Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Исследование сердечного метаболизма в изолированном перфузированном сердце мыши с помощью гиперполяризованной [1-13 C] пируватной и 13C/31P ЯМР-спектроскопии

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Мы описываем экспериментальную установку для введения гиперполяризованных 13-меченных 13С-метаболитов в режиме непрерывной перфузии изолированному перфузированному сердцу мыши. Специальный подход к сбору данных 13С-ЯМР позволил количественно оценить активность метаболических ферментов в режиме реального времени, а многопараметрический анализ 31Р-ЯМР позволил определить содержание АТФ в ткани и рН.

Abstract

Обмен веществ является основой важных процессов в клеточной жизни. Характеристика того, как функционируют метаболические сети в живых тканях, дает важную информацию для понимания механизма заболеваний и разработки методов лечения. В данной работе мы описываем процедуры и методики изучения внутриклеточной метаболической активности в ретроградно перфузированном сердце мыши в режиме реального времени. Сердце было изолировано in situ в сочетании с остановкой сердца, чтобы свести к минимуму ишемию миокарда, и перфузировалось внутри спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В то время как в спектрометре и при непрерывной перфузии гиперполяризованный [1-13 C] пируват вводили в сердце, а последующие гиперполяризованные [1-13 C] лактат и [13C] бикарбонат служили для определения в режиме реального времени скорости производства лактатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Эта метаболическая активность гиперполяризованного [1-13C]пирувата была количественно определена с помощью ЯМР-спектроскопии в свободной модели с использованием метода получения селективного насыщения-возбуждения продукта. 31 См. В промежутках между гиперполяризованными исследованиями применялась P-спектроскопия для мониторинга сердечной энергетики и рН. Эта система уникально полезна для изучения метаболической активности в здоровом и больном сердце мыши.

Introduction

Изменения в сердечном метаболизме связаны с различными кардиомиопатиями и часто составляют основу основных патофизиологических механизмов1. Тем не менее, существует множество препятствий для изучения метаболизма в живых тканях, поскольку большинство биохимических анализов требуют гомогенизации ткани и лизиса клеток и/или радиоактивного отслеживания. Поэтому существует острая потребность в новых инструментах для исследования метаболизма миокарда в живых тканях. Магнитный резонанс (МРТ) гиперполяризованных 13С-меченных субстратов позволяет в режиме реального времени измерять метаболизм в живых тканях2 без использования ионизирующего излучения путем увеличения отношения сигнал/шум МР-сигнал/шум (SNR) меченого сайта (сайтов) на несколько порядков3. Здесь мы описываем экспериментальную установку, подход к приобретению и аналитический подход для изучения быстрого метаболизма в изолированном сердце мыши и, параллельно, представляем показатели общей тканевой энергетики и кислотности. рН сердца является ценным показателем, так как кислотно-щелочной баланс нарушается на ранних стадиях сердечных заболеваний и таких состояний, как ишемия миокарда, дезадаптивная гипертрофия исердечная недостаточность6.

Гиперполяризованное производство [1-13 C]лактата и [13 C]бикарбоната из гиперполяризованного [1-13C] пирувата помогает определить скорость производства лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и пируватдегидрогеназы (ПДГ). В большинстве предыдущих исследований, выполненных с использованием гиперполяризованных субстратов в изолированном сердце грызуна, либо использовались сложные кинетические модели для получения ферментативной активности ЛДГ и ФДГ, либо сообщалось об отношениях интенсивности сигнала гиперполяризованного продукта к субстрату без расчета фактических скоростей активности ферментов 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Здесь мы использовали метод 15 селективного насыщения-возбуждения продукта, который позволяет контролировать активность фермента без моделирования15,16. Таким образом, были определены абсолютные ферментативные скорости (т.е. количество молей продукта, произведенного в единицу времени). 31 См. P-спектроскопия использовалась для наблюдения сигналов неорганического фосфата (Pi), фосфокреатина (PCr) и аденозинтрифосфата (АТФ). Многопараметрический анализ был использован для характеристики распределения рН сердца, о чем свидетельствует гетерогенный химический сдвиг в Pi-сигнале ткани.

Ретроградно перфузированное сердце мыши (сердце Лангендорфа)17,18,19 является моделью ex vivo для неповрежденного бьющегося сердца. В этой модели жизнеспособность сердца и рН сохраняются в течение не менее 80 мин20, и она показала потенциал для восстановления после длительного ишемического повреждения21,22. Тем не менее, непреднамеренная вариабельность во время микрохирургии может привести к вариабельности жизнеспособности тканей в сердцах. В предыдущих исследованиях сообщалось об ухудшении состояния этого сердца с течением времени19; Например, наблюдалось снижение сократительной функции на 5-10% в час18. Ранее было показано, что сигнал аденозинтрифосфата (АТФ) сообщает об энергетическом статусе и жизнеспособности миокарда23. Здесь мы отметили, что перфузированное сердце может иногда демонстрировать непреднамеренную вариабельность уровней жизнеспособности, о чем свидетельствует содержание АТФ, несмотря на то, что у нас была непрерывная перфузия и снабжение кислородом. Здесь мы демонстрируем, что нормализация показателей ЛДГ и ФДГ к содержанию АТФ в сердце снижает межсердечную вариабельность этих показателей.

В следующем протоколе мы описываем хирургическую процедуру, используемую для канюляции сердца, выделения и последующей перфузии в ЯМР-спектрометре. Следует отметить, что другие хирургические подходы, направленные на изоляцию и перфузию сердца мыши, были описаны до24,25.

Также описаны методики, используемые для получения данных, связанных с ферментативными скоростями в работающем сердце (с использованием спектроскопии 13 C и гиперполяризованного [1-13C] пирувата), а также жизнеспособностью и кислотностью сердца (с использованием 31P ЯМР-спектроскопии). Наконец, объясняются аналитические методологии определения активности метаболических ферментов, жизнеспособности и кислотности тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Объединенный комитет по этике (IACUC) Еврейского университета и медицинского центра «Хадасса» одобрил протокол исследования по благополучию животных (MD-19-15827-1).

1. Подготовка буфера Кребса-Хензеляйта

  1. За сутки до эксперимента приготовьте модифицированный вариант буфера Кребса-Хензелейта (KHB)26. Первоначально растворяют 118 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 0,5 мМ пирувата, 1,2 мМ MgSO4, 25 мМ NaHCO3 и 1,2 мМKH2PO4 в двойной дистилляции H2O.
  2. Взбейте эту смесь с 95%/5% O2/CO2 в течение 20 мин, а затем добавьте 1,2 мМCaCl2.
  3. Отрегулируйте рН буфера до 7,4 с помощью HCl или NaOH.
  4. В день эксперимента добавьте 10 мМ глюкозы и 72 ЕД/л инсулина к KHB, приготовленному на шаге 1.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин добавляют в буфер перфузии, как описано в работе Kolwicz et al.26 и в соответствии с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что инсулин увеличивает сократительную функцию27 и интенсивность гиперполяризованного [13C] бикарбонатного сигнала 28.

2. Подготовка перфузионной системы

  1. Держите резервуар с 200 мл KHB на водяной бане при 40 ° C и пузыритесь с 95% / 5% O 2 / CO2 при скорости потока 4 л / мин в течение 1 часа до сердечной перфузии. Держите буфер непрерывно пузырящимся с этой газовой смесью на протяжении всего эксперимента.
    1. Сначала установите водяную баню на 40 °C. Вставьте резервуар KHB. Используйте перистальтический насос (см. Таблицу материалов) и удлинительные трубки медицинского класса для рециркуляции KHB между буферным резервуаром и трубкой ЯМР диаметром 10 мм при постоянной скорости потока 7,5 мл / мин.
    2. Подсоедините к насосу три силиконовые трубки платинового отверждения (внутренний диаметр 3 мм) (одну впускную трубку и две выпускные трубки для буфера KH). Вставьте линии оттока и притока в нагретый буфер KH. Затем вставьте кислородную магистраль в нагретый буфер KH.
    3. Используйте тонкие линии полиэфирэфиркетона (PEEK, см. Таблицу материалов) для буфера и гиперполяризованного агента, который будет поступать в трубку ЯМР и из нее в отверстии спектрометра.
  2. Убедитесь, что температура поддерживается на уровне 37-37,5 °C. Выполните следующие действия.
  3. Оберните линию притока (от буферного резервуара до трубки ЯМР) нагревательной лентой, установленной на 42 °C.
  4. Нагрейте ЯМР-трубку внутри спектрометра теплым воздушным потоком, который регулируется спектрометром.
  5. Используйте ЯМР-совместимый датчик температуры (см. Таблицу материалов) для измерения температуры внутри ЯМР-трубки. Температура регулируется до 37-37,5 °C.

3. Калибровка и подготовка ЯМР-спектрометра к получению данных

  1. В день эксперимента вставьте в спектрометр стандартный образец с температурой13 ° C, содержащий 1,4-диоксан (таблица материалов), и настройте и сопоставьте зонд ЯМР на 13° C. Затем получают спектр, показывающий сигнал теплового равновесия 1,4-диоксана с углом нутации 90°.
  2. Теперь замените стандартный образец 13C на стандартный образец 31 P (Таблица материалов), который содержит 105 мМ АТФ в D2O. Настройте и сопоставьте зонд ЯМР на 31P.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр, показывающий сигналы теплового равновесия фосфата, получен с углом нутации 50°.
  3. Вставьте линию притока, линию оттока и датчик температуры в трубку ЯМР диаметром 10 мм, а затем вставьте трубку в магнитное отверстие. Отрегулируйте нагревательную ленту до 42 °C.
  4. Получите 31P спектр ЯМР циркулирующего буфера KH, который будет использоваться в этом эксперименте в течение 30 мин, с углом нутации 50° и TR 1,1 с (1,640 захватов).

4. Подготовка животных, хирургическое вмешательство и перфузия сердца в ЯМР-трубке

  1. Анестезируйте самца мыши HSD:ICR (CD-1) 3,3% изофлураном в комнатном воздухе (Таблица материалов) со скоростью 340 мл / мин в течение 5 минут с использованием системы газовой анестезии (Таблица материалов) в индукционной камере.
  2. Используйте назальный наркоз для поддержания общей анестезии с 2,9% изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт для животного.
  3. Закрепите конечности животного скотчем, обеспечьте отрицательный педальный болевой рефлекс, а затем внутрибрюшинно введите 300 МЕ гепарина натрия.
  4. Тщательно смочите грудную стенку и живот мыши 70% спиртом, чтобы обеспечить чистоту и избежать загрязнения волос или обструкции во время хирургической процедуры.
  5. Через 1 мин после инъекции гепарина разрежьте кожу и мышцы брюшной полости маленькими ножницами.
  6. Поместите маленький зажим от комаров с изогнутой челюстью, фиксирующий гемостат, между мечевидным отростком и кожей грудной клетки, чтобы поднять грудную клетку и обнажить диафрагму. Проколите и отрежьте правую долю диафрагмы.
  7. Разрежьте грудь поперек средней линии, отведите в стороны, а затем уберите.
  8. Введите в левый желудочек сердца 200 МЕ гепарина натрия, чтобы предотвратить свертывание крови. Затем введите 0,1 мл ледяного 0,5 моль/л KCl для достижения остановки сердца, как описано ранее25. Остановка сердца необходима для канюляции сердца.
  9. Определите тимус и удалите его с помощью ножниц, чтобы обнажить аорту. Удалите остаточную ткань грудной клетки.
  10. Определите дугу аорты и используйте изогнутые щипцы, чтобы поместить свободный узел с шелковым швом 3-0 (Таблица материалов) вокруг восходящей аорты. Введите 3 мл KHB в левый желудочек, чтобы удалить сгустки крови из аорты.
  11. Используйте изогнутые щипцы, чтобы втянуть сердце вниз для лучшей визуализации восходящей аорты.
  12. Проведите канюляцию in situ с помощью внутривенного катетера 22 г (таблица материалов). Нанесите цианакрилатный клей в канюлированную область, а затем выполните двойное наложение швов. Введите дополнительный буфер KH в сердце и убедитесь, что он течет через канюляционную трубку.
  13. Удалите изогнутые щипцы. Отсоедините сердце от окружающих внутренних органов и ретроградно перфузируйте его ледяным KHB (4 °C) через внутривенный катетер.
  14. Подключите сердце к линии притока перфузионной системы через внутривенный катетер. После начала перфузии теплым буфером (37-37,5 °C) при 7,5 мл / мин сердце начинает биться спонтанно.
  15. Закрепите трубку ЯМР с бьющимся сердцем, линиями оттока и датчиком температуры и вставьте в отверстие спектрометра, убедившись, что сердце находится в центре датчика ЯМР.

5. Получение данных для сердечной энергетики и рН

  1. Получение 31спектра P в течение примерно 1 ч с углом разворота 50° и TR 1,1 с.

6. Спиновая поляризация и растворение DNP

  1. Приготовьте состав [1-13C] пирувата в дозе 28,5 мг. Этот состав состоит из радикала OX063 от 11,1 мМ до 14,0 мМ в чистой кислоте.
  2. Приготовьте 4 мл растворяющей среды. Среда растворения состоит из TRIS-фосфатного буфера, который содержит 11,2 мМ 2 PO 4, 38,8 мМ Na 2 HPO4, 33 мМ TRIS и 2мМ HCl. Эту среднюю композицию регулируют таким образом, что при добавлении 28,5 мг [1-13С] состава пировиноградной кислоты к 4 мл этого буфера (в фазе растворения) рН полученного раствора будет составлять 7,4.
  3. Выполняйте спиновую поляризацию и быстрое растворение в устройстве спиновой поляризации растворения-DNP (dDNP) в соответствии с инструкциями производителя (таблица материалов). Применяют микроволновое облучение на частоте 94,110 ГГц для поляризации состава пировиноградной кислоты [1-13С] при 1,45–1,55 К в течение примерно 1,5 ч.
  4. Быстро смешайте 4 мл гиперполяризованной среды из устройства dDNP с хорошо насыщенным кислородом раствором, который дополняет гиперполяризованную среду растворения, чтобы получить композицию, близко соответствующую перфузионной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем среды, перфузирующей сердце во время гиперполяризованных инъекций 14 мМ гиперполяризованным [1-13С] пируватом, составляет 26 мл. Конечная композиция вводимой среды (после смешивания) содержит 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 70 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO3, 1,2 мМ KH2 PO 4, 10 мМ глюкозы, 1,2 мМ CaCl2 и72ЕД/л инсулина.
  5. Вводят гиперполяризованную [1-13С] пируватсодержащую среду в изолированное сердце с использованием установкинепрерывного потока 29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для того, чтобы гарантировать, что перфузия сердца не нарушается ни в один момент во время эксперимента и что гиперполяризованная среда вводится с известной скоростью и в течение известной продолжительности.

7. Гиперполяризованная спектроскопия 13C

  1. Получение гиперполяризованных данных 13 C с использованием селективных импульсов насыщения-возбуждения 15 путем применения импульсов кардинального синуса (Sinc) продолжительностью 2,5 мс, как описано ранее15,16. Селективно возбуждают [1-13С]лактат и [13С]бикарбонат последовательно с интервалом 6 с для получения интервала 12с для каждого метаболита.
  2. Для обнаружения [1-13 C] лактата центрируйте селективный импульс Sinc на частоте пируватгидрата [1-13 C] (179,4 ppm), что приводит к соотношению интенсивности сигнала (lac) 0,113 для сигналов C 1 от [1-13 C]пирувата к [1-13C]лактату.
  3. Для обнаружения бикарбоната [13 C] центрируйте селективный импульс Sinc на 157,7 ppm, что составляет 214 Гц в нижнем поле сигнала [13C] бикарбоната (161,1 ppm); это приводит к коэффициенту интенсивности сигнала (bic), равному 0,139 для сигнала C 1 от [1-13C] пирувата до [13C] бикарбоната.

8. Определение массы и объема сырой ткани

  1. В конце эксперимента отделите сердце от перфузионной системы и аккуратно высушите его папиросной бумагой. Впоследствии взвесьте сердце, чтобы получить ткань влажного веса.
  2. Определите объем сердца, используя коэффициент плотности 1,05 г/см3, как определено ранее для сердцамыши 30.

9. Количественная оценка содержания АТФ

  1. Интегрируйте сигнал γ-АТФ одного сбора стандартного образца АТФ и 30-минутного сбора (TR 1,1 с и 1,640 захватов) изолированного сердца.
  2. Количественно определите содержание АТФ в сердце, сравнив интеграл сигнала γ-АТФ сердца со стандартом (Таблица материалов), где последний имеет известную концентрацию (105 мМ), и скорректируйте количество приобретений и эффектов релаксации.

10. Разрешение сигнала Пи сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить рН ткани, сначала необходимо отделить сигнал Pi сердца от общего сигнала Pi (Pit). Это делается путем исключения сигнала KHB Pi (PiKH) из сигнала Pit.

  1. В спектре 31P KHB, который показывает один Pi-сигнал (Pi KH, рис. 1A), подгоните сигнал PiKH к функции Лоренца с помощью Excel (Таблица материалов).
  2. Объем, видимый ЯМР-зондом (Vp, 1,375 мл), содержит больше KHB, когда пробирка для образца не содержит сердца. Чтобы скорректировать этот эффект заполнения, рассчитайте ослабленный буферный сигнал (Pib), используя уравнение 1A.
    Equation 1Уравнение 1А
    где Vh - объем сердца, как определено на шаге 8.
  3. Вычтите этот сигнал из Pit в соответствии с уравнением 1B, чтобы получить сигнал Pi, исходящий исключительно от перфузированного сердца (Pih, рис. 1B).
    Equation 2Уравнение 1В

11. Многопараметрический анализ рН

  1. Выполните преобразование распределения химического сдвига сигнала Pih в рН по отношению к химическому сдвигу PCr, используя уравнение 231.
    Equation 3Уравнение 2
    где Δδ — разность химического сдвига, pKa — 6,72, δ свободное основание — 5,69, а δ свободная кислота — 3,27, как описано ранее31.
  2. Скорректируйте результирующую кривую распределения рН для нелинейности между шкалой химического сдвига Pih и шкалой pH в соответствии с Lutz et al.32. Типичное распределение рН, полученное в результате этого расчета, представлено на рисунке 1C.
  3. Анализ распределения рН тканей с помощью многопараметрического подхода с использованием семи статистических параметров в соответствии с работой Lutz et al. 32. Здесь представлены четыре из этих параметров, поскольку они, по-видимому, являются наиболее описательными для рН тканей: 1) глобальный максимальный рН; 2) средневзвешенный рН; 3) взвешенный медианный рН; и 4) асимметрия графика рН (рис. 1С).

12. Расчет деятельности LDH и PDH

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорости производства гиперполяризованных метаболитов [1-13 C] лактата и [13C] бикарбоната используются для расчета активности ЛДГ и ФДГ соответственно. В подходе15 к селективному насыщению-возбуждению продукта при каждом селективном возбуждении обнаруживаются только вновь синтезированные гиперполяризованные метаболиты.

  1. Используйте гиперполяризованный сигнал пирувата [1-13C] в качестве эталона для определения соответствующего уровня производства метаболитов.
    1. При перфузии гиперполяризованной средой концентрация пирувата [1-13 С] в ЯМР-трубке увеличивается (промывка), затем плато (при максимальной концентрации 14мМ), а затем уменьшается (вымывание).
    2. Чтобы определить моменты времени, в которые концентрация пирувата достигла постоянного уровня (плато), скорректируйте сигнал пирувата [1-13C] для затухания сигнала в результате релаксации T1 и радиочастотной пульсации, используя эффективную константу релаксации, Teff.
    3. Для каждой инъекции определитеT-eff на основе его способности корректировать кривую распада пирувата [1-13C], чтобы показать эту динамику потока (уравнение 3).
      Equation 4Уравнение 3
      где Equation 5 — сигнал пирувата [1-13C], полученный во время сбора бикарбоната [13C]. Было обнаружено, что среднийT-эфф в описанных здесь экспериментах составляет 35,8 с ± 2,3 с (n = 5 сердец).
    4. Выберите точки данных, в которых концентрация находится в пределах 10% от максимального скорректированного сигнала пирувата [1-13° C] для дальнейшего анализа.
  2. Используйте соответствующие данные продукции [1-13 С]лактата и [13С]бикарбоната для временных моментов, выбранных на шаге 12.1, для расчета скоростей продукции метаболитов с использованием уравнений 4А и 4В при условии, что отношение сигнал/шум сигнала метаболита больше 2 (пороговое значение для анализа). Типичный пример такого выбора временных точек показан на рисунке 2B (выделенное временное окно).
  3. Рассчитайте производительность каждой из выбранных точек данных, используя уравнения 4A и уравнения 4B:
    Equation 17Уравнение 4А
    Equation 6Уравнение 4B
    где Equation 7 и — скорости производства [1-13 С]лактата или [13 С]бикарбоната в каждый момент времени, соответственно. и являются факторами, представляющими относительное возбуждение [1-13С]пирувата и Equation 8 Equation 10 продуктов [1-13С]лактата или [13С]бикарбоната, соответственно. Equation 9 Ранее эти факторы были определены как 0,113 и 0,139 соответственно29. Vp - объем, который детектируется ЯМР-зондом (1,375 мл), TR обозначает промежуток времени между двумя последовательными селективными насыщающими возбуждениями продукта (12 с для каждого продукта), Equation 11 и являются сигналами [1-13 С]лактата и [13 С]бикарбоната соответственно, и и являются сигналами [1-13 С]пирувата, которые были получены во время [1-13 С]лактата и Equation 13 Equation 12 Equation 14 [13 C]бикарбонатные возбуждения, соответственно. [Pyr] - это концентрация пирувата [1-13 C], которая составляла 14мМ во время фазы плато.
    1. Определите скорость для каждой точки, а затем усредните по гиперполяризованной инъекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1А показаны 31спектры P, записанные в сердце мыши, перфузированном KHB, и только в буфере. В сердце наблюдались сигналы α-, β- и γ-АТФ, PCr и Pi. Пи-сигнал состоял из двух основных компонентов: в более высоком поле (левая часть сигнала) пи-сигнал был в основном обусловлен KHB при pH 7,4; в нижнем поле (правая часть сигнала) Pi-сигнал был шире и менее однороден из-за более кислой среды. Последний паттерн возникает из сердечной ткани. Пи-сигнал сердечной ткани извлекается путем вычитания Pi-сигнала KHB (рис. 1B), а затем преобразуется из шкалы ppm в шкалу pH (рис. 1C). pH исследуется с помощью многопараметрического анализа тканевого Pi-сигнала путем вычисления средневзвешенного значения, взвешенной медианы, глобального максимума и асимметрии (рис. 1C).

Figure 1
Рисунок 1: Типичные спектры 31 P, различие между Pi-сигналом KHB и сердца, преобразование от химического сдвига к осям pH и статистические параметры распределения pH. (A) На верхней панели отображается типичный спектр ЯМР 31P, полученный из сердца мыши, перфузированного KHB в спектрометре, в то время как нижняя панель показывает спектр, полученный только из KHB. Спектральная область, отмеченная пунктиром, показана в увеличенном виде на панели B. Сокращения: Pi = неорганический фосфат; PCr = фосфокреатин; АТФ = аденозинтрифосфат; АДФ = аденозиндифосфат. (B) исходный спектр показан черным цветом (Pit); пунктирная кривая показывает сигнал Pi только из буфера (Pib). Последнее было получено путем подгонки формы линии Лоренца с центром к соответствующей компоненте KHB сигнала Pit и поправки на количество KHB в зонде после введения сердца (в соответствии с уравнением 1A). Сигнал Pi, приписываемый сердцу (Pih), показан оранжевым цветом, и это получается путем вычитания сигнала Pib из сигнала Pit (согласно уравнению 1B). (C) Преобразование распределения химического сдвига сигнала Pih, показанное в (B), в распределение pH и многопараметрический анализ pH. Нелинейность между химическим сдвигом и шкалами рН была скорректирована, как описано ранее32. Результаты многопараметрического pH-анализа отмечены вертикальными линиями. Для этого конкретного распределения приведены значения статистических параметров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

С помощью подхода15 к получению гиперполяризованного продукта с селективным насыщением-возбуждением можно выполнить абсолютное количественное определение активности ферментов ЛДГ и ФДГ. На рисунке 2 показаны этапы сбора и обработки, необходимые для этого определения. В таблице 1 показано содержание АТФ и показатели ЛДГ и ФДГ в пяти разных сердцах. Нормализация активности ЛДГ и ФДГ к содержанию АТФ в каждом сердце снижала вариабельность измерений ЛДГ и ФДГ по всей группе, как видно из столбцов активности ферментов в таблице 1, которые выражаются в единицах нмоль/с/мкмоль АТФ.

Figure 2
Рисунок 2: Гиперполяризованный процессинг13 C MRS и анализ метаболизма пирувата [1-13C]. (A) Репрезентативные спектры ЯМР 13 С, полученные с помощью метода селективного насыщения-возбуждения продукта во время инъекции 14 мМ гиперполяризованного [1-13С]пирувата в перфузированное сердце мыши. Назначение сигнала: 1 = [1-13 C]лактат (183,2ppm); 2 = [1-13 C]пируват (171ppm); 3 = [13C]бикарбонат (161,1 ppm); * = примеси, образующиеся в составе пирувата [1-13C]33. (B) Временной ход интенсивности гиперполяризованного сигнала, показанный в A. Интегральные интенсивности пирувата [1-13C] (серый) были скорректированы с учетом распадаT1и радиочастотной пульсации с постоянной времени Teff 32 с (черный), и это дало ожидаемую динамику потока для подложки (промывка, плато, вымывание). Дальнейший анализ был проведен на точках данных в пределах временного окна, в котором скорректированный сигнал пирувата [1-13 С] показал постоянную и максимальную концентрацию пирувата [1-13С] в ЯМР-трубке (выделена голубым цветом). Нормы производства ЛДГ и ПДГ (Equation 18 и ) для выбранных временных точек рассчитывались в соответствии с уравнениями 4А и Equation 194В, а затем усреднялись. Средние значения для этой инъекции (Equation 1 и Equation 1 ) приведены в единицах нмоль/с. Для целей отображения скорректированный [1-13 С]пируват, [1-13 С]лактат и [13 С]бикарбонат умножали на 0,143, 10 и 80 соответственно относительно сигнала пирувата [1-13С]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сердце No. АТФ (мкмоль) Скорость ЛДГ (нмоль/с) Скорость PDH (нмоль/с) Скорость ЛДГ (нмоль/с/мкмоль АТФ) Скорость PDH (нмоль/с/мкмоль АТФ)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Среднее значение (SD) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % Среднее значение 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Таблица 1: Содержание АТФ и показатели ЛДГ и ФДГ в пяти сердцах. Сокращения: SD = стандартное отклонение; SD % Среднее = процент стандартного отклонения от среднего.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы демонстрируем экспериментальную установку, предназначенную для исследования гиперполяризованного [1-13C] пируватного метаболизма, тканевой энергетики и рН в изолированной модели сердца мыши.

Важнейшими шагами в рамках протокола являются следующие: 1) обеспечение того, чтобы рН буфера составлял 7,4; 2) обеспечение включения всех компонентов буфера; 3) предотвращение свертывания крови в сосудах сердца путем инъекций гепарина; 4) предотвращение ишемического повреждения сердца за счет снижения метаболической активности (инъекция KCl и ледяной буфер); 5) недопущение введения пузырьков воздуха в сердце в любой момент процедуры; 6) подтверждение успешной канюляции аорты по цвету ткани, который меняется от темно-красного до светло-розового; 7) следить за тем, чтобы перфузия была непрерывной после того, как сердце переместилось в теплый буфер; 8) внимательно следить за температурой внутри ЯМР-трубки в спектрометре рядом с сердцем и поддерживать ее на уровне 37 °С; 9) проверка однородности магнитного поля на протяжении всего измерения; и 10) использование точной и обновленной калибровки для радиочастотных импульсов.

Модификации и устранение неисправностей техники
Мы отмечаем несколько модификаций, которые были сделаны в этом исследовании: 1) начало перфузии ледяным KHB после операции использовалось для защиты сердца; и 2) проверка рН буфера проводилась на протяжении всего времени, чтобы убедиться, что этот параметр находится под контролем и не является источником вариаций результатов. Это было сделано на различных этапах подготовки и экспериментов с использованием pH-метра, индикаторных полосок pH и Pi-сигнала в спектре 31P.

Источники изменчивости и способы их коррекции
Сердце мыши было выбрано для установки в 10-миллиметровую ЯМР-трубку. Тем не менее, это маленькое сердце дает слабые сигналы, и деликатная хирургическая процедура изоляции и перфузии сердца является сложной. В целом, это приводит к переменной жизнеспособности тканей и метаболической активности. Чтобы учесть эту вариабельность, мы нормализовали скорость метаболизма ЛДГ и ФДГ до содержания АТФ (т.е. моль/с/АТФ). Аналогичное использование содержания АТФ в качестве эталона ранее сообщалось в срезах опухоли молочной железы ксенотрансплантата29. Этот тип нормализации выгоден, потому что он позволяет сравнивать с результатами других исследователей и с другими условиями. Кроме того, используя коэффициент пересчета количества АТФ в тканевую массу, можно получить ферментативную активность на массу ткани (для ткани, в которой происходит метаболизм).

В дополнение к вариабельности между различными изолированными сердечными препаратами (т.е. от разных животных), химический сдвиг ткани Pi (Pih) показал неоднородное распределение в этом исследовании. Lutz et al.32 продемонстрировали аналогичное неоднородное распределение в опухолях ксенотрансплантата, и это распределение было проанализировано с использованием многопараметрического подхода. В данной работе данная методика была реализована в перфузированном сердце мыши. Мы отмечаем, что, вероятно, сигнал Pih сообщает преимущественно о внутриклеточном pH, как указывалось ранее16.

Неопределённость
Основополагающее предположение при количественной Equation 18 оценке и заключается в том, что гиперполяризованный [1-13C] раствор пирувата заполняет весь объем, обнаруженный ЯМР-зондом (Vp, уравнение 4A и Equation 19 уравнение 4B). Гиперполяризованный раствор пирувата [1-13C] течет через коронарные артерии сердца, заполняя внеклеточные и внутриклеточные компартменты. Следовательно, предполагается, что объем сердца заполнен гиперполяризованным раствором в той же степени, что и остальная частьVp.

Используя подход15,29 к гиперполяризованному продукту селективного насыщения-возбуждения, ферментативная активность может быть количественно определена независимо от каких-либо вариацийТ1 метаболитов и обратимости ферментативной реакции. Это определение является надежным и невосприимчивым к изменениям в профиляхT1 и возбуждения и, вероятно, более воспроизводимо в разных лабораториях по сравнению с анализом площади под кривой, который зависит от конкретных условий сбора и установки в каждой лаборатории.

Изучение метаболизма пирувата [1-13C], который находится на стыке аэробного и анаэробного метаболизма, имеет большое значение для изучения гипоксии, ишемии, реперфузионного повреждения, голодания и изменения сердечного метаболизма, например, при диабетической кардиомиопатии. Гиперполяризованные аналоги пирувата, меченные 13С, были клинически протестированы 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, и, следовательно, результаты таких исследований, вероятно, являются трансляционными. Самое главное, что наш подход позволяет количественно оценить активность внутриклеточных ферментов во всем органе.

Изолированная подготовка сердца грызунов, а также процедуры и методологии, используемые в этом исследовании, помогут лучше понять влияние различных стрессоров на сердечную функцию, энергетику и обмен веществ, поскольку измеренные параметры в этой модели относятся исключительно к сердцу. В отличие от крысиного сердца, мышиное сердце подходит для изучения трансгенных моделей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Раскрытия информации нет.

Acknowledgments

Этот проект финансировался Израильским научным фондом в рамках грантового соглашения No 1379/18; стипендия Жаботинского Министерства науки и технологий Израиля по прикладным и инженерным наукам для прямых аспирантов No 3-15892 для докторов наук; и исследовательская и инновационная программа Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Биология выпуск 194 Метаболизм метаболическая визуализация агент визуализации магнитно-резонансная спектроскопия лактатдегидрогеназа пируватдегидрогеназа [1-13C]пируват pH неорганический фосфат
Исследование сердечного метаболизма в изолированном перфузированном сердце мыши с помощью гиперполяризованной [1-13 C] пируватной и <sup>13</sup>C<sup></sup>/<sup>31</sup>P ЯМР-спектроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain,… More

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter