Summary
Este protocolo descreve um modelo animal composto com exposição a material particulado (PM) que agrava a isquemia miocárdica com aterosclerose.
Abstract
Os problemas de saúde causados pela poluição do ar (especialmente a poluição das partículas) estão recebendo cada vez mais atenção, especialmente entre pacientes com doenças cardiovasculares, o que agrava transtornos complicados e causa mau prognóstico. O modelo simples de isquemia miocárdica (MI) ou material particulado (PM) é inadequado para tais estudos de doenças com múltiplas causas. Aqui, foi descrito um método para a construção de um modelo composto que combina exposição à PM, aterosclerose e isquemia do miocárdio. Os camundongos apoE-/− foram alimentados com uma dieta rica em gordura por 16 semanas para desenvolver aterosclerose, a instilação traqueal da suspensão padrão pm foi realizada para simular a exposição pulmonar da PM, e a artéria coronária descendente anterior esquerda foi ligalada uma semana após a última exposição. A instilação traqueal da PM pode simular exposição pulmonar aguda, reduzindo significativamente o custo do experimento; a clássica ligatração da artéria descendente anterior com intubação traqueal não invasiva e um novo dispositivo de expansão auxiliar podem garantir a taxa de sobrevivência do animal e reduzir a dificuldade da operação. Este modelo animal pode simular razoavelmente as alterações patológicas do infarto do miocárdio agravado pela poluição do ar e fornecer referência para a construção de modelos animais relacionados a estudos envolvendo doenças com múltiplas causas.
Introduction
A poluição do ar tem sido associada à alta mortalidade por todas as causas e contribuiu com uma carga significativa da doença mais do que a soma da poluição da água, poluição do solo e exposição ocupacional1. Um relatório da OMS revelou que a poluição atmosférica ao ar livre causou 4,2 milhões de mortes prematuras em ambas as cidades e áreas rurais em todo o mundo em 20162. 91% das pessoas em todo o mundo vivem em locais onde a qualidade do ar excede os limitesde diretrizes da OMS 2. Além disso, a matéria particulada fina (PM) (≤2,5 μm de diâmetro, PM2,5) é reconhecida como a ameaça mais significativa de poluição do ar à saúde pública global3, especialmente para as pessoas que vivem em cidades de países de baixa renda e de renda média.
Os efeitos adversos da poluição do ar sobre doenças cardiovasculares merecem mais atenção. Estudos anteriores mostraram que a PM leva a um aumento do risco de doenças cardiovasculares (DCV)4. A exposição a altas concentrações de partículas ultrafinas por várias horas pode levar ao aumento da mortalidade por infarto do miocárdio. Para pessoas com histórico de infarto do miocárdio, a exposição a partículas ultrafinas pode aumentar significativamente o risco de recidiva5. Além disso, geralmente é aceito que a exposição à PM acelera a progressão da aterosclerose6.
Para a pesquisa médica, é crucial selecionar um modelo animal adequado. Modelos animais de aterosclerose simples7, isquemia miocárdica modelosanimais 8, e modelos animais de exposição PM9 já existem. O camundongo ApoE−/− (apolipoproteína E nocauteada) é um modelo tradicional de camundongos usado em estudos de aterosclerose. A capacidade de limpar lipoproteínas plasmáticas em camundongos ApoE−/− é severamente prejudicada. A alimentação alimentar com alto teor de gordura causaria aterosclerose grave, assemelhando-se à dependência dietética de doenças cardíacas ateroscleróticas observadas em humanos7. A ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) é um método clássico para induzir o evento isquêmico 8,10. A infusão traqueal tem sido usada em muitas pesquisas e se destaca dos modelos de exposição11,12 por causa de sua melhor simulação e menor custo.
No entanto, modelos animais de doença única têm limitações significativas na pesquisa científica. A isquemia miocárdica induzida apenas pela ligadura LAD não é simulada na situação real. No estado natural, a isquemia do miocárdio é geralmente causada pela ruptura da placa e artérias coronárias bloqueadas13. Pacientes com cardiomiopatia isquêmica geralmente têm lesões básicas ateroscleróticas13. Há também metabolismo lipídico anormal e reações inflamatórias no corpo14. Portanto, a isquemia causada por fatores físicos ou em condições naturais tem diferentes manifestações patológicas. Estudos existentes têm demonstrado que o infarto e inflamação em modelos de isquemia miocárdica com aterosclerose são mais graves15,16. A exposição da PM pode agravar ainda mais a aterosclerose e isquemia do miocárdio, induzindo inflamação e estresse oxidativo1. Três fatores geralmente coexistem no estado natural, de modo que a situação real poderia ser melhor simulada usando um modelo composto.
Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo animal de isquemia miocárdica (MI) combinando aterosclerose (AS) e exposição aguda de PM. Os camundongos apoE−/− foram alimentados com uma dieta rica em gordura para induzir aterosclerose. A exposição pulmonar da PM foi imitada pela suspensão da PM pingando através da traqueia. A ligadura do LAD em camundongos foi usada para induzir isquemia miocárdica. Esses métodos foram combinados e otimizados para simular melhor o estado da doença e melhorar a taxa de sobrevivência dos animais. Nenhuma grande unidade de exposição ou máquina de anestesia a gás é necessária, facilitando o desempenho do experimento. Este modelo pode ser usado para estudar o impacto da exposição da PM na poluição do ar na aterosclerose e cardiomiopatia isquêmica e realizar pesquisas sobre novos fármacos desenvolvidos para tratar doenças com fatores tão complexos.
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Protocol
Todas as atividades animais descritas aqui foram aprovadas pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de MateriaMedim Chinês, Academia chinesa de Ciências Médicas Chinesas. Foram utilizados para o estudo camundongos machos ApoE−/− (C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade).
1. Preparação experimental
- Preparar anestésicos tribromoetanol (15 mg/mL): dissolver 0,75 g de tribromoetanol em 1 mL de álcool tert-amilo (ver Tabela de Materiais). Após a dissolução completa, dilui-o a 50 mL com soro fisiológico estéril. Armazene a solução a 4 °C em um recipiente estéril e evite a exposição à luz.
NOTA: Neste protocolo, o tribromoetanol foi utilizado devido ao tempo ideal de recuperação da anestesia e à taxa de sobrevivência dos animais. Siga as recomendações do comitê de ética animal local ao selecionar o regime de anestesia. - Prepare a suspensão pm: medir 5 mg de DPM (material particulado diesel, ver Tabela de Materiais) em tubos de centrífugas de 10 mL. Adicione 5 mL de soro fisiológico normal e vire o tubo de cabeça para baixo para misturar bem. Use filme de parafina para selar o tubo e, em seguida, colocá-lo em limpador ultrassônico por 2-3 h (40KHz, 80w) para quebra ultrassônica.
NOTA: A suspensão deve ser homogênea e livre de partículas aglomeradas. Agite bem antes de usar.
2. Indução de aterosclerose em camundongos
- Alimente os camundongos com uma dieta rica em gordura (pó de gema de ovo 10%, banha 10%, esterol 1%, alimentação de manutenção 79%, ver Tabela de Materiais) por 12 semanas.
- Para estimar o progresso da aterosclerose, selecione 2-3 camundongos aleatoriamente e verifique se há uma placa no arco aórtico por ultrassom ou observação anatômica direta17.
NOTA: Para observação anatômica, os animais foram selecionados por amostragem aleatória e eutanásia após anestesia. Em seguida, sua cavidade torácica foi aberta, e os vasos sanguíneos foram diretamente visualizados. A observação anatômica é geralmente mais confiável porque a imagem de ultrassom pode não detectar todas as placas. - Uma vez que a aterosclerose tenha julgado formada, prepare os ratos para o próximo passo.
3. Intubação orotraqueal e exposição aguda de material particulado
NOTA: A PM será exposta uma vez por semana durante 4 semanas após 12 semanas de alimentação rica em gordura e continuamente dada uma dieta rica em gordura.
- Prepare uma placa de dissecção (ver Tabela de Materiais) com um elástico que garante 1,5 cm da borda superior. Fixar a placa de dissecção em um ângulo de 60° do plano de mesa.
- Anestesiar o camundongo usando anestésico de tribromoetanol por injeção intraperitoneal (0,1 mL para cada 10 g de peso corporal). Depois de 2-3 min, gire o mouse para verificar se há um reflexo de direita. Faça uma beliscão no dedo do dedo do dedo para confirmar a sedação. Solte lubrificação estéril nos olhos.
- Desinfete a placa de dissecção com lenços umedecidos.
- Coloque o rato anestesiado em uma posição supina na placa e conecte os incisivos superiores ao elástico.
- Use um pequeno holofote LED (ver Tabela de Materiais) com um tubo flexível. Concentre a luz na traqueia, que fica perto do ponto médio da linha axilar.
- Coloque um pequeno cotonete estéril na boca do rato, depois role o cotonete para colocar a língua para fora.
- Segure a língua e puxe-a suavemente para cima para fazer a cavidade oral, faringe e traqueia na mesma direção longitudinal. O glottis, que é a entrada da traqueia, será mostrado como um ponto brilhante, que abre e fecha a cada respiração.
- Continue segurando a língua suavemente. Insira a cânula (22 G) na traqueia do mouse mirando no glottis, puxando o núcleo da agulha depois que a cânula é inserida na traqueia.
- Use uma arma de pipeta com uma pequena quantidade de soro fisiológico normal para testar se o tubo está corretamente na meia-porta. Se o tubo estiver na posição certa, a coluna líquida da pistola pipeta estará saltando a cada respiração.
- Solte 50 μL de suspensão DPM (preparado na etapa 1.2) no tubo com uma arma de pipeta. A suspensão será naturalmente inalada nos pulmões do rato enquanto respira.
NOTA: Para garantir uma respiração suave, dar ao mouse duas vezes a suspensão DPM (25 μL por uma vez), 10 s de distância, é melhor. - Remova a agulha de indwelling do animal de estimação após a exposição da PM. Espere o rato permanecer nas almofadas de aquecimento até que eles recuperem a consciência (10-20 min) e, em seguida, coloque de volta na gaiola doméstica.
4. Ligadura da artéria coronária
NOTA: A operação de modelagem da Isquemia miocárdica (ligadura da artéria coronária) é realizada na16ª semana.
- Prepare instrumentos cirúrgicos. Após a autoclavagem, armazene todas as ferramentas cirúrgicas em uma caixa de instrumentos selada. Mergulhe-os em 75% de álcool por 20-30 minutos antes da cirurgia.
- Construa a plataforma de cirurgia. Para alcançar a inclinação adequada da plataforma, use uma cobertura de prato de cultura celular (150 mm x 25 mm). Dobre 0-0 seda (10-15 cm de comprimento) ao meio e conecte as extremidades do rosca à parte superior da plataforma inclinada usando fita para criar um laço de suspensão.
- Anestesiar os camundongos após o procedimento descrito na etapa 3.2.
NOTA: Um intervalo de 1 semana deve ser assegurado entre cada administração de tribromoetanol. - Desinfete a plataforma com lenços umedecidos.
- Coloque o mouse em uma posição supina na plataforma de intubação e gancho os incisivos superiores na alça de suspensão descrita na etapa 4.2. Fita a cauda, membros e bigodes.
- Remova o cabelo do peito esquerdo e parte do peito direito adjacente com creme de depilação antes da cirurgia.
- Realizar intubação orotraqueal em camundongos seguindo o procedimento descrito nas etapas 3.4-3.8.
- Ligue a agulha de indwelling do animal com um ventilador animal (ver Tabela de Materiais). Ajuste do ventilador: taxa respiratória- 120 vezes/min; razão de inalação/respiração - 1:1.1; volume de marés - 1,7 mL.
- Limpe a pele com iodophor e álcool para desinfetar.
- Exponha o coração. Faça um corte de pele por 0,5-1 cm por tesoura oftálmica e prepare os músculos (músculo superficiale peitoral e músculo serratus anterior) para expor as costelas. Fixar a costela com uma pinça oftálmica (com ganchos) e, em seguida, fazer um pequeno corte no terceiro espaço intercostal (ver Tabela de Materiais). Faça uma janela de operação com ferramentas caseiras de abertura do peito.
NOTA: O corte de pele está localizado em cerca de um terço do processo xifoide e da linha de axila. - Rasgue as membranas pericárvias. Em seguida, é possível ligar o LAD seguindo as etapas 4.11-4.14.
NOTA: Se os lobos pulmonares estiverem bloqueando a vista, empurre-o para trás do coração usando um pequeno cotonete estéril. - A princípio, localize o RAPAZ.
- Segure a sutura de seda estéril 6-0 com uma agulha usando fórceps hemostáticos microvasculares (ver Tabela de Materiais). Passe a seda através de uma largura de 2 mm de miocárdio na área onde a artéria coronária está localizada.
NOTA: Não tente ligar apenas o LAD, o que pode causar hemorragia intraoperatória grave. - Coloque um pequeno pedaço de seda estéril 5-0 entre a ligadura e os tecidos do miocárdio para evitar a quebra do tecido.
- Amarre o LAD e o pequeno pacote do miocárdio em torno dele firmemente. A ligadura é considerada bem sucedida quando a parede anterior do ventrículo esquerdo (LV) fica pálida; A elevação do segmento ST pode ser observada simultaneamente se uma máquina de eletrocardiograma estiver conectada.
- Gentilmente esprema o ar do peito. Músculos intercostais de sutura e pele sequencialmente com seda estéril 5-0.
NOTA: Para espremer o ar do peito, feche o peito no momento da expansão pulmonar e use o indicador e os dedos médios para espremer suavemente a caixa torácica no meio e permitir que o ar escape além do último ponto. Seringas também podem ser usadas para extrair gás torácico.
NOTA: Recomenda-se sutura simples interrompida, pois os ratos podem roer a seda quando estiverem acordados.
5. Recuperação
- Limpe toda a mancha de sangue após a cirurgia, ou o rato seria atacado por outros.
- Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma posição lateral reclinável. Monitore continuamente os sinais do rato por 5-20 minutos até que se recuperem da anestesia. O tempo de monitoramento depende do estado do órgão.
NOTA: Os ratos respiram mais facilmente na posição lateral reclinável. - Uma vez recuperado o reflexo de redocimento, transfira os ratos para limpar gaiolas de recuperação em uma almofada de aquecimento com comida e garrafa de água. Continue monitorando por 15-30 min para garantir a sobrevivência do rato. Mantenha o mouse longe dos outros antes que ele possa se mover totalmente de forma autônoma.
- Para prevenir a infecção por feridas, injete a penicilina de sódio intramuscularmente de acordo com a dose desejada (1.000.000-1.50.000 U/kg). Para obter detalhes, consulte a rotulagem de medicamentos para conversão de dosagem.
- Coloque o rato de volta na gaiola. Mantenha o monitoramento pelas próximas 24 horas antes da coleta da amostra. Administre analgésicos para experimentos de longo prazo.
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Representative Results
Os camundongos foram eutanizados 24 h após a ligadura da artéria coronária, e o sangue foi coletado após anestesia. Os camundongos foram anestesiados por tribromoetanol (conforme o passo 3.2), e a amostra de sangue foi coletada do seio retroorbital. O coração foi colhido, e o grau de Isquemia foi examinado por 2,3,5-Triphenyltetrazolium Cloreto (TTC) (Figura 1). Os tecidos normais ficam vermelhos quando o TTC reage com desidrogenase de succinato, enquanto os tecidos isquêmicos permanecem pálidos devido à diminuição da atividade desidrogenase18. O coração do grupo MI+PM tem uma área infarto maior do que a do grupo MI.
Figura 2 mostra placas na aorta por óleo vermelho O manchando17,19. O vermelho óleo O pode colorir precisamente as gorduras neutras, como triglicerídeos nos tecidos17. As manchas vermelhas na foto indicam placas. A aorta do grupo AS+PM tinha mais placas do que as do grupo AS. A Figura 3 mostra as ferramentas caseiras de abertura do baú mencionadas e seu uso.
Figura 1: Ensaio de coloração TTC no tecido cardíaco do rato. A área de infarto mostra branco. Exposição da PM agravou isquemia do miocárdio. Sham: Não sofreu cirurgia de MI ou exposição de PM; MI: Sofreu cirurgia de MI, mas sem exposição à PM; MI+PM: Sofreu tanto a cirurgia do MI quanto a exposição da PM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos representativos da mancha de O Vermelho-Óleo de aortae de camundongos ApoE−/− A placa na aorta estava manchada de vermelho. A alimentação com alto teor de gordura levou à aterosclerose em camundongos ApoE/- e a exposição da PM agravou aterosclerose. Sham: ratos do tipo selvagem com dieta normal; AS: ApoE-/- camundongos com dieta rica em gordura; AS+PM: ApoE-/- camundongos com dieta rica em gordura, sofreram exposição à PM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ferramentas caseiras de abertura do peito. Cruze as ferramentas de abertura do baú para abrir uma janela de operação quando estiver em uso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O estabelecimento de um modelo animal composto é ligeiramente diferente do modelo MI único. Manter uma alta taxa de sobrevivência é um desafio no desenvolvimento do modelo composto. A gravidade da aterosclerose em camundongos ApoE−/− se tornará mais severa com a extensão do tempo de alimentação de alta gordura7, e a fraqueza dos camundongos leva ao aumento da mortalidade. Portanto, é necessário monitorar a condição dos camundongos durante o experimento continuamente e ajustar o tempo para induzir aterosclerose de acordo com as necessidades do experimento.
A exposição à PM pode exercer pouco efeito na taxa de sobrevivência dos camundongos. Mas a repetição da intubação traqueal causará sangramento intraoral e edema em camundongos20, o que aumentará a dificuldade de experimentos subsequentes. Portanto, é necessário praticar o processo de intubação diligentemente. Tente encontrar a posição correta no menor número possível de tentativas. Uma vez que um longo período é necessário neste experimento, encurtar os incisivos longos do camundongo é necessário. A poda dos incisivos longos do camundongo precisa ser evitada durante as operações, incluindo a intubação endotraqueal; caso contrário, os incisivos afiados podem arranhar a língua do rato e causar sangramento.
A cirurgia de ligadura LAD afeta a taxa de sobrevivência dos camundongos. A ligadura intratorácica clássica e conservadora da artéria coronária LAD foi prudentemente escolhida em vez do 'Modelo Eficiente'10 (um método que espreme o coração para fora do peito) para obter melhor sobrevivência a longo prazo após a cirurgia com menos custos de treinamento.
Os essenciais mais críticos em operação são anestesiar, manter a respiração do camundongo e prevenir sangramento. Comparado com pentobarbital, o tribromoetanol pode melhorar significativamente a taxa de sobrevivência dos camundongos. O rato ficará inconsciente 2-5 minutos após a anestesia, e essa situação geralmente dura até o final da operação. Se o rato acordar, uma injeção adicional de 0,05 mL anestésico é administrada.
Depois que a cavidade torácica for aberta, o ventilador deve ser conectado todo o caminho. Se a intubação traqueal cair no meio, a cavidade torácica deve ser selada imediatamente com fórceps hemostáticos, e o experimento pode ser continuado após a reconectação do ventilador. O sangramento deve ser evitado durante a cirurgia. O processo de sangramento tende a ocorrer no peito aberto, pericárdio removido e LAD ligado. Se ocorrer sangramento, remova o sangue com cotonetes. O escapamento deve ser totalmente espremido ao fechar a cavidade torácica, ou usar o tubotorácico 8 quando o peito estiver fechado.
O método de exposição pm em camundongos inclui principalmente a torre de exposição21, injeção de veias traseiras22 e gotejamento traqueal23. Torres de exposição têm custos enormes (por causa de equipamentos caros e o enorme consumo de PM), enquanto a injeção da veia traseira é bem diferente do padrão natural de exposição da PM. Gotejamento traqueal é uma maneira de compromisso. Comparado à respiração sob exposição da PM, o gotejamento traqueal é um processo de exposição passiva. A distribuição da PM na traqueia e nos pulmões pode ser diferente do estado natural. Mas como um método clássico, o gotejamento traqueal é quantitativamente preciso e fácil de implementar9. Embora a instilação nasal seja menos prejudicial, após a instilação nasal, parte da suspensão pode entrar nos pulmões, alguns podem entrar no sistema digestivo, e alguns permanecerão na cavidade nasal. Como a suspensão da PM não entrará todos nos pulmões, uma instilação nasal não pode simular exposição à poluição do ar. Em contraste, injetar a matéria particulada na traqueia garante que toda matéria particulada entre diretamente nos pulmões. Além disso, a cavidade nasal é menor e requer maior concentração da suspensão para alcançar a dose desejada, dificultando o controle da dose média administrada.
O protocolo atual sofre de certas limitações. As matérias-primas da suspensão pm utilizadas na instilação traqueal são uma matéria particulada padrão dos motores diesel. Contém principalmente hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, que é um dos principais componentes da PM. Os componentes químicos da PM da teatisfera incluem nitratos, sulfatos, elementares, carbono orgânico, compostos orgânicos (por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos), compostos biológicos (por exemplo, endotoxina, fragmentos celulares) e metais (por exemplo, ferro, cobre, níquel, zinco e vanádio)24. O padrão de material particulado pode diferir da matéria particulada no ar, o que também não é uma escolha perfeita. A composição das partículas varia de acordo com região, clima e estação. Portanto, o PM coletado do ar é incerto, fazendo com que os experimentos sejam desafiadores para se repetirem com os mesmos resultados. O uso de padrões pm poderia dar à pesquisa melhor repetibilidade.
Ao todo, foi descrito um modelo de Isquemia miocárdica que ocorre com base na aterosclerose após a exposição a material particulado. Este modelo pode ser usado para estudar o efeito da poluição do ar sobre doenças cardiovasculares e fornecer uma referência para o estabelecimento de um modelo animal de doenças complexas.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes para declarar.
Acknowledgments
Este modelo foi desenvolvido com o apoio da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Nos. 81673640, 81841001 e 81803814) e do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia da China para Drogas Inovadoras (2017ZX093012002 e 2017ZX0910100200002001-001-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 75% alcohol disinfectant | |||
| Animal ventilator | Shanghai Alcott Biotech | ALC-V8S | |
| Cotton swabs | Sterile | ||
| Cotton swabs for babies | Sterile , Approximately 3 mm in diameter | ||
| Culture Dish | Corning | 430597 | 150 mm x 25 mm |
| Diesel Particulate Matter | National Institute of Standards Technology | 1650b | |
| Dissection board | About 25 x 17 cm. The dissecting board can be replaced with a wooden board of the same size | ||
| High-fat diet for mice | Prescription: egg yolk powder 10%, lard 10%, sterol 1%, maintenance feed 79% | ||
| Iodophor disinfectant | |||
| LED spotlight | 5 V, 3 W,with hoses and clamps | ||
| Medical silk yarn ball | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 0-0 |
| Medical tape | 3M | 1527C-0 | |
| Micro Vascular Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | W40350 | |
| Needle Holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JC32010 | |
| Normal saline | |||
| Ophthalmic Scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | Y00040 | |
| Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with hooks | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1080 | |
| Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with teeth | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1060 | |
| Pipet Tips | Axygen | T-200-Y-R-S | 0-200 μL |
| Pipette | eppendorf | 3121000074 | 100 uL |
| Safety pin | Approximately 4.5 cm in length , for making chest opening tools | ||
| Small Animal I.V. Cannulas | Baayen healthcare suzhou | BAAN-322025 | I.V CATHETER 22FG x 25 MM |
| Suture needle with thread | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 6-0,Nylon line |
| Suture needle with thread | JinHuan Medical | F503 | 5-0 |
| Syringe | 1 mL | ||
| Tert-amyl alcohol | |||
| Zoom-stereo microscope | Mshot | MZ62 |
References
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