~ 100 μL पूल में ले जाएं। सिर छल्ली के पीछे खोलने के लिए Watchmakers संदंश के दो जोड़े का उपयोग करके और संदंश की एक जोड़ी के साथ छल्ली पकड़, जबकि धीरे से संदंश की दूसरी जोड़ी के बंद टिप का उपयोग कर छल्ली से बाहर मस्तिष्क prying जबकि यह प्रदर्शन करें.
  7. विच्छेदित मस्तिष्क को एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें फिक्सिंग समाधान के 100 μL होते हैं, जो एक प्लास्टिक टिप से सुसज्जित P200 पिपेटर का उपयोग करते हैं जिसे दिमाग के प्रवेश की अनुमति देने के लिए काट दिया गया है और बेवेल किया गया है।
  8. कमरे के तापमान पर 20-25 मिनट के लिए ठीक करें। ध्यान से या तो एक P200 या एक ग्लास पिपेट के साथ फिक्स निकालें.
  9. 'पीटी' (पीबीएस प्लस 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के 1 मिलीलीटर के साथ निश्चित दिमाग को चार बार धोएं, जिससे मस्तिष्क को प्रत्येक धोने के बीच कई मिनटों के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति मिलती है।
    नोट: यदि दिमाग धोने के बीच तेजी से व्यवस्थित नहीं होते हैं, तो उनके पास अभी भी वसा शरीर और / या श्वासनली संलग्न होने की संभावना है।
  10. पीबीएस प्लस 0.1% ट्राइटन एक्स -100 और 2% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (पीबीटी) के 1 मिलीलीटर में ब्लॉक नमूने कमरे के तापमान पर ~ 1 घंटे के लिए।
  11. ब्लॉकिंग समाधान को निकालें और पीबीटी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश एंटी-पीएच 3 (1: 500) और माउस एंटी-फासिकलिन II (1: 20) हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  12. पीटी के 1 एमएल के साथ नमूनों को पांच बार धोएं, जिससे मस्तिष्क को प्रत्येक धोने के बीच कई मिनटों तक व्यवस्थित करने की अनुमति मिलती है।
  13. अंतिम धोने को निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL में इनक्यूबेट करें। यहां उपयोग किए जाने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी एंटी-खरगोश 568 (1: 400) और एंटी-माउस Cy5 (1: 100) हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  14. पीटी के 1 एमएल के साथ नमूनों को पांच बार धोएं, जिससे मस्तिष्क को प्रत्येक धोने के बीच कई मिनटों तक व्यवस्थित करने की अनुमति मिलती है। अंतिम धोने के दौरान, नाभिक को दागने के लिए 10 मिनट के लिए 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI; 10 μM समाधान का 1:100) जोड़ें। धोने को हटा दें, प्रत्येक ट्यूब में 50-100 μL छोड़ दें।
  15. प्रत्येक स्लाइड के बीच में एक एकल, आत्म-चिपकने वाला सुदृढीकरण लेबल और प्रत्येक लेबल के केंद्र में एंटी-फीका बढ़ते मीडिया की 50 μL बूंद रखकर माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सुदृढीकरण लेबल स्लाइड के ऊपर कवरस्लिप को थोड़ा ऊपर रखता है और घुड़सवार दिमाग को अत्यधिक चपटा होने से रोकता है।
  16. ध्यान से प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब से मस्तिष्क हस्तांतरण के रूप में संभव के रूप में कम धोने बफर के साथ एक तैयार स्लाइड के रूप में संभव के रूप में एक कट और beveled प्लास्टिक टिप के साथ सुसज्जित एक P200 का उपयोग कर. एक स्लाइड पर 10 दिमाग लगाए जा सकते हैं।
  17. प्रत्येक स्लाइड पर एक कवरस्लिप रखने और नेल पॉलिश के साथ स्लाइड को सील करने से पहले धीरे-धीरे दिमाग को पुनर्स्थापित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। या तो पीछे की तरफ या पूर्वकाल पक्ष ऊपर के साथ दिमाग को उन्मुख करें, लेकिन एक-दूसरे को छूना नहीं चाहिए।
    नोट: क्योंकि पूरे मस्तिष्क के माध्यम से उच्च गुणवत्ता वाले कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करना मुश्किल है, इसलिए कुछ दिमागों को प्रत्येक अभिविन्यास में लगाया जाना चाहिए।
  18. तैयार स्लाइड्स को सपाट और अंधेरे में इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबी अवधि के भंडारण (1 वर्ष तक) के लिए, स्लाइड्स को -20 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है.

5. Confocal इमेजिंग

नोट: छवि मस्तिष्क एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप उत्तेजना लेजर और उत्सर्जन फिल्टर DAPI और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (यानी, 405 एनएम, 488 एनएम, और 568 एनएम, 633 एनएम, क्रमशः) के लिए उपयुक्त क्यूब्स के साथ का उपयोग कर.

  1. माइक्रोस्कोप, लेजर, नियंत्रक और कंप्यूटर की शक्ति को चालू करें।
  2. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें।
  3. अधिग्रहण मोड में, चार चैनलों तक का चयन करें और वांछित चैनलों की अनुक्रमिक स्कैनिंग के लिए पैरामीटर सेट करें। प्रत्येक चैनल के लिए लेजर शक्ति को 5-10% तक बढ़ाएं।
  4. माइक्रोस्कोप पर एक स्लाइड रखें।
  5. एपिफ्लोरेसेंस अनुलग्नक का उपयोग करके चित्रित करने के लिए एक मस्तिष्क चुनें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. अधिग्रहण मोड में, फ़्रेम आयाम के रूप में 1024 x 1024 पिक्सेल का चयन करें।
  7. अधिग्रहण मोड में, Z-स्टैक विकल्प का चयन करें, संकेत दें कि Z-स्टैक को 2 μm अनुभागों पर लिया जाना चाहिए, और नमूने के माध्यम से फ़ोकस करें, ऊपर और नीचे के फोकल विमानों का चयन करें।
  8. एक 20x उद्देश्य और इस तरह के एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर मशरूम शरीर के रूप में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों का उपयोग कर पूरे दिमाग के जेड-स्टैक छवियों को इकट्ठा करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. प्रसार कोशिकाओं और पर्मा-ट्विन क्लोन की संख्या को मैन्युअल रूप से और / या छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते समय, कम से कम 10 μm के क्षेत्रों के साथ ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) का चयन करें।

Representative Results

PTBI सेल प्रसार को उत्तेजित करता है
एक केंद्रीय मस्तिष्क पीटीबीआई के बाद न्यूरोजेनेसिस की सीमा निर्धारित करने के लिए, प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया को युवा वयस्क पुरुषों में मापा गया था और एक्लोशन के 6 घंटे के भीतर घायल कर दिया गया था। प्रसार में एक महत्वपूर्ण वृद्धि एंटी-फॉस्फोहिस्टोन 3 (पीएच 3) का उपयोग करके 24 घंटे की चोट के बाद देखी गई थी, जो सक्रिय रूप से माइटोसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है। नियंत्रण केंद्रीय दिमाग में लगभग 3 PH3 + कोशिकाओं और घायल केंद्रीय दिमाग में 11 PH3 + कोशिकाओं को PTBI के बाद 24 घंटे मनाया जाता है (चित्रा 2A-D)। अधिकांश विभाजित कोशिकाएं चोट स्थल के पास स्थित होती हैं। सेल विभाजन के लिए एक दूसरी परख का उपयोग एक ही चोट से संचयी सेल प्रसार को मापने के लिए किया गया था और उस हद तक आकलन करने के लिए किया गया था जिस तक नवनिर्मित कोशिकाएं बच गईं। 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) एक थाइमिडिन एनालॉग है जिसे नए संश्लेषित डीएनए और स्थायी रूप से लेबल कोशिकाओं में शामिल किया जा सकता है जो डीएनए संश्लेषण से गुजरचुके हैं। मक्खियों को ईडीयू की 4-दिवसीय नाड़ी दी गई थी, जिसके बाद 3-दिवसीय पीछा किया गया था। इससे पता चला कि लेबल की गई कोशिकाएं व्यवहार्य थीं और प्रसार के कम से कम 3 दिनों बाद बच गईं। 7 दिनों तक, नियंत्रण केंद्रीय दिमाग में 2 EdU + कोशिकाओं का औसत और घायल केंद्रीय दिमाग में क्रमशः 11 EdU + कोशिकाओं का औसत था (चित्रा 2E)। यह PH3 एंटीबॉडी का उपयोग करके 24 घंटे के बाद की चोट के बाद प्राप्त परिणामों के समान है। जब सेल प्रसार को 14 दिनों में मापा जाता है, तो घायल नियंत्रणों ने केंद्रीय मस्तिष्क प्रति 1 EdU + सेल का औसत निकाला, जबकि घायल दिमागों ने 29 EdU + कोशिकाओं (चित्रा 2E) का औसत निकाला, यह दर्शाता है कि सेल प्रसार कम से कम पीटीबीआई के बाद दूसरे सप्ताह में जारी रहता है।

सेल प्रसार उम्र पर निर्भर है
केंद्रीय मस्तिष्क में सबसे बड़ी प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया को पहले 24 घंटे के भीतर देखा गया था एक्लोशन (चित्रा 3)। 7 दिनों के बाद एक्लोज़न तक, एक मर्मज्ञ चोट अभी भी प्रसार में महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनती है, जिसमें प्रति केंद्रीय मस्तिष्क 6 PH3 + कोशिकाओं का औसत होता है। फिर भी, 14 दिनों के बाद एक्लोशन तक, पीटीबीआई के बाद विभाजित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता 1 विभाजन सेल तक काफी कम हो जाती है, जो नियंत्रण मस्तिष्क (चित्रा 3) के समान है। इस प्रकार, पीटीबीआई के बाद सेल प्रसार की क्षमता उम्र-निर्भर है।

नव निर्मित न्यूरॉन्स लक्ष्य क्षेत्रों को सही करने के लिए प्रोजेक्ट कर सकते हैं
पीटीबीआई के बाद तंत्रिका पुनर्जनन का मूल्यांकन करने के लिए, पर्मा-ट्विन लेबलिंग सिस्टम 15 का उपयोग किया गया था। परमा-ट्विन वंश का पता लगाना स्थायी रूप से कोशिकाओं और उनकी संतानों को हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) 15 के साथ विभाजित करता है। नियंत्रण (चित्रा 4 ए-ई) की तुलना में 2 दिनों और 2 सप्ताह में घायल नमूनों में अधिक परमा-ट्विन क्लोन का पता लगाया गया था। विशेष रूप से, पीटीबीआई दिमाग के ~ 50% में नए मशरूम बॉडी न्यूरॉन्स थे 2 सप्ताह बाद चोट (चित्रा 4 एन)। इन नए न्यूरॉन्स ने मशरूम बॉडी कैलिक्स और उनके अक्षतंतुओं को मशरूम बॉडी लोब (चित्रा 4 डी, एफ, जी) के लिए उचित रूप से अपने डेंड्राइट्स का अनुमान लगाया। यह इंगित करता है कि नव निर्मित कोशिकाएं क्षतिग्रस्त मशरूम निकायों की मरम्मत में शामिल कार्यात्मक न्यूरॉन्स हो सकती हैं। मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों में जो पुनर्जीवित होने के लिए दिखाई दिए, उनमें अंडाकार शरीर (ईबी) (चित्रा 4H, I), एंटीनेल लोब (AL) (चित्रा 4J, K), और पार्श्व सींग (LH) (चित्रा 4L, M) शामिल हैं, जिनके पास क्रमशः लगभग 26%, 26%, और 20% समय के बड़े क्लोन थे( चित्रा 4 N)। ये परिणाम वयस्क न्यूरोजेनेसिस की जांच के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता को रेखांकित करते हैं। पीटीबीआई के बाद की घटनाओं के अनुक्रम के लिए एक प्रस्तावित मॉडल और नए न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए अग्रणी चित्र 5 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क के लिए दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (पीटीबीआई) को मर्मज्ञ। (ए) एक वयस्क मक्खी सिर के बाहरी की योजनाबद्ध। यह एक ललाट दृश्य है। इस प्रकार, जानवर का दाहिना हिस्सा दर्शक के बाईं ओर है। (बी) ग्रे में इंगित चोट प्रक्षेपवक्र के साथ एक वयस्क ड्रोसोफिला सिर के इंटीरियर की योजनाबद्ध। यह एक पश्च दृश्य है। इस प्रकार, इस छवि और बाद के आंकड़ों में, मस्तिष्क का दाहिना पक्ष दाईं ओर है। केंद्रीय मस्तिष्क पीटीबीआई कई मस्तिष्क संरचनाओं को प्रभावित करता है, जिसमें मशरूम शरीर (हरा) और मस्तिष्क के बाहर के ऊतक शामिल हैं, जिसमें वसा शरीर (नीला) और हेमोसाइट्स (लाल) शामिल हैं। CB = केंद्रीय मस्तिष्क क्षेत्र। OL = ऑप्टिक लोब क्षेत्र। (सी) एक जीवित वयस्क सिर का पृष्ठीय दृश्य जिसमें मशरूम निकायों (एरोहेड्स) को हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ लेबल किया जाता है। यह 'मानक जीनोटाइप' है (विवरण के लिए पाठ देखें)। पीटीबीआई प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप मशरूम निकायों को चोट लगती है। इस चित्र को Reference16 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: PTBI सेल प्रसार को उत्तेजित करता है। Uninjured नियंत्रण (ए) और PTBI (बी) schematics. ऊपरी दाएं कोनों में नीले बक्से पैनलों (सी) और (डी) में उच्च आवर्धन पर दिखाए गए मस्तिष्क क्षेत्रों को इंगित करते हैं। (C,D) PH3 एंटीबॉडी (लाल) का उपयोग चोट के बाद सेल प्रसार 24 घंटे की परख करने के लिए किया गया था। नियंत्रण दिमाग (सी) में, कुछ PH3 + कोशिकाएं हैं और MB के पास कोई भी नहीं है। हालांकि, पीटीबीआई दिमाग (डी) में, एमबी के पास पीएच 3 + कोशिकाएं होती हैं। (ङ) प्रसार कोशिकाओं का परिमाणीकरण। संख्याएं पूरे दिमाग में कोशिकाओं को दर्शाती हैं, न केवल मशरूम शरीर के आसपास के क्षेत्र में। 24 घंटे में, अनियंत्रित नियंत्रण दिमाग में औसतन 3 PH3 + कोशिकाएं / मस्तिष्क (n = 11 मस्तिष्क, 28 कोशिकाएं) थीं, जबकि 24 घंटे के बाद PTBI, मस्तिष्क में औसतन 11 PH3 + कोशिकाएं / मस्तिष्क (n = 17 दिमाग, 181 कोशिकाएं) थीं। 7 दिनों में, बिना घायल नियंत्रणों में कुछ ईडीयू + कोशिकाएं होती हैं, जिनमें औसतन 2 ईडीयू + कोशिकाएं / मस्तिष्क (एन = 15 दिमाग, 24 कोशिकाएं) होती हैं, जबकि 7-दिवसीय पोस्ट-पीटीबीआई दिमाग में 11 ईडीयू + कोशिकाओं / मस्तिष्क (एन = 22 दिमाग, 238 कोशिकाओं) का औसत था। 14 दिनों में, अनियंत्रित नियंत्रणों में औसतन 1 EdU + सेल / मस्तिष्क (n = 8 मस्तिष्क, 11 कोशिकाएं) होती हैं, जबकि 14-दिवसीय पोस्ट-पीटीबीआई दिमाग में औसतन 29 EdU + कोशिकाएं / मस्तिष्क (n = 14 दिमाग, 400 कोशिकाएं) होती हैं। प्रयोगों के इस सेट के लिए, eclosion के 6 ज के भीतर युवा वयस्क पुरुषों का उपयोग किया गया था। नियंत्रण और PTBI नमूनों के अनपेयर्ड टी-परीक्षण 3-समय बिंदुओं पर क्रमशः p<0.0001, p<0.0001, और p<0.0002 के मूल्यों की उपज करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) को प्रतिबिंबित करती हैं. इस चित्र को Reference16 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पीटीबीआई के लिए प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया उम्र के साथ कम हो जाती है। यह पता लगाने के लिए कि क्या उम्र कोशिका प्रसार की मात्रा को प्रभावित करती है जो चोट के बाद होती है, नए eclosed वयस्क पुरुषों की तुलना PTBI से पहले 7 दिनों, 14 दिनों और 28 दिनों की आयु के जानवरों से की गई थी, चोट के बाद सेल प्रसार 24 घंटे परख करने के लिए एंटी-PH3 का उपयोग करके। Eclosion के 6 h के भीतर घायल मक्खियों में औसतन 11 PH3 + कोशिकाएं / मस्तिष्क (n = 17 दिमाग, 182 कोशिकाएं) थीं, जो उम्र-मिलान नियंत्रण (n = 11 दिमाग, 28 कोशिकाओं) में 3 PH3 + कोशिकाओं / मस्तिष्क के औसत की तुलना में थीं। 7 दिनों की आयु की मक्खियों, फिर पीटीबीआई के अधीन, 2 PH3 + कोशिकाओं / मस्तिष्क (n = 5 मस्तिष्क, 12 कोशिकाओं) के औसत के साथ उम्र-मिलान नियंत्रण की तुलना में 6 PH3 + कोशिकाओं / मस्तिष्क (n = 5 मस्तिष्क, 12 कोशिकाओं) का औसत था। जब मक्खियों को पीटीबीआई से पहले 14 दिनों तक वृद्ध किया गया था और 24 घंटे बाद पर परख की गई थी, तो उम्र-मिलान नियंत्रण के समान 1 पीएच 3 + सेल / मस्तिष्क (एन = 8 दिमाग, 11 कोशिकाएं) का औसत था, जो 1 पीएच 3 + सेल / मस्तिष्क (एन = 4 दिमाग, 2 कोशिकाओं) का औसत था। 28-दिवसीय अनियंत्रित नियंत्रण (n = 4, 1 सेल) और PTBI (n = 3, 1 सेल) दोनों औसत 0 PH3 + कोशिकाओं / मस्तिष्क को मक्खियों। इन 4-समय बिंदुओं पर तुलना को नियंत्रित करने के लिए पीटीबीआई के लिए अनपेयर्ड टी-परीक्षण क्रमशः पी<0.0001, पी<0.04, पी<0.07 और पी<0.84 हैं। इस चित्र को Reference16 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: परमा-ट्विन वंश अनुरेखण मस्तिष्क के उत्थान और पीटीबीआई के बाद अक्षतंतुओं के उचित लक्ष्यीकरण को दर्शाता है। परमा-ट्विन वंश-ट्रेसिंग सिस्टम 15 का उपयोग पीटीबीआई के बाद न्यूरोजेनेसिस का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। यह प्रणाली स्थायी रूप से हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के साथ कोशिकाओं और संतानों को विभाजित करती है। मक्खियों को विकास के दौरान सिस्टम को बंद रखने के लिए 17 डिग्री सेल्सियस पर पाला गया था। परमा-ट्विन ट्रांसजीन ले जाने वाले एफ 1 पुरुषों को एक्लोशन पर एकत्र किया गया था, फिर घायल हो गया और 2 या 14 दिनों के लिए ठीक होने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया। (ए) 2-दिवसीय अनियंत्रित नियंत्रणों में, मस्तिष्क में कुछ जीएफपी + कोशिकाएं बिखरी हुई हैं। (बी) 14 दिनों में, नियंत्रण केंद्रीय मस्तिष्क में अपेक्षाकृत कम जीएफपी + कोशिकाएं मौजूद होती हैं। (सी) इसकी तुलना में, 2-दिवसीय घायल दिमाग में अधिक जीएफपी + कोशिकाएं होती हैं जो चोट (एरोहेड) के पास क्लस्टर होती हैं। (डी) चोट के बाद 14 दिनों में, चोट की साइट के पास बड़े क्लोन होते हैं। इनमें से कुछ क्लोनों में अक्षतंतु होते हैं जो मशरूम बॉडी ट्रैक्ट (एरोहेड) के साथ प्रोजेक्ट करते हैं। केवल GFP चैनल यहाँ दिखाया गया है; पीटीबीआई नमूनों में इसी तरह के आरएफपी + क्लोन थे। (ई) क्लोन की संख्या समय के साथ बढ़ जाती है POST-PTBI.Control uninjured दिमाग (n = 13) में 2 दिनों में औसतन 10 क्लोन होते हैं, जबकि 2-दिवसीय PTBI दिमाग (n = 20) में औसतन 23 क्लोन होते हैं (p<0.00002)। 7 दिनों में, नियंत्रण मस्तिष्क में प्रति मस्तिष्क 9 क्लोन (एन = 18) का औसत था, जबकि 7-दिवसीय पीटीबीआई दिमाग में प्रति मस्तिष्क 39 क्लोन (एन = 16) (पी-मूल्य<0.000000002) का औसत था। यह चोट के बाद 2 दिनों (पी-वैल्यू<0.0009) पर देखे गए क्लोनों की संख्या से काफी अधिक है। 14-दिवसीय नियंत्रण दिमाग में, प्रति मस्तिष्क औसतन 10 क्लोन होते हैं, जो 2-दिन और 7-दिवसीय नियंत्रणों से काफी अलग नहीं होते हैं। हालांकि, पीटीबीआई के बाद 14 दिनों में, 66 जीएफपी + क्लोन का औसत होता है, जो या तो आयु-मिलान नियंत्रण (पी<0.0000003) या 2-दिवसीय पोस्ट-पीटीबीआई दिमाग (पी-वैल्यू<0.0001) से काफी अधिक है। त्रुटि सलाखों एसडी को दर्शाता है (एफ-एम) पीटीबीआई मस्तिष्क में कई क्षेत्रों में क्लोन गठन को उत्तेजित करता है। बाईं ओर के पैनल मस्तिष्क क्षेत्रों के योजनाबद्ध हैं जहां बड़े क्लोन पीटीबीआई (ए, एच, जे, एल) के 14 दिनों के बाद पाए गए थे। दाईं ओर पैनल प्रतिनिधि दिमाग (जी, आई, के, एम) के उच्च आवर्धन दिखाते हैं। कई 14-दिवसीय दिमागों में क्लोन थे जो विशेष लक्ष्य क्षेत्रों में अनुमानित थे। इनमें मशरूम बॉडी (एमबी) (एफ, जी), अंडाकार शरीर (ईबी) (एच, आई), एंटीना लोब (एएल) (जे, के), और पार्श्व सींग (एलएच) (एल, एम) शामिल थे। (एन) क्लोन संख्या और क्लोन आकार दोनों समय के बाद पीटीबीआई के साथ बढ़ते हैं बड़े क्लोन वाले मस्तिष्क क्षेत्रों के अनुपात की गणना नियंत्रण और घायल दिमाग में 2, 7 और 14 दिनों में की गई थी। 2 दिनों में, नियंत्रण दिमाग (एन = 13) के ~ 8% ने एएल क्लोन दिखाए, जबकि 2-दिवसीय घायल दिमाग (एन = 20) में कोई एएल क्लोन नहीं थे। 7-दिवसीय नियंत्रण दिमाग (एन = 18) में, 6% में एएल था और 6% के पास ईबी क्लोन थे। पीटीबीआई (एन = 16) के बाद 7 दिनों में, 6% दिमाग में एएल क्लोन भी थे, 6% में ईबी क्लोन थे, और 19% में बड़े एमबी क्लोन थे। 14 दिनों में, नियंत्रण मस्तिष्क (एन = 9) ने क्लोन के साथ किसी भी विशिष्ट क्षेत्रों को प्रदर्शित नहीं किया, जबकि पीटीबीआई दिमाग (एन = 15) के 47% में एमबी क्लोन थे, पीटीबीआई के 20% दिमागों में एएल क्लोन थे, और 27% पीटीबीआई दिमाग में ईबी क्लोन थे, और 27% में एलएच क्लोन थे। इस चित्र को Reference16 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (PTBI) के बाद पुनर्जनन के लिए सारांश मॉडल। युवा वयस्क ड्रोसोफिला में, केंद्रीय मस्तिष्क के भीतर क्विसेंट न्यूरोब्लास्ट जैसी कोशिकाएं होती हैं जिनमें विहित न्यूरोब्लास्ट जीन की अभिव्यक्ति की कमी होती है। पीटीबीआई के बाद 24 घंटे तक, क्विसेंट न्यूरोब्लास्ट जैसी कोशिकाएं सक्रिय हो जाती हैं, न्यूरोब्लास्ट जीन को व्यक्त करती हैं, और फैलना शुरू कर देती हैं। पीटीबीआई के बाद 4 घंटे और 24 घंटे दोनों में, सेल डेथ 16 की एक लहर है। 7 दिनों में, प्रसार दर अभी भी उच्च है, और कई नई कोशिकाओं ने परिपक्व सेल पहचान को अपनाया है, जो न्यूरॉन्स या ग्लिया बन गया है। पीटीबीआई के बाद 14 दिनों में, अक्षतंतु और डेंड्राइट्स के साथ नए न्यूरॉन्स के बड़े क्लोन अपने संबंधित लक्ष्य क्षेत्रों में सही ढंग से प्रोजेक्ट करते हैं। लोकोमोटर दोषों को भी 14 दिनों तक बहाल किया जाता है, यह सुझाव देते हुए कि वयस्क ड्रोसोफिला कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से पुनर्जीवित हो सकता है। इस चित्र को Reference16 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हालांकि वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क को मर्मज्ञ चोटों को पहले 15,17,18 वर्णित किया गया है, ये चोटें ऑप्टिक लोब पर केंद्रित थीं, न कि केंद्रीय मस्तिष्क पर। इसके अलावा, चोटों को पूरा करने के तरीके के लिए विस्तृत निर्देशों की अब तक कमी है। यह प्रोटोकॉल वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क को मर्मज्ञ चोट के लिए एक मॉडल का वर्णन करता है जो पीटीबीआई के बाद वयस्क न्यूरोजेनेसिस के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सबूतों को पुन: पेश करता है।

इस PTBI प्रोटोकॉल की reproducibility के कारण, भाग में, चोट लक्ष्य क्षेत्र के रूप में मशरूम शरीर के लिए है। मशरूम शरीर बड़ा है, जिसमें बड़े और अत्यधिक रूढ़िवादी सरणियों में जटिल डेंड्राइट और अक्षतंतु आर्बर्स के साथ ~ 2200 न्यूरॉन्स शामिल हैं। मशरूम बॉडी न्यूरॉन्स के सेल निकाय मस्तिष्क की सतह के पास स्थित होते हैं और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) (चित्रा 1 सी) की अभिव्यक्ति का उपयोग करके सिर छल्ली के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। मशरूम शरीर के अग्रदूत विकास के दौरान एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए अंतिम तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं हैं13,12,19। इस प्रकार, कई मशरूम बॉडी न्यूरॉन्स एक्लोशन के समय बहुत छोटे होते हैं। इसने परिकल्पना को जन्म दिया कि मशरूम शरीर में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में अधिक माइटोटिक क्षमता हो सकती है16। इसके अलावा, मशरूम शरीर सीखने और स्मृति 18 के लिए महत्वपूर्ण है। यह किसी को यह पूछने की अनुमति देता है कि पीटीबीआई-ट्रिगर न्यूरोजेनेसिस कार्यात्मक वसूली की ओर जाता है या नहीं।

परिणामों की पुनरुत्पादकता में योगदान करने वाले अन्य कारकों में लगातार जीनोटाइप की बाहरी मक्खियों का उपयोग करना, हर बार एक ही दिशा में क्रॉस करना, पालन और उम्र बढ़ने के तापमान को ठीक से नियंत्रित करना, और पुरुषों और महिलाओं का अलग-अलग विश्लेषण करना शामिल है। एक आउटक्रॉस से एफ 1 मक्खियों का उपयोग करने से सहज उत्परिवर्तन के लिए मस्तिष्क के होमोजीगस का विश्लेषण करने की संभावना कम हो जाती है। y का मानक क्रॉस [1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 वयस्क मादाओं के लिए y[1] w[1] वयस्क पुरुष मक्खियों के परिणामस्वरूप जीनोटाइप y की F1 संतानों में परिणाम होता है[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 मशरूम शरीर के सभी आंतरिक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और झिल्ली-बाध्य रिपोर्टर UAS-mCD8-GFP की अभिव्यक्ति को मशरूम निकायों और उनके अनुमानों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। परमा-ट्विन क्रॉस के लिए, वंश अनुरेखण प्रणाली को बंद रखने के लिए क्रॉस को हर समय 17 डिग्री सेल्सियस पर रहना चाहिए। यह सुनिश्चित करता है कि विकास के दौरान कोई विभाजित कोशिकाओं को लेबल नहीं किया जाता है और केवल वयस्क-जन्मे न्यूरॉन्स और ग्लिया को लेबल किया जाता है। इस अंत तक, फ्लाई रूम को 17 डिग्री सेल्सियस पर भी बनाए रखा जा सकता है। यद्यपि परमा-ट्विन सिस्टम 15 के प्रारंभिक विवरण ने 18 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों को पालने की सिफारिश की, यह महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि लेबलिंग का कारण बन सकता है।

स्थिरता के लिए, CO2 पैड पर नियंत्रण को अनियंत्रित मक्खियों को रखने की भी सिफारिश की जाती है क्योंकि कोई पीटीबीआई को बाहर ले जाता है। यह सुनिश्चित करता है कि मक्खियों के दोनों सेटों में समान संवेदनाहारी एक्सपोजर है। इसके अलावा, पुनरुत्पादन के लिए सिर को पूरी तरह से प्रवेश करना वांछनीय है। हालांकि, पैड के खिलाफ पिन की नोक को मोड़ने के लिए ध्यान नहीं रखा जाना चाहिए, जिससे यह भविष्य की चोटों के लिए अनुपयोगी हो जाता है। कुशल चिकित्सकों के लिए, पीटीबीआई मक्खियों को थोड़ा अनपेक्षित नुकसान होता है। फिर भी, चोट के दौरान मक्खी को स्थिर करने के लिए वक्ष पर बहुत मुश्किल से दबाना घातक हो सकता है। अनपेक्षित चोट की सीमा का आकलन करने का एक तरीका पीटीबीआई मक्खियों की मृत्यु दर को 24 घंटे की चोट के बाद निर्धारित करना है। एकतरफा घायल मक्खियों के लिए, यह शुरुआती लोगों के लिए 50% या उससे अधिक हो सकता है। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि देखे गए परिणाम पीटीबीआई के कारण हैं और अनपेक्षित चोट के कारण नहीं हैं, यह सलाह दी जाती है कि शुरुआती कई हफ्तों में दैनिक ~ 20 मक्खियों पर पीटीबीआई का प्रशासन करने का अभ्यास करते हैं और परिणामस्वरूप मस्तिष्क का विश्लेषण नहीं करते हैं जब तक कि 24 घंटे की मृत्यु दर लगातार <10% न हो।

केंद्रीय मस्तिष्क PTBI द्वारा प्रेरित प्रसार की मात्रा को मापने के लिए, एंटी-फॉस्फोहिस्टोन H3 (PH3) इम्युनोस्टेनिंग और 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) निगमन दोनों को नियोजित किया जा सकता है। एंटी-पीएच 3 मेटाफ़ेज़ से पहले और पूरे मेटाफ़ेज़ में कोशिकाओं को लेबल करता है, जो सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के केवल एक अंश तक पहचान को सीमित करता है। इस प्रकार, विरोधी PH3 धुंधला प्रसार की केवल एक आंशिक झलक प्रदान करता है। EdU एक थाइमिडिन एनालॉग है जिसे नए संश्लेषित डीएनए में शामिल किया जा सकता है। चोट से पहले और बाद में मक्खियों ईडीयू को खिलाने से, उन कोशिकाओं की अधिक पूर्ण तस्वीर प्राप्त करना संभव है जो या तो विभाजित हो रहे हैं या चोट के बाद विभाजित हो गए हैं। तथ्य यह है कि किसी भी कोशिकाओं को विभाजित करने वाले स्थायी रूप से चिह्नित किए जाते हैं, धीरे-धीरे साइकिल चलाने वाली कोशिकाओं की पहचान के लिए दोनों सहायक होते हैं और प्रारंभिक प्रसार के बाद कोशिकाओं के अस्तित्व को परखते हैं। अस्पष्ट कारणों से, लेकिन शायद रक्त-मस्तिष्क बाधा की सीमित पारगम्यता के कारण, ईडीयू लेबलिंग अक्षम है और वयस्क मस्तिष्क में सेल प्रसार की रिपोर्ट करता है। यह पीएच 3 + और ईडीयू + कोशिकाओं की समान संख्या से स्पष्ट है, दोनों नियंत्रण और प्रयोगात्मक दिमाग में 24 घंटे के बाद पीटीबीआई पर और यह देखकर कि पर्मा-ट्विन क्लोन में नई कोशिकाओं का केवल एक सबसेट EdU16 को शामिल करता है। अधिकतम लेबलिंग के लिए, ईडीयू के साथ मक्खियों को पूर्व-फ़ीड करना आवश्यक है क्योंकि घायल मक्खियां पीटीबीआई के बाद कई घंटों तक खिलाना फिर से शुरू नहीं करती हैं। ईडीयू समाधान में खाद्य रंग जोड़कर और पेट के क्यूटिकल 16 के माध्यम से आंत में डाई की मात्रा की निगरानी करके खिलाने का आकलन किया गया था।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि हमने चरण 4 में मस्तिष्क विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रदान किया है, वैकल्पिक तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। इनमें से कई पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 20,21,22 में उपलब्ध हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शक्तिशाली आनुवंशिक और आणविक उपकरणों के साथ एक कम लागत वाला मॉडल प्रदान करता है जिसका उपयोग कई ऊतकों के अंतर्निहित उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें आंत और तंत्रिका तंत्र के घटक शामिल हैं। एक उपन्यास और पुनरुत्पादक चोट मॉडल जिसका उपयोग मस्तिष्क की चोट की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, यहां उल्लिखित है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त डेटा इस विचार का समर्थन करता है कि वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क प्रोलिफेरेटिव क्षमता को बरकरार रखता है, चोट के जवाब में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है। ये अवलोकन वयस्क न्यूरोजेनेसिस की सीमा और इसके अंतर्निहित आणविक तंत्र दोनों की आगे की जांच की गारंटी देते हैं। एक बार जब तंत्रिका पुनर्जनन में शामिल घटकों को इस प्रणाली में पहचाना जाता है, तो हम वयस्क ड्रोसोफिला न्यूरोजेनेसिस के अपने ज्ञान को मनुष्यों में परिवर्तित कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए स्टेसी रिमकस और बेकी काटज़ेनबर्गर के आभारी हैं और परमा-ट्विन स्टॉक साझा करने के लिए एडुआर्डो मोरेनो के लिए। हम बैरी Ganetzky और डेविड Wassarman जीवंत चर्चा है कि निस्संदेह विज्ञान और केंट Mok, Cayla Guerra, और बेली Spiegelberg प्रयोगशाला में उनके योगदान के लिए सुधार के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. FasII एंटीबॉडी को कोरी गुडमैन द्वारा विकसित किया गया था और विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किया गया था, जिसे एनआईएच के एनआईसीएचडी द्वारा बनाया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए 52242 में बनाए रखा गया था। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश ड्रोसोफिला उपभेदों को ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (BDSC) से प्राप्त किया गया था; एनआईएच P40OD018537)। यह काम NIH T32 GM007133 (KLC) द्वारा समर्थित था; एनआईएच NS090190 (GBF); एनआईएच एनएस 102698 (जीबीएफ); विस्कॉन्सिन ग्रेजुएट स्कूल विश्वविद्यालय (GBF); और UW-मैडिसन महिला विज्ञान और इंजीनियरिंग नेतृत्व संस्थान (WISELI) (GBF) में।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 disposable scalpels Santa Cruz Biotechnology sc-395923 used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection
150 mm diameter black Sylgard dishes Dow 1696157 made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection
18 mm coverslips any for mounting brains on microscope slides
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher D1306 for immunohistochemistry
70% Ethanol made from 95% ethanol sourced variously
anti-mouse Cy5 Jackson ImmunoResearch 715-175-151 for immunohistochemistry
anti-rabbit 568 ThermoFisher A11036 for immunohistochemistry
bovine serum albumin (BSA) SIgma Aldrich A7030 for immunohistochemisty
Clear nail polish any for sealing coverslips
Click-It EdU labeling kit InVitrogen C10640 to detect newly synthesized DNA
CO2 bubbler Genesee Scientific 59-181 for anesthesia
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 for anesthesia
CO2 regulator and supply any for anesthesia
Confocal microscope any for imaging fixed, stained and mounted brains
cotton plugs Genesee Scientific 51-101 for EdU labeling
Drosophila vials Genesee Scientific 32-109 for EdU labeling
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) components sourced from various companies for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0
Formaldehyde Sigma Aldrich 252549 for fixing adult brains, added to PEM
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round Tisch Scientific 1003-323 for EdU labeling
Microfuge tubes any for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins
Microscope slides any for mounting brains
Minutien pins Fine Science Tools 26002-10 for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod
mouse anti-Fasiclin II Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4-s for immunohistochemistry
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor Electron Microscopy Sciences SFA-GR fluorescence setup for dissecting microscope
P20, P200 and P1000 pipettors and tips any for measuring solutions
phosphate buffered saliine (PBS) components sourced from various companies for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) components sourced from various companies for washing dissected brains
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) components sourced from various companies blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies
rabbit anti-PH3 Santa Cruz Biotechnology, Inc sc-8656-R for immunohistochemistry
Reinforcement labels Avery 5721 to maintain space between the microscope slide and the coverslip
Size 0 paintbrushes any to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443
Two pair of #5 watchmakers forceps Fine Science Tools 11255-20 used to hold the Minutien pins and for brain dissections
Vectashield Vector Laboratories H-1000 mounting medium for microscope slides

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 176
उत्तेजक और <em>ड्रोसोफिला</em> केंद्रीय मस्तिष्क में वयस्क न्यूरोजेनेसिस का विश्लेषण
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Crocker, K. L., Ahern-Djamali, S., Boekhoff-Falk, G. Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain. J. Vis. Exp. (176), e63182, doi:10.3791/63182 (2021).

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