Summary
Denne artikel indeholder detaljerede protokoller for at påføre gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI) til voksen Drosophila og undersøge den resulterende neurogenese.
Abstract
De molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for neurogenese som reaktion på sygdom eller skade, er ikke godt forstået. Men, forståelse af disse mekanismer er afgørende for at udvikle neurale regenerative behandlinger. Drosophila melanogaster er en førende model for undersøgelser af neural udvikling, men historisk set ikke er blevet udnyttet til at undersøge voksne hjerne regenerering. Dette skyldes primært, at den voksne hjerne udviser meget lav mitotisk aktivitet. Ikke desto mindre udløser gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI) til den voksne Drosophila centralhjerne generationen af nye neuroner og nye glia. De kraftfulde genetiske værktøjer, der er tilgængelige i Drosophila kombineret med den enkle, men strenge skadesprotokol, der er beskrevet her, gør nu voksen Drosophila-hjerne til en robust model til neural regenerationsforskning. Forudsat her er detaljerede instruktioner for (1) gennemtrængende skader på den voksne centrale hjerne og (2) dissektion, immunohistochemistry, og billeddannelse post-skade. Disse protokoller giver meget reproducerbare resultater og vil lette yderligere undersøgelser til dissekere mekanismer underliggende neural regenerering.
Introduction
Skader på hjernen og nervesystemet er en væsentlig årsag til død og handicap på verdensplan. Omkring 1,5 millioner amerikanere lider traumatiske hjerneskader (TBI) hvert år1, mens en anslået 6 millioner personer i USA alene lider af neurodegenerative sygdomme, såsom Parkinsons og Alzheimers sygdom2. Både sygdom og skade på hjernen kan forårsage neural degeneration, hvilket fører til sensoriske, kognitive og motoriske defekter3. Udvikling af terapeutiske strategier for reparation af menneskers hjerne har været svært på grund af hjernens komplekse fysiologi. Modelorganismer som Drosophila melanogaster giver et simpelt system til at identificere de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration og potentielle terapeutiske mål4.
Frugtfluen Drosophila melanogaster har været en stærk modelorganisme i mere end et århundrede, der fremmer områderne genetik, udviklingsbiologi og neurovidenskab5,6. Drosophila hjernen består kun ~ 90.000 neuroner7, en million gange færre end den gennemsnitlige menneskelige hjerne8, men de har mange ligheder. Både menneskelige og flyve hjerner udnytte neurotransmittere GABA, glutamat, acetylcholin, og biogene aminer dopamin og serotonin9. Drosophila og menneskelige neuroner fungerer også på samme måde, med en fælles synaptisk arkitektur og analoge neurale celletyper10. Drosophilas mindre hjernestørrelse og tilgængeligheden af avancerede genetikteknikker i kombination med bevarelsen af molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismer mellem Drosophila og pattedyr gør det muligt for Drosophila-forskere at stille spørgsmål, der er upraktiske eller vanskelige at besvare i pattedyrmodeller.
Vores nuværende forståelse af voksen neurogenese i Drosophila, både under homøostase og efter skade, er fortsat begrænset. Mere er kendt om neurogenese under normal udvikling. For eksempel skabes neuroner og glia under udvikling fra prækursorer celler, kaldet neuroblaster10,11. Mindst tre forskellige typer neuroblaster er blevet skelnet i den centrale hjerne. Både type I og type II afstamning neuroblaster forlade cellecyklus ~ 20-30 h efter puparium dannelse12. I modsætning hertil svampen kroppen neuroblaster er de sidste til at opsige celledeling og gøre det via Reaper-afhængige apoptose ~ 85-90 h efter puparium dannelse13. Efter ekslosion, den voksne Drosophila hjernen har få dividere celler (~ 1 celle / hjerne), overvejende glia14. De voksne optiske lapper besidder langsomt cykling neuroblaster i stand til neurogenese15, mens den voksne centrale hjerne har ingen kendte neuroblaster. Manglen på neurale forfædre og begrænset cellespredning ligner stærkt situationen i den voksne pattedyrhjerne, hvilket understreger den potentielle relevans af mekanismerne for voksen neurogenese hos Drosophila for mennesker.
Opdagelsen af lave niveauer af voksen neurogenese i de voksne Drosophila optiske lapper efter skade15 førte til hypotesen om, at den voksne Drosophila centralhjerne også kunne være i stand til voksen neurogenese16. Denne protokol beskriver at skabe en streng, reproducerbar model af central hjerneskade hos voksne Drosophila, der kan bruges til at undersøge neurogenese i den voksne centrale hjerne. I betragtning af lighederne mellem human og Drosophila hjerne arkitektur og funktion, disse opdagelser kan føre til identifikation af kritiske mål for terapeutisk neurogenese i sårede og syge menneskelige hjerner.
Protocol
Denne protokol følger UW-Madisons retningslinjer for dyrepleje.
1. Generering af voksen Drosophila til PTBI
- For standardkorset skal du placere 20 jomfruer[1] m[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 voksne hunner og 10 y[1] w[1]17 voksne hanner flyver sammen i hætteglas (se Materialetabel), der indeholder mad. For at have et stort antal synkrone afkom skal du oprette 10-20 kors på samme tid. Standardkorset giver anledning til genotypens F1-afkom: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
- Hætteglassene placeres ved 25 °C til parring og æglægning. For at maksimere afkom, overføre forældre til nye hætteglas hver 2-4 dage, opretholde de tidligere hætteglas ved 25 °C. Kassér hvert hætteglas 18 dage efter, at forældrene først blev anbragt i det for at sikre, at der ikke er noget F2-afkom.
BEMÆRK: 3 sæt afkom ("brød") kan genereres fra hvert sæt forældre. - Check efter ~ 10 dage, når F1 afkom vil begynde at eclose.
- Hætteglassene placeres ved 25 °C til parring og æglægning. For at maksimere afkom, overføre forældre til nye hætteglas hver 2-4 dage, opretholde de tidligere hætteglas ved 25 °C. Kassér hvert hætteglas 18 dage efter, at forældrene først blev anbragt i det for at sikre, at der ikke er noget F2-afkom.
- Til slægtsundersøgelser skal du bruge F1 perma-twin hanner15 af genotype: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. For konsistens, gør dette kryds i samme retning hver gang.
- For at generere perma-twin hanner, placere 20 jomfru w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; karkar-GAL80ts/TM6B hunner og 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 voksne hanner sammen i hætteglas, der indeholder mad.
- Hætteglassene placeres ved 17 °C til parring og æglægning. Overfør forældre til hætteglas med ny mad hver 7. dag, og hold alle hætteglas ved 17 °C. Kassér hvert hætteglas 35 dage efter, at forældrene først blev anbragt i det for at sikre, at der ikke er noget F2-afkom.
- Check efter ~ 21 dage, når F1 afkom vil begynde at eclose.
2. Gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI; Figur 1)
- Sorter nyligt lukkede F1 fluer. Vælg unge mænd inden for 6 timer efter eclosion. Placer disse hanner i rene hætteglas, der indeholder mad, med 40 eller færre fluer pr. Hætteglas.
BEMÆRK: Dette opnås lettest midt om morgenen ved at bedøve fluer på CO2-puden og identificere voksne mænd, der stadig har meconium (synligt som et mørkt grønligt sted gennem bugvæggen) i deres tarme. - Forføde med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) (se materialetabel) i 6 timer før skaden, hvis de planlægger at mærke opdeling af celler med EdU. Se trin 3 for at få flere oplysninger.
- Sanitize Minutien stifter (se Tabel over materialer) i mindst 5 min ved at placere ~ 100 stifter i en 1,5 mL mikrocentrifuge rør fyldt med 70% ethanol.
- Saner CO2-puden og en pensel ved at sprøjte 70% ethanol og tørre tørt med et rent fnugfrit væv. Når værktøjerne er rene og tørre, overfør 40 eller færre sorterede F1-hanner tilbage på den rene pude.
- Adskil F1 mænd i 2 grupper på flyvepuden. En gruppe vil tjene som en kontrol, uskadte fluer. Den anden forsøgsgruppe vil blive udsat for PTBI.
- Træk 4-5 nye Minutien-stifter ud af mikrocentrifugrøret ved hjælp af pincet og placer dem nær kanten af CO2-puden . Under dissekeringsområdet skal du vælge en lige Minutien-pin med et skarpt punkt.
BEMÆRK: Brug af en enkelt Minutien pin til et eksperiment vil reducere variationen. Genbrug skarpe stifter. Anbring beskadigede eller stumpe stifter i et separat 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 70% ethanol til sikker bortskaffelse. - Hvis du arbejder med fluer fra standardkorset, skal du tænde stereomikroskopets lysdiodelampe (LED), der er udstyret med passende excitations- og emissionsfiltre til grønt fluorescensprotein (GFP). Dette tillader excitation ved 440-460 nM og tillader visualisering af 500-560 nM.
BEMÆRK: Med denne lampe og filter sæt, vil celle organer svampen kroppen fluorescere grøn gennem hovedet neglebånd (Figur 1C). For perma-twin fluer eller fluer af andre genotyper, en standard hvidt lys illuminator for stereo mikroskop kan bruges til at visualisere landemærker på hovedet neglebånd til målretning af skaden på svampen kroppen (Figur 1C). - Brug pinps til at samle op og holde den valgte Minutien pin i den ene hånd (for højrehåndede mennesker, dette er normalt højre hånd) og pensel i den anden (normalt venstre) hånd. Vælg en flue fra den eksperimentelle gruppe og placere fluen sådan, at du har en dorsal visning af hovedkapslen med fluens hoved til højre. Placer børsten på den forreste del af ryg brystkassen og skub forsigtigt ned for at stabilisere fluen.
- Sigt Minutien pin spids på champignon kroppens celle organer på højre side af hovedet og trænge ind i hovedet kapsel. Hvis du bruger landemærker, målrette ryghoved neglebånd mellem ocelli og dorsale rand af øjet (Figur 1).
- Når skaden er afsluttet, skal du bruge pensel til at skubbe hovedet forsigtigt af Minutien-stiften.
- Hvis du bruger hjernen til RNA-Seq eller qRT-PCR, skal du gøre en anden skade på venstre side af hovedet.
- Gentag trin 2.8-2.10 for at skade alle fluerne i forsøgsgruppen.
- Når alle fluer er kommet til skade, skal du placere kontrol og sårede fluer i mærkede, separate hætteglas, der indeholder mad. Læg hætteglassene vandret (dvs. på deres sider), mens fluerne kommer sig efter bedøvelsen og under efterfølgende aldring for at forhindre fluer i at blive fanget i maden.
- Placer standard cross fluer ved 25 °C, og perma-twin fluer ved 30 °C til alder.
- For fluer i alderen længere end 24 timer skal du placere dem på ren mad hver 1-2 dag.
3. EdU mærkning
- Forbered et lager på 10 mM 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) i dimethylsulfoxid (DMSO). Dette kan opbevares ved -20 °C i op til 12 måneder.
- 200 μL på 50 μM EdU i 10% saccharose. Pre-feed flyver med EdU i 6 timer før PTBI.
- Placer 200 μL på 50 μM EdU i 10% saccharose på et filterpapir af 23 mm rund klasse 3 (se Materialetabel) i et ellers tomt hætteglas.
- Læg fluerne i hætteglasset. Derefter forsegle hætteglasset med et bomuldsstik.
- Hætteglasset vandret i en befugtet inkubator ved 25 °C i 6 timer.
- Ptbi udføres som beskrevet i trin 2.3-2.10.
- Placer fluerne tilbage i det EDU-holdige hætteglas. Forsegl hætteglasset med et bomuldsstik.
- Hætteglasset vandret i en befugtet inkubator ved 25 °C i op til 24 timer. Følg et af nedenstående trin (trin 3.8.1-3.8.3).
- Dissekere og fiksere hjerner som beskrevet i trin 4 ved hjælp af fiksativ, vaskebuffer og blokeringsbuffer uden azid og med EdU-detektionsreaktionen udført før antistoffarvning.
- Fluerne overføres til et rent hætteglas, der indeholder et nyt filterpapir og 200 μL på 50 μM EdU i 10% saccharose. Hætteglasset vandret i en inkubator på 25 °C. Gentag hver 24 timer under mærkningens varighed. Derefter dissekeres og rettes hjerner som beskrevet i trin 4 ved hjælp af buffere uden azide med EdU-detektionsreaktionen, der blev udført før antistoffarvning.
- For at pulse-chase label med EdU, foder EdU for pulsperioden, overføre fluerne hver 24 timer til et rent hætteglas, der indeholder et nyt filterpapir og 200 μL på 50 μM i 10% saccharose. Efter pulsperioden (f.eks. 4 dage) overføres fluerne til et hætteglas, der indeholder standard Drosophila-mad. Hætteglasset placeres på siden i en inkubator på 25 °C i yderligere 3 dage. Derefter dissekeres og rettes hjerner som beskrevet i trin 4 ved hjælp af buffere uden azide med EdU-detektionsreaktionen, der blev udført før antistoffarvning.
4. Dissektion, immunohistochemistry og montering
- Der fremstilles 1,5 mL mikrocentrifugrør med 100 μL fiksativ: 4 % formaldehyd i PEM (100 mM piperazin-N,N'bis(2-ethanesulfonsyre) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0) (se Materialetabel) og læg på is.
BEMÆRK: Så mange som 20 hjerner af en enkelt genotype og tilstand kan behandles i et enkelt rør. - Forbered en dissektionsplade med en lille pool (~ 100 μL) af 70% ethanol og tre små puljer af fosfatbuffered saltvand (PBS; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7.0).
- Bedøve ~ 10 kontrol eller eksperimentelle fluer på en CO2 pad, der er blevet desinficeret med 70% ethanol.
- Adskil hovedet fra stammen af hver flyve ved hjælp af en skalpel.
- Saml hovederne med en pensel fugtet i 70% ethanol og læg hoveder i 2-5 minutter i ethanolpoolen på dissektionspladen.
BEMÆRK: Dette dehydrerer hjernen lidt og gør dem lettere at dissekere væk fra hovedbåndbånd. - Overfør hovederne til en ~ 100 μL pulje af PBS og dissekere hjernen, flytte hver hjerne til en ren ~ 100 μL pulje af PBS. Udfør dette ved hjælp af to par Watchmakers forceps at åbne bagsiden af hovedet neglebånd og holde neglebånd med et par sammentrækninger, mens forsigtigt nysgerrige hjernen ud af neglebånd ved hjælp af den lukkede spids af det andet par sammentrækninger.
- Overfør de dissekerede hjerner til et mikrocentrifugerør, der indeholder 100 μL af fastgørelsesopløsningen ved hjælp af en P200 pipettor udstyret med en plastikspids, der er skåret og skrå for at tillade indtrængen af hjernerne.
- Fix i 20-25 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt rettelsen med enten en P200 eller en glaspipette.
- Vask de faste hjerner fire gange med 1 mL 'PT' (PBS plus 0,1% Triton X-100), så hjernen kan nøjes i flere minutter mellem hver vask.
BEMÆRK: Hvis hjerner ikke sætter sig hurtigt mellem vaskene, vil de sandsynligvis have stadig fedt krop og / eller luftrør fastgjort. - Blok prøver i 1 mL PBS plus 0,1% Triton X-100 og 2% kvæg serum albumin (PBT) for ~ 1 time ved stuetemperatur.
- Blokeringsopløsningen fjernes, og inkuber prøverne med 100 μL primær antistofopløsning natten over ved 4 °C i PBT. De primære antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse, er kanin anti-PH3 (1:500) og museanti-Fasiclin II (1:20) (se Materialetabel).
- Vask prøver fem gange med 1 minut PT, så hjernen kan nøjes i flere minutter mellem hver vask.
- Den endelige vask og inkubation i 100 μL sekundær antistofopløsning natten over ved 4 °C fjernes. De sekundære antistoffer, der anvendes her, er antikanin 568 (1:400) og antimuse Cy5 (1:100) (se Materialetabel).
- Vask prøver fem gange med 1 minut PT, så hjernen kan nøjes i flere minutter mellem hver vask. Under den endelige vask tilsættes 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI; 1:100 af en 10 μM opløsning) i 10 min for at plette kernerne. Fjern vasken, så der efterlades 50-100 μL i hvert rør.
- Forbered mikroskop slides ved at placere en enkelt, selvklæbende forstærkning etiket på midten af hvert dias og en 50 μL dråbe anti-fade montering medier i midten af hver etiket (se Tabel af materialer). Forstærkningsetiketten holder coverlip lidt over diasene og forhindrer de monterede hjerner i at blive alt for fladt.
- Overfør forsigtigt hjernen fra hvert mikrocentrifugerør til et forberedt dias med så lidt vaskebuffer som muligt ved hjælp af en P200 udstyret med et snit og skrå plastspids. Så mange som 10 hjerner kan monteres på et enkelt dias.
- Brug sammentak til forsigtigt at flytte hjernen, før du placerer en coverlip på hver slide og forsegling dias med neglelak. Orient hjernen med enten bageste side op eller forreste side op, men bør ikke røre hinanden.
BEMÆRK: Da det er svært at opnå konfokale billeder af høj kvalitet gennem en hel hjerne, skal nogle hjerner monteres i hver retning. - Opbevar forberedte dias fladt og i mørke ved 4 °C indtil billeddannelse. For langtidsopbevaring (op til 1 år) kan dias opbevares ved -20 °C.
5. Konfokal billeddannelse
BEMÆRK: Billedhjerner ved hjælp af et laserscanningsmikroskop med excitationslasere og emissionsfilterkuber, der passer til henholdsvis DAPI og de fluorescerende sekundære antistoffer (dvs. 405 nm, 488 nm og 568 nm, 633 nm).
- Tænd for strømmen af mikroskop, lasere, controller og computer.
- Åbn anskaffelsessoftwaren.
- Vælg op til fire kanaler i anskaffelsestilstand, og angiv parameteren for sekventiel scanning af de ønskede kanaler. Forøg lasereffekten for hver kanal til 5-10%.
- Placer et dias på mikroskopet.
- Vælg en hjerne, der skal afbildes ved hjælp af epifluorescence vedhæftet fil (se Tabel over materialer).
- Vælg 1024 x 1024 pixel som rammedimension i anskaffelsestilstand.
- I anskaffelsestilstand skal du vælge Z-stack-indstillingen, angive, at Z-stakken skal tages ved 2 μm sektioner, og fokusere gennem prøven og vælge de øverste og nederste fokalplaner, der skal afbildes.
- Saml Z-stack billeder af hele hjerner ved hjælp af en 20x objektive og specifikke hjerneområder såsom champignon krop ved hjælp af en 60x mål.
6. Dataanalyse
- Kvantificer de spredte celler og antallet af perma-twin kloner manuelt og / eller ved hjælp af billedanalyse software (se Tabel over materialer). Når du bruger software, skal du vælge interesseområder med områder på mindst 10 μm.
Representative Results
PTBI stimulerer cellespredning
For at bestemme omfanget af neurogenese efter en central hjerne PTBI blev det proliferative respons målt hos unge voksne mænd indsamlet og såret inden for 6 timer af eclosion. En signifikant stigning i spredningen blev observeret 24 timer efter skade ved hjælp af anti-fosfohistone 3 (PH3), en markør for celler, der aktivt gennemgår mitose. Ca. 3 PH3+-celler i kontrolcentralhjerner og 11 PH3+-celler i de skadede centrale hjerner observeres 24 timer efter PTBI (Figur 2A-D). Størstedelen af skillecellerne er placeret i nærheden af skadestedet. En anden analyse for celledeling blev brugt til at kvantificere den kumulative celle spredning fra en enkelt skade og til at vurdere, i hvilket omfang de nyoprettede celler overlevede. 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) er en thymidin analog, der kan indarbejdes i nyligt syntetiseret DNA og permanent mærke celler, der har gennemgået DNA-syntese. Fluer fik en 4-dages puls af EdU, efterfulgt af en 3-dages jagt. Dette afslørede, at de mærkede celler var levedygtige og overlevede mindst 3 dage efter spredning. Ved 7 dage var der i gennemsnit 2 EdU+ celler i kontrolcentralhjerner og i gennemsnit 11 EdU+-celler i de skadede centrale hjerner (figur 2E). Dette svarer til de opnåede resultater 24 timer efter skade ved hjælp af PH3 antistof. Når cellespredning måles ved 14 dage, de uskadte kontroller i gennemsnit 1 EdU + celle pr centrale hjerne, mens de sårede hjerner i gennemsnit 29 EdU + celler (Figur 2E), der viser, at cellespredning fortsætter i det mindste i den anden uge efter en PTBI.
Cellespredning er aldersafhængig
Den største proliferative respons i den centrale hjerne blev observeret inden for de første 24 timer efter eclosion (figur 3). Ved 7 dage efter eclosion forårsager en gennemtrængende skade stadig en betydelig stigning i spredning med et gennemsnit på 6 PH3+-celler pr. central hjerne. Stadig, ved 14 dage efter eclosion, evnen for celler til at opdele følgende PTBI falder betydeligt til 1 dividere celle, svarende til kontrol hjerner (Figur 3). Potentialet for cellespredning efter PTBI er således aldersafhængigt.
Nyoprettede neuroner kan projicere til at korrigere målområder
For at evaluere neural regenerering post-PTBI blev perma-twin mærkningssystemet15 brugt. Perma-twin afstamning sporing permanent etiketter dividere celler og deres afkom med en grøn fluorescerende protein (GFP) eller rød fluorescerende protein (RFP)15. Flere perma-twin kloner blev påvist i sårede prøver, på 2 dage og 2 uger, end i kontrol (Figur 4A-E). Især var der nye champignon krop neuroner i ~ 50% af PTBI hjerner 2 uger efter skade (Figur 4N). Disse nye neuroner projicerede deres dendritter korrekt til svampekroppens blomsterbæger og deres axoner passende til svampekroppens lapper (Figur 4D, F, G). Dette indikerer, at de nyoprettede celler kan være funktionelle neuroner involveret i reparation af de beskadigede svampelegemer. Andre områder af hjernen, der syntes at regenerere omfatter ellipsoid krop (EB) (Figur 4H, I), antenner lapper (AL) (Figur 4J, K), og laterale horn (LH) (Figur 4L,M), som besad store kloner ca 26%, 26%, og 20% af tiden, henholdsvis (Figur 4N). Disse resultater understreger nytten af dette system til undersøgelse af voksen neurogenese. En foreslået model for hændelsesforløbet efter PTBI og der fører til generering af nye neuroner er vist i figur 5.
Figur 1: Gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI) til den voksne Drosophila centrale hjerne. (A) Skematisk af ydersiden af en voksen flyve hoved. Dette er en frontal visning. Således er højre side af dyret til beskuerens venstre. (B) Skematisk af det indre af en voksen Drosophila hoved med skade bane angivet i grå. Dette er en posterior visning. Således er højre side af hjernen i dette billede og efterfølgende tal til højre. Central hjerne PTBI påvirker flere hjernestrukturer, herunder svampekroppen (grøn) og væv uden for hjernen, herunder fedtkroppen (blå) og hæmocytter (rød). CB = central hjerneregion. OL= optisk lap region. (C) Dorsal visning af et levende voksent hoved, hvor svampekroppe (pilespidser) er mærket med et grønt fluorescerende protein (GFP). Dette er 'standardgenotypen' (se teksten for detaljer). PTBI-protokollen resulterer i reproducerbar skade på svampekroppene. Dette tal er tilpasset fra Reference16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PTBI stimulerer cellespredning. Ikke-skadede kontrolskemaer (A) og PTBI (B). De blå bokse i øverste højre hjørne angiver de hjerneområder, der vises ved højere forstørrelse i paneler (C) og (D). (C,D) PH3 antistof (rød) blev brugt til at analysere cellespredning 24 timer efter skade. I kontrol hjerner (C), der er få PH3 + celler og ingen i nærheden af MB. Men i PTBI hjerner (D), der er PH3 + celler i nærheden af MB. E) Kvantificering af voksende celler. Tallene afspejler spredte celler gennem hele hjerner, ikke kun i nærheden af svampekroppen. Ved 24 timer havde uskadte kontrolhjerner i gennemsnit 3 PH3+ celler/hjerne (n = 11 hjerner, 28 celler), mens 24 timer efter PTBI havde hjerner i gennemsnit 11 PH3+ celler/hjerne (n = 17 hjerner, 181 celler). På 7 dage har ikke-skadede kontroller få EdU+ celler, med et gennemsnit på 2 EdU + celler / hjerne (n = 15 hjerner, 24 celler), mens 7-dages post-PTBI hjerner havde et gennemsnit på 11 EdU + celler / hjerne (n = 22 hjerner, 238 celler). Efter 14 dage har ikke-skadede kontroller i gennemsnit 1 EdU+ celle/hjerne (n = 8 hjerner,11 celler), mens 14-dages post-PTBI-hjerner i gennemsnit har 29 EdU+ celler/hjerne (n = 14 hjerner, 400 celler). Til dette sæt eksperimenter blev unge voksne mænd inden for 6 timer af ekslosion brugt. Uparrede t-test af kontrol- og PTBI-prøver ved udbytteværdierne på henholdsvis p<0.0001, p<0.0001 og p<0.0002. Fejllinjer afspejler standardafvigelsen (SD). Dette tal er tilpasset fra Reference16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den proliferative reaktion på PTBI falder med alderen. For at undersøge, om alder påvirker mængden af cellespredning, der opstår efter skade, blev nyligt lukkede voksne hanner sammenlignet med dyr i alderen til 7 dage, 14 dage og 28 dage før PTBI ved hjælp af anti-PH3 til analysecellespredning 24 timer efter skade. Fluer såret inden for 6 timer af eclosion havde et gennemsnit på 11 PH3 + celler / hjerne (n = 17 hjerner, 182 celler) sammenlignet med et gennemsnit på 3 PH3 + celler / hjerne i aldersmatchede kontroller (n = 11 hjerner, 28 celler). Fluer i alderen til 7 dage, derefter udsat for PTBI, havde et gennemsnit på 6 PH3 + celler / hjerne (n = 11 hjerner, 65 celler) sammenlignet med aldersmatchede kontroller med et gennemsnit på 2 PH3 + celler / hjerne (n = 5 hjerner, 12 celler). Når fluer blev alderen til 14 dage før PTBI og analyseret 24 timer senere, var der et gennemsnit på 1 PH3 + celle / hjerne (n = 8 hjerner, 11 celler) svarende til aldersmatchede kontroller, som også i gennemsnit 1 PH3 + celle / hjerne (n = 4 hjerner, 2 celler). 28-dages uskadt kontrol (n = 4, 1 celle) og PTBI (n = 3, 1 celle) flyver begge i gennemsnit 0 PH3+-celler/hjerne. Ubetalte t-tests for PTBI til at kontrollere sammenligninger på disse 4-tidspunkter er p<0.0001, p<0.04, p<0.07 og p<0.84, henholdsvis. Dette tal er tilpasset fra Reference16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Perma-twin afstamning sporing viser hjernen regenerering og passende målretning af axoner efter PTBI. Den perma-twin afstamning-sporing system15 blev udnyttet til at analysere neurogenese efter PTBI. Dette system permanent etiketter dividere celler og afkom med en grøn fluorescerende protein (GFP) eller rød fluorescerende protein (RFP). Fluer blev opdrættet ved 17 °C for at holde systemet slukket under udviklingen. F1 hanner, der transporterer perma-twin transgener blev indsamlet ved ekslosion, derefter såret og placeret på 30 °C for at komme sig i 2 eller 14 dage. (A) I 2-dages uskadt kontrol, der er nogle GFP + celler spredt over hele hjernen. (B) Efter 14 dage er der relativt få GFP+-celler til stede i den centrale kontrolhjerne. (C) Til sammenligning har 2-dages skadede hjerner flere GFP+-celler, der har tendens til at klynge sig i nærheden af skaden (pilespids). (D) Efter 14 dage efter skaden er der store kloner i nærheden af skadestedet. Nogle af disse kloner har axoner, der projicerer langs svampekroppene (pilespids). Kun GFP-kanalen vises her; der var lignende RFP+ kloner i PTBI-prøverne. (E) Antallet af kloner stiger over tid efter PTBI.Control uskadte hjerner (n = 13) har et gennemsnit på 10 kloner på 2 dage, mens 2-dages PTBI hjerner (n = 20) har et gennemsnit på 23 kloner (s<0,00002). På 7 dage havde kontrolhjerner i gennemsnit 9 kloner pr. hjerne (n = 18), mens 7-dages PTBI-hjerner i gennemsnit havde 39 kloner pr. hjerne (n = 16) (p-værdi<0,00000002). Dette er betydeligt mere end antallet af kloner set på 2 dage efter skade (p-værdi<0,0009). I 14-dages kontrol hjerner, der er et gennemsnit på 10 kloner per hjerne, som ikke er væsentligt forskellig fra 2-dages og 7-dages kontrol. Men på 14 dage efter PTBI er der i gennemsnit 66 GFP+ kloner, hvilket er betydeligt mere end enten aldersmatchede kontroller (p<0.0000003) eller 2-dages post-PTBI-hjerner (p-værdi<0.0001). Fejllinjer afspejler SD. (F-M) PTBI stimulerer klondannelse i flere områder i hjernen. Paneler på venstre side er skemaer over hjerneområder, hvor store kloner blev fundet 14 dage efter PTBI (A, H, J, L). Paneler til højre viser høje forstørrelser af repræsentative hjerner (G, I, K, M). Mange 14-dages hjerner havde kloner, der projicerede til bestemte målområder. Disse omfattede svampekroppen (MB) (F,G), ellipsoidkroppen (EB) (H,I), antennellap (AL) (J, K) og sidehornet (LH) (L,M). (N) Både klon antal og klon størrelse stige med tiden post-PTBI.Andelene af hjerneområder med store kloner blev beregnet til 2, 7 og 14 dage i kontrol og sårede hjerner. På 2 dage, ~ 8% af kontrol hjerner (n = 13) viste AL kloner, mens der ikke var nogen AL kloner i 2-dages skadede hjerner (n = 20). I 7-dages kontrol hjerner (n = 18), 6% havde AL og 6% havde EB kloner. På 7 dage efter PTBI (n = 16), 6% af hjernen havde også AL kloner, 6% havde EB kloner, og 19% havde store MB kloner. På 14 dage, kontrol hjerner (n = 9) ikke udvise nogen specifikke områder med kloner, mens 47% af PTBI hjerner (n = 15) havde MB kloner, 20% af PTBI hjerner havde AL kloner, og 27% af PTBI hjerner havde EB kloner, og 27% havde LH kloner. Dette tal er tilpasset fra Reference16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenfattende model for regenerering efter gennemtrængende traumatisk hjerneskade (PTBI). Hos unge voksne Drosophila, der er quiescent neuroblast-lignende celler i den centrale hjerne, der mangler udtryk for kanoniske neuroblast gener. Ved 24 timer efter PTBI aktiveres de quiescent neuroblastlignende celler, udtrykker neuroblastgener og er begyndt at formere sig. På både 4 timer og 24 timer efter PTBI, er der en bølge af celledød16. På 7 dage, spredningen er stadig høj, og mange af de nye celler har vedtaget modne celle identiteter, bliver neuroner eller glia. På 14 dage efter PTBI, store kloner af nye neuroner med axoner og dendritter korrekt projicere til deres respektive målområder. Lokomotoriske defekter genoprettes også med 14 dage, hvilket tyder på, at voksen Drosophila kan regenerere funktionelt og strukturelt. Dette tal er tilpasset fra Reference16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Selv om gennemtrængende skader på den voksne Drosophila hjerne er blevet beskrevet tidligere15,17,18, disse skader fokuseret på de optiske lapper og ikke den centrale hjerne. Desuden mangler der indtil videre detaljerede instruktioner til, hvordan skaderne skal udføres. Denne protokol beskriver en model for gennemtrængende skade på den voksne Drosophila centralhjerne, der gengiver statistisk signifikante beviser for voksen neurogenese efter PTBI.
Reproducerbarheden af denne PTBI-protokol skyldes til dels svampekroppen som skadesmålområdet. Svampekroppen er stor, bestående af ~ 2200 neuroner med komplekse dendrit og axon arbors i store og meget stereotype arrays18. Cellelegemerne af svampekropsneuroner ligger nær hjernens overflade og kan visualiseres gennem hovedktikulaen ved hjælp af udtrykket af grønt fluorescerende protein (GFP) (Figur 1C). Mushroom krop prækursorer er de sidste neurale stamceller til at gennemgå apoptose under udvikling13,12,19. Således er mange champignon krop neuroner er temmelig unge på tidspunktet for ekslosion. Dette førte til hypotesen om, at svampen kroppen kan have mere mitotisk potentiale end andre hjerneområder16. Derudover er svampekroppen kritisk for læring og hukommelse18. Dette gør det muligt at spørge, om PTBI-udløst neurogenese fører til funktionel genopretning.
Andre faktorer, der bidrager til reproducerbarheden af resultaterne omfatter ved hjælp af outcrossed fluer af konsekvente genotyper, udfører krydser i samme retning hver gang, præcist kontrollere opdræt og aldring temperaturer, og analysere mænd og kvinder separat. Ved hjælp af F1 fluer fra en outcross reducerer sandsynligheden for at analysere hjerner homozygot for spontane mutationer. Standardkorset af y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 voksne hunner til y[1] w[1] voksne hanfluer resulterer i F1 afkom af genotypen y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 er udtrykt i alle iboende neuroner af svampen kroppen og drev udtryk for membran-bundet reporter UAS-mCD8-GFP tillader visualisering af champignon organer og deres fremskrivninger. For perma-twin-krydsene skal kors til enhver tid forblive på 17 °C for at holde lineagesporingssystemet slukket. Dette sikrer, at ingen dividere celler er mærket under udvikling, og at kun voksen-fødte neuroner og glia er mærket. Til dette formål kan flyverummet også opretholdes ved 17 °C. Selv om den oprindelige beskrivelse af perma-twin system15 anbefalede opdræt flyver ved 18 °C, kan dette føre til betydelig baggrund mærkning.
For konsistens anbefales det også at holde kontrollen uskadte fluer på CO2-puden , da man udfører PTBI. Dette sikrer, at begge sæt fluer har identisk bedøvelseseksponering. Derudover er det ønskeligt, at reproducerbarheden helt trænger ind i hovedet. Man skal dog passe på ikke at bøje spidsen af stiften mod puden, hvilket gør den ubrugelig til fremtidige skader. For dygtige praktikere er der lidt utilsigtet skade på PTBI fluer. Ikke desto mindre kan det være dødeligt at trykke for hårdt på brystkassen for at stabilisere fluen under skade. En måde at vurdere omfanget af den utilsigtede skade på er at kvantificere PTBI-fluernes dødelighed på 24 timer efter skaden. For ensidigt skadede fluer kan dette være 50% eller højere for begyndere. For at sikre, at observerede resultater skyldes PTBI og ikke utilsigtet skade, anbefales det derfor, at begyndere øver sig i at administrere PTBI på ~ 20 fluer dagligt over flere uger og ikke analyserer de resulterende hjerner, før 24 timers dødeligheden konsekvent er <10%.
For at kvantificere mængden af spredning stimuleret af central hjerne PTBI, både anti-fosfohistone H3 (PH3) immunstaining og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering kan anvendes. Anti-PH3 etiketter celler før og i hele metafase, begrænse detektion til kun en brøkdel af de aktivt dividere celler. Således giver anti-PH3 farvning kun et delvist glimt af spredning. EdU er en thymidin analog, der kan indarbejdes i nyligt syntetiseret DNA. Ved fodring fluer EdU før og efter skade, er det muligt at få et mere komplet billede af de celler, der enten deler eller har delt efter skaden. Det faktum, at alle celler, der deler er permanent markeret er nyttigt både for identifikation af langsomt cykling celler og analysere overlevelsen af celler efter indledende spredning. Af uklare årsager, men måske på grund af begrænset gennemtrængelighed af blod - hjerne barrieren, EdU mærkning er ineffektiv og underrapporterer cellespredning i den voksne hjerne. Dette fremgår af det samme antal PH3+ og EdU+-celler i både kontrol- og eksperimentelle hjerner ved 24 timer efter PTBI og ved at observere, at kun en delmængde af nye celler i perma-twin kloner inkorporerer EdU16. For maksimal mærkning er det vigtigt at pre-feed fluerne med EdU, fordi skadede fluer ikke genoptager fodring i flere timer efter PTBI. Fodring blev vurderet ved at tilføje mad farve til EDU løsning og overvågning af mængden af farvestof i tarmen gennem abdominal kutikula16.
Det skal bemærkes, at mens vi har givet en hjerne dissektion protokol i trin 4, alternative teknikker kan anvendes. Flere af disse er tilgængelige i tidligere offentliggjorte protokoller20,21,22. Drosophila melanogaster tilbyder en billig model med kraftfulde genetiske og molekylære værktøjer, der kan bruges til at studere de mekanismer, der ligger til grund for regenerering af flere væv, herunder tarmen og komponenterne i nervesystemet. En ny og reproducerbar skadesmodel, der kan bruges til at studere reaktionen på hjerneskade, er skitseret her. Data opnået ved hjælp af disse protokoller understøtter ideen om, at den voksne Drosophila centralhjerne bevarer den proliferative evne og genererer nye neuroner som reaktion på skade. Disse observationer berettiger yderligere undersøgelse af både omfanget af voksen neurogenese og dens underliggende molekylære mekanismer. Når de komponenter, der er involveret i neural regenerering er identificeret i dette system, kan vi konvertere vores viden om voksne Drosophila neurogenese til mennesker.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er Stacey Rimkus og Becky Katzenberger taknemmelige for teknisk bistand og Eduardo Moreno for at dele perma-twin lagrene. Vi vil gerne takke Barry Ganetzky og David Wassarman for livlige diskussioner, der utvivlsomt forbedret videnskab og Kent Mok, Cayla Guerra, og Bailey Spiegelberg for deres bidrag til laboratoriet. FasII antistofferne blev udviklet af Corey Goodman og fremstillet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af NIH's NICHD og vedligeholdt på The University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. De fleste af de Drosophila stammer, der anvendes i denne undersøgelse blev fremstillet fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Dette arbejde blev støttet af NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); University of Wisconsin Graduate School (GBF); og UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
- Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
- NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
- Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
- Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
- Brace, E. J., DiAntonio, A.
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
- Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
- Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
- von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9 (2009).
- Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E.
- Crocker, K. L., et al.
- Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
- Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).
