Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Förbättrad oljeåtervinning med en kombination av biotensider

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

Vi illustrerar de metoder som är involverade i screening och identifiering av det biotensider som producerar mikrober. Metoder för kromatografisk karakterisering och kemisk identifiering av biotensider, bestämning av biotensiderns industriella tillämplighet för att förbättra restoljeåtervinningen presenteras också.

Abstract

Biotensider är ytaktiva föreningar som kan minska ytspänningen mellan två faser med olika polariteter. Biotensider har framstått som lovande alternativ till kemiska tensider på grund av mindre toxicitet, hög biologisk nedbrytbarhet, miljökompatibilitet och tolerans mot extrema miljöförhållanden. Här illustrerar vi de metoder som används för screening av mikrober som kan producera biotensider. Det biotensidproducerande mikroben identifierades med hjälp av droppkollaps, oljespridning och emulsionsindexanalyser. Produktionen av biotensider validerades genom att bestämma minskningen av ytspänningen hos mediet på grund av tillväxten av de mikrobiella medlemmarna. Vi beskriver också de metoder som är involverade i karakterisering och identifiering av biotensider. Tunnskiktskromatografi av det extraherade biotensideret följt av differentiell färgning av plattorna utfördes för att bestämma biotensiderns natur. LCMS, 1H NMR och FT-IR användes för att kemiskt identifiera biotensider. Vi illustrerar vidare metoderna för att utvärdera tillämpningen av kombinationen av producerade biotensider för att förbättra restoljeåtervinningen i en simulerad sandpackkolonn.

Introduction

Biotensider är de amfipatiska ytaktiva molekylerna som produceras av mikroorganismer som har kapacitet att minska ytan och gränssnittsspänningen mellan två faser1. Ett typiskt biotensider innehåller en hydrofil del som vanligtvis består av en sockerdel eller en peptidkedja eller hydrofil aminosyra och en hydrofob del som består av en mättad eller omättad fettsyrakedja2. På grund av sin amfipatiska natur samlas biotensider vid gränssnittet mellan de två faserna och minskar gränssnittsspänningen vid gränsen, vilket underlättar spridningen av en fas i den andra 1,3. Olika typer av biotensider som hittills har rapporterats inkluderar glykolipider i vilka kolhydrater är kopplade till långkedjiga alifatiska eller hydroxi-alifatiska syror via esterbindningar (t.ex. rhamnolipider, trehalolipider och soforolipider), lipopeptider i vilka lipider är bundna till polypeptidkedjor (t.ex. ytaktin och lichenysin) och polymera biotensider som vanligtvis består av polysackarid-proteinkomplex (t.ex. emulsan, liposan, alasan och lipomannan)4. Andra typer av biotensider som produceras av mikroorganismerna inkluderar fettsyror, fosfolipider, neutrala lipider och partikelformiga biotensider5. Den mest studerade klassen av biotensider är glykolipider och bland dem har de flesta studierna rapporterats på rhamnolipider6. Rhamnolipider innehåller en eller två molekyler rhamnos (som utgör den hydrofila delen) kopplade till en eller två molekyler långkedjiga fettsyror (vanligtvis hydroxi-dekansyra). Rhamnolipider är primära glykolipider som först rapporterades från Pseudomonas aeruginosa7.

Biotensider har fått allt större fokus jämfört med sina kemiska motsvarigheter på grund av olika unika och särskiljande egenskaper som de erbjuder8. Dessa inkluderar högre specificitet, lägre toxicitet, större mångfald, enkel beredning, högre biologisk nedbrytbarhet, bättre skumning, miljökompatibilitet och aktivitet under extrema förhållanden9. Strukturell mångfald av biotensider (figur S1) är en annan fördel som ger dem en fördel jämfört med de kemiska motsvarigheterna10. De är i allmänhet mer effektiva och ändamålsenliga vid lägre koncentrationer eftersom deras kritiska micellekoncentration (CMC) vanligtvis är flera gånger lägre än kemiska tensider11. De har rapporterats vara mycket termostabila (upp till 100 °C) och tål högre pH (upp till 9) och höga saltkoncentrationer (upp till 50 g/l)12 och erbjuder därmed flera fördelar i industriella processer, som kräver exponering för extrema förhållanden13. Biologisk nedbrytbarhet och lägre toxicitet gör dem lämpliga för miljötillämpningar som bioremediering. På grund av de fördelar som de erbjuder har de fått ökad uppmärksamhet inom olika branscher som livsmedels-, jordbruks-, tvättmedels-, kosmetisk och petroleumindustri11. Biotensider har också fått stor uppmärksamhet vid oljesanering för avlägsnande av petroleumföroreningar och giftiga föroreningar14.

Här rapporterar vi produktion, karakterisering och tillämpning av biotensider som produceras av Rhodococcus sp. Stegen som är involverade i screening, karakterisering och applicering av en kombination av biotensider för förbättrad oljeåtervinning beskrivs i figur 1.

Figure 1
Figur 1: En metod för förbättrad oljeåtervinning med en kombination av biotensider. Det stegvisa arbetsflödet visas. Arbetet utfördes i fyra steg. Först odlades och screenades de mikrobiella stammarna för produktion av biotensider genom olika analyser, som inkluderade droppkollapsanalys, oljespridningsanalys, emulsionsindexanalys och ytspänningsmätning. Därefter extraherades biotensider från den cellfria buljongen och deras natur identifierades med hjälp av tunnskiktskromatografi och de identifierades vidare med lcms, NMR och FT-IR. I nästa steg blandades de extraherade biotensider ihop och potentialen hos den resulterande blandningen för förbättrad oljeåtervinning bestämdes med hjälp av sandpackkolonntekniken. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Screening av dessa mikrobiella stammar för att producera biotensider gjordes genom droppkollaps, oljespridning, emulsionsindexanalys och bestämning av minskning av ytspänningen hos det cellfria mediet på grund av tillväxten av mikroberna. Biotensider extraherades, karakteriserades och identifierades kemiskt av LCMS, 1H NMR och FT-IR. Slutligen framställdes en blandning av biotensider som producerades av dessa mikrober och användes för att återvinna restoljan i en simulerad sandpackkolonn.

Föreliggande studie illustrerar endast de metoder som är involverade i screening, identifiering, strukturell karakterisering och tillämpning av kombinationen av biotensider för att förbättra restoljeåtervinningen. Det ger inte en detaljerad funktionell karakterisering av de biotensider som produceras av de mikrobiella stammarna15,16. Olika experiment såsom kritisk micellebestämning, termogravimetrisk analys, ytvätning och biologisk nedbrytbarhet utförs för detaljerad funktionell karakterisering av något biotensider. Men eftersom detta dokument är ett metodpapper ligger fokus på screening, identifiering, strukturell karakterisering och tillämpning av kombinationen av biotensider för att förbättra restoljeåtervinningen; dessa experiment har inte inkluderats i denna studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillväxt av mikrobiella stammar

  1. Väg 2 g Luria Broth pulver och tillsätt till 50 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv. Blanda innehållet tills pulvret löser sig helt och fyll på volymen till 100 ml med destillerat vatten.
  2. På samma sätt bereda ytterligare två kolvar med 100 ml Luria Broth och placera bomullsproppar på kolvarnas hals.
  3. Täck bomullspluggarna med aluminiumfolie och autoklav kolvarna i 15 minuter vid 121 °C och 15 psi för att sterilisera mediet.
  4. Låt mediet svalna till rumstemperatur efter autoklavering.
  5. För beredning av primärkultur av en stam, välj en enda koloni från en LA-platta med användning av en ympningsslinga och inokulera i ett provrör innehållande 5 ml steril Luria-buljong.
  6. Inkubera provröret över natten vid 30 °C vid 180 rpm.
  7. Inokulera kolvarna som innehåller 100 ml autoklaverad Luria Broth genom att tillsätta 1 ml över natten odlade frökulturer till kolvarna inuti det laminära luftflödesskåpet.
  8. Inkubera kolvarna i en roterande inkubator vid 30 °C och 180 rpm i 7 dagar.
  9. Efter avslutad inkubationsperiod, skörda kolvarna och överför odlingsbuljongen till centrifugrören. Centrifugera odlingen vid 4 500 x g i 20 min i en kyld centrifug vid 4 °C.
  10. Häll försiktigt den cellfria supernatanten i en färsk bägare och använd den i screeninganalyser för produktion av biotensider.

2. Screeninganalyser för produktion av biotensider

OBS: I följande avsnitt användes kommersiellt ytaktivt medel (Saponin) som en positiv kontroll medan vatten och oinokulerade medier användes som en negativ kontroll.

  1. Analys av droppkollaps
    1. Ta en ren glasskiva och belägg ytan på bilden med 200 μL olja.
    2. Tillsätt 20 μL av den cellfria supernatanten till mitten av oljan och låt den ostörd stå i 2-3 min.
      OBS: Om droppen kollapsar, poängsätta supernatanten positiv för närvaron av biotensider.
  2. Analys av oljespridning
    1. Ta 20 ml dubbeldestillerat vatten i en petriplatta (75 mm diameter) och tillsätt 200 μL råolja till vattenytan.
    2. Tillsätt 20 μL cellfri supernatant i mitten av oljan och låt den ostörd stå i 1 min.
      OBS: Om en rensningszon bildas på grund av oljeförskjutning, poängsätt supernatanten positiv för närvaron av biotensider.
  3. Analys av emulsionsindex (E24-analys )
    1. Tillsätt 4 ml bensin (bensin) och cellfri supernatant vardera i ett rent provrör i glas.
    2. Virvla blandningen kraftigt i 3 min och låt den ostörd under de kommande 24 timmar.
    3. Efter 24 timmar bestämmer du E24-indexet i procent av höjden på det emulgerade skiktet (cm) med avseende på höjden på hela vätskekolonnen (cm).
      Equation 1
      OBS: Om en emulsion (olja i vatten eller vatten i olja) observeras efter 24 timmar, kommer supernatanten sannolikt att innehålla biotensidern.
  4. Mätning av ytspänning
    OBS: Ytspänningen mättes med Du Noüy-ringmetoden17. Instrumentet som används i detta experiment (se Materialtabell) är mycket känsligt, så se till att glaskärlet och sonden rengörs korrekt.
    1. Slå på systemet och dubbelklicka på den tillhörande programvaran för att öppna den.
    2. Rengör glaskärlet med vätskan vars ytspänning ska bestämmas.
    3. Tillsätt vätskan (40 ml) i kärlet och montera kärlet på kärlhållaren.
    4. Lås upp sondhållaren och montera sonden på den. Lås nu sondhållaren genom att trycka på låsknappen på den manuella styrenheten.
    5. Justera plattformens höjd med hjälp av den manuella styrenheten så att sonden är cirka 2-3 mm från vätskans yta.
    6. Använd nu programvaran för att mäta ytspänningen. Klicka på Fil längst upp till vänster på skärmen. Klicka på Öppna arbetsyta. Ett popup-fönster visas.
    7. Bläddra ner och dubbelklicka på ikonen K100: Surface and Interfacial Tension .
    8. Klicka nu på filikonen längst upp till vänster på skärmen. Klicka på Ny databas. Ange namnet för att spara data och klicka på OK.
    9. Klicka igen på Arkiv > Ny mätning > SFT > Ring. Ange namnet på mätningen. Kontrollera att konfigurationsmallen visar SFT-ringen.
    10. Fyll i detaljerna i fönstret Mätkonfiguration genom att välja sonden och fartyget som används för mätningen. Fyll också i detaljerna om vätskan och gasfasen.
      OBS: Vätskefasen kommer att vara vatten, medan gasfasen kommer att vara luft. Vätskefasens densitet är densiteten hos den cellfria supernatanten. Detta kan bestämmas genom att ta vikten av 50 ml av vätskan och beräkna densiteten som Kg / m3.
    11. Klicka nu på fliken Procedur och fyll i följande uppgifter: Detekteringshastighet: 6 mm/min, Detekteringskänslighet: 0,005 g, Sökhastighet: 6 mm/min, Sökkänslighet: 0,005 g, Mäthastighet: 3 mm/min, Mätkänslighet: 0,001 g, Nedsänkningsdjup: 3 mm, Returavstånd: 10%, korrigering: Harkins & Jordan, maxvärden: 5. Klicka på OK.
    12. I popup-fönstret väljer du databasen för att lagra data och klickar på OK.
      OBS: Man kan skapa en ny databas här eller lägga till nya mätningar till befintliga data.
    13. Klicka nu på Play-knappen längst upp i mitten av skärmen. Systemet börjar köra skriptet. När systemet stabiliserats kommer det att upptäcka ytan. Sänk ner sonden i vätskan, flytta sonden fram och tillbaka och upptäck spänningen i den bildade lamellen.
    14. För att få resultaten, klicka på mätikonen längst till vänster på skärmen. Klicka på Data och anteckna den ytspänning som bestämts.
    15. Efter avslutad mätning, sänk plattformens höjd och lås upp och demontera sonden och fartyget från instrumentet.
      OBS: För att bestämma minskningen av ytspänningen på grund av produktion av biotensider bör oinokulerad LB användas som kontroll.

3. Extraktion av biotensider

  1. Justera pH-värdet för den cellfria supernatanten till 2 med 2 N HCl. Förvara blandningen vid 4 °C över natten.
  2. Tillsätt samma volym kloroform-metanolblandning (2:1) till supernatanten och blanda kraftigt i 20 min.
  3. Låt blandningen ostört för att fasseparation ska ske.
  4. Ta bort den övre fasen som innehåller vatten och metanol och låt den nedre fasen som innehåller biotensidern avdunsta i en draghuv.
  5. Efter avdunstning av den organiska fasen, återupplös det honungsfärgade råa biotensider i 3 ml kloroform och använd denna blandning för ytterligare identifiering och karakterisering av biotensider.

4. Studier av emulsionsstabilitet

  1. Emulsionsstabilitet vid olika temperaturer
    1. Ta 5 ml cellfria supernatanter i olika provrör.
    2. Tillsätt 5 ml bensin till varje provrör och blanda kraftigt genom att virvla i 3 minuter.
    3. Inkubera provrören över natten i olika vattenbad vid olika temperaturer (30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C och 70 ° C).
    4. Efter 24 timmar, uppskatta emulsionindexen som tidigare nämnts.
  2. Emulsionsstabilitet vid olika pH-värden
    1. Ta 5 ml av den cellfria supernatanten i rena provrör.
    2. Justera pH-värdet för cellfria supernatanter (2, 4, 6, 8 och 10) med 1 N HCl och 1 N NaOH.
    3. Tillsätt lika mycket bensin i provrören och blanda kraftigt genom att virvla i 3 min.
    4. Låt provrören ostöra stå i rumstemperatur i 24 timmar.
    5. Uppskatta emulsionsindexet som tidigare nämnts.
  3. Emulsionsstabilitet vid olika saltkoncentrationer
    1. Ta 5 ml av den cellfria supernatanten i rena provrör.
    2. Tillsätt olika mängder salt (NaCl) till supernatanterna (0 g /L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L och 80 g/L).
    3. Lös upp salterna i de cellfria supernatanterna genom att virvla i 3 min.
    4. Tillsätt lika mycket bensin i provrören och blanda kraftigt genom att virvla i 3 min.
    5. Låt provrören ostöra stå i rumstemperatur i 24 timmar.
    6. Uppskatta emulsionsindexet efter 24 timmar.

5. Bestämning av biotensiderns art

  1. TLC för det extraherade biotensidermedlet
    1. Spot 20 μL av biotensider på TLC-plattor. Spot 2 μL på en gång.
    2. Spot biotensider på tre olika TLC-plattor.
    3. Förbered en 100 ml blandning av elueringsstället innehållande kloroform:metanol (2:1) och tillsätt elueringstet till TLC-kammaren. Stäng locket på kammaren och låt det mätta i 20 minuter.
    4. Efter torkning av plattorna, placera TLC-plattorna inuti kammaren mättad med en kloroform metanolblandning och kör TLC.
    5. När elueringsen har nått toppen av TLC-plattan (1 cm från toppen), ta ut plattorna och låt den lufttorka.
  2. Färgning för lipiddetektering
    1. Ta en ren TLC-kammare och tillsätt några (5-10) granuler jod i den färska kammaren och mätta kammaren i 5 till 10 minuter.
    2. Placera TLC-plattan inuti kammaren och observera för utvecklingen av de gula fläckarna. Om fläckarna uppträder, poängsätt biotensider positivt för närvaron av lipidkomponenten.
  3. Färgning för peptid- eller aminosyradetektering
    1. Förbered en ninhydrinlösning genom att lösa upp 0,4 g ninhydrin i 20 ml butanol. Tillsätt 0,6 ml 100% isättika till blandningen.
    2. Spraya TLC-plattan med ninhydrinlösning och låt den lufttorka i 2 minuter. Värm plattan vid 110 ° C och observera färgens utveckling.
      OBS: Om de blå fläckarna dyker upp, poängsätt biotensider positivt för närvaron av någon peptidkedja eller aminosyra.
  4. Färgning för kolhydratdetektering
    1. Förbered en lösning av p-anisaldehyd genom tillsats av 2 ml p-anisaldehyd till 48 ml isättika innehållande 1 mlH2SO4. Tillsätt 0,6 ml ättiksyra till blandningen.
    2. Spraya blandningen jämnt på en TLC-platta och låt den lufttorka i 2 minuter.
    3. Inkubera plattan vid 110 ° C och övervaka utvecklingen av fläckar.
      OBS: Om de gröna eller bruna fläckarna dyker upp, poängsätt biotensider positivt för närvaron av kolhydrater.

6. Kemisk identifiering av biotensider

  1. LCMS för biotensider
    1. Lös upp 25 mg av det extraherade biotensidermedlet i 1 ml kloroform.
    2. Utför LCMS (i en låsspraykonfiguration med en referensskanningsfrekvens på 10 s) med en C18-kolumn.
    3. Använd kloroform:metanol (1:1) som en mobil fas och injicera 2 μL av provet i kolonnen med en flödeshastighet på 0,1 ml/min.
    4. Ställ in de experimentella parametrarna på: polaritet: ES-positiv, kapillärspänning: 3 kV, källtemperatur: 80 °C, desolvationstemperatur: 300 °C, avfettningsgasflöde: 7 000 l/h och fällgasflöde: 0,40 ml/min.
    5. Skanna intervallen från 100 till 1 200 Da under en detektionstid på 20 minuter och undersök jonerna i positivt ES-läge.
    6. Analysera m/z-värdena med hjälp av valfri programvara för masspektrometrikvantitet.
    7. För analys, logga in på programvaran.
    8. Klicka på Batch Search och ange listan över de erhållna massorna. Undersök resultaten i ett positivt laddningsläge och använd M + H och M + Na som addukter. Behåll noggrannheten till 10 PPM och kryssa på Display Structure.
    9. Klicka på Sök och välj den med den lägsta PPM-nivån i listan över föreningar.
  2. 1 H NMR för biotensider
    OBS: 1H NMR av biotensidern utfördes med användning av en 400 MHz NMR-spektrometer (se Materialtabell).
    1. Lös upp 5 mg av biotensider i 1 ml deuterad kloroform (CdCl3).
    2. Överför blandningen till ett NMR-rör. Täck röret ordentligt och sätt in röret i skiftnyckeln. Justera rörets höjd med hjälp av justerröret.
    3. Placera röret tillsammans med skiftnyckeln i NMR-maskinen och följ stegen som nämns nedan för att få ett NMR-spektrum.
    4. För att välja provrörstyp: sx N, där N är den position där röret placerades (t.ex. sx 13, om röret placerades i 13: e positionen) i tillhörande programvara.
    5. Skriv edc och tryck på Enter för att skapa en ny mapp där data kan lagras.
    6. En popup visas. Välj lösningsmedlet genom att klicka på CdCl 3 i listan och ange provets namn.
    7. För att starta protokollet, skriv "getprosol"; för att låsa lösningsmedlet, skriv "lås cdcl3".
    8. Skriv "topshim" för att shimsa provet och skriv slutligen "rga;zgefp" för att hämta data. Detta startar protokollet.
    9. När spektra har erhållits skriver du "apk;abs n" och trycker på enter för fas- och baslinjekorrigering.
    10. För att välja primära toppar, skriv "pp" och tryck på Enter. För att bara välja intensiva toppar, ange "mi" och skriv in intensiteten över vilken topparna ska väljas. Standardvärdet blir 0,2.
    11. För att integrera topparna, klicka på Integrera och placera markören på vänster sida av toppen som ska integreras och medan du håller markören klicka och dra markören runt toppen.
    12. Spara data genom att klicka på Arkiv i det övre vänstra hörnet och klicka sedan på Spara.
    13. Provet kan matas ut från maskinen genom att skriva "sx ej".
    14. Analysera topparna och bestäm miljön hos H-atomerna.
  3. Fourier Transform infraröd spektroskopi av biotensider
    OBS: FT-IR av extraherat biotensider utfördes med användning av en kommersiellt tillgänglig spektrofotometer i ATR-läge (se Materialtabell).
    1. Slå på spektrofotometern och kontrollera rensningen, torkmedlet och detektorn.
    2. För att samla in ett spektrum, samla först bakgrundsspektrumet utan ett prov på plats.
    3. Ta det extraherade biotensider och torka det helt. Placera det torkade biotensidern direkt över diamantkristallen, tryck och tryck på ATR-beröringspunkten.
    4. I programvaran väljer du antalet skanningar (ange 30) och skannar spektrumet från 400 cm-1 till 4000 cm-1.
    5. Klicka på OK för att lägga till provspektrumet i spektralfönstret.
    6. Klicka på Filer > Spara > Spara som och ange filnamnet följt av tillägget .spa och klicka på OK.

7. Applicering av biotensider (förbättrad oljeåtervinning)

OBS: I detta experiment användes dubbelt destillerat vatten som en negativ kontroll och 10% SDS, 10% Tween 80 och 10% kommersiellt saponin användes som positiva kontroller.

  1. Ta glaset och försegla bottenutloppet med glasull och glasplätor.
  2. Packa kolonnen med sandjord på ett sådant sätt att lite vätska kan tillsättas på toppen av jorden och genomströmningen kan samlas i botten. Montera kolonnen på hållaren och lägg till några glaspärlor ovanpå jorden.
  3. Översvämma kolonnen med 50 ml saltlösning och samla flödet genom för att bestämma porvolymen.
    porvolym = volym saltlösning tillsatt ovanpå - volym av uppsamlat flöde.
  4. Ta bort saltlösningen från kolonnen genom att tvinga råolja att passera genom den efter tillsats från toppen av kolonnen. Samla volymen av saltlösningen och oljan som kommer ut ur kolonnen för att bestämma initial oljemättnadsvolym. Volymen av saltlösningen som frigörs från kolonnen kommer att vara den ursprungliga oljemättnadsvolymen eller originaloljan på plats.
  5. Låt kolonnen stå ostörd i 24 timmar.
  6. Efter 24 timmar, översvämma kolonnen med 10 porvolymer saltlösning och samla oljan som kommer ut ur kolonnen för att uppskatta sekundär oljeåtervinning. Oljan kvar i kolonnen efter sekundär oljeåtervinning motsvarar restoljan.
  7. Bered en blandning av biotensider genom att tillsätta lika stora volymer av det extraherade biotensider (extraherat efter steg 3.5) till glasbägaren. Tillsätt biotensider till toppen av kolonnen och inkubera kolonnen i 24 timmar.
  8. Efter 24 timmar mäter du mängden olja och vatten för att bestämma ytterligare eller förbättrad oljeåtervinning. Volymen av oljan som frigörs från kolonnen kommer att motsvara den återstående oljan som återvinns.
  9. Uppskatta förbättrad oljeåtervinning med följande ekvation:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre bakteriestammar (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 och Paenibacillus sp. IITD108) screenades för produktion av biotensider genom olika analyser, som inkluderade droppkollapsanalys, oljeförskjutningsanalys, emulsionsindexanalys och ytspänningsreduktion. Cellfria supernatanter av alla de tre bakteriestammarna och en lösning av kemiskt ytaktivt medel resulterade i en droppkollaps och fick därför positiva poäng för närvaron av biotensider (figur 4a). Å andra sidan kollapsade inte vattendroppen och fick därför negativt poäng för närvaron av biotensider. Kommersiellt ytaktivt medel och de cellfria supernatanterna i de tre bakteriekulturerna lyckades också förskjuta oljeskiktet i oljespridningsanalysen och fick därför positiva poäng för närvaron av biotensider (figur 4b). Vatten, å andra sidan, kunde inte förskjuta någon olja och fick därför negativ poäng. I emulsionsindexanalyser observerades en stabil emulsion i provrör innehållande kommersiellt ytaktivt medel och supernatanterna hos de tre mikrobiella stammarna. Ingen emulsion observerades emellertid i provröret innehållande oinokulerat odlingsmedium (figur 4c). Detta föreslog återigen att Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 och Paenibacillus sp. Bekräftelse av produktion av biotensider erhölls genom att mäta ytspänningen hos den cellfria buljongen och jämföra den med den oinokulerade kontrollen. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 och Paenibacillus sp. IITD108 befanns minska mediets ytspänning från 58,89 mN/m till 45,41 mN/m, 45,82 mN/m respektive 28,43 mN/m (figur 5).

IFT-mätningar utfördes med hjälp av ringdragningsmetoden. Biotensider från alla de tre stammarna kunde avsevärt minska gränssnittsspänningarna mellan olika vattenhaltiga och organiska faser (tabell S1). Ytspänningen och gränssnittsspänningsmätningarna bekräftar att alla de tre stammarna producerar biotensider.

IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 och Paenibacillus sp. IITD108 resulterade i koncentrationer av biotensider på 820 mg/L, 560 mg/L respektive 480 mg/L.

Som observerats i figur 4C var emulsionen som bildades av biotensidern vatten i oljemikroemulsion. Analyser av emulsionsstabilitet visade att biotensider uppvisade en god stabilitet under olika miljöförhållanden (figur 6). De producerade emulsionerna var mycket stabila över olika temperaturer (figur 6a), pH-värden (figur 6b) och saltkoncentrationer (figur 6c) testade.

Tunnskiktskromatografi utfördes för att bestämma arten av biotensider. Färgning av plattorna med jodånga resulterade i utvecklingen av gula fläckar i alla biotensider och kontrollen (Biotensider från Bacillus sp. IITD 106 (Figur 7a). Detta indikerade att biotensider innehöll en lipiddel. Inga blåfärgade fläckar erhölls i någon av TLC-plattorna vid färgning med ninhydrin (figur 7b). Detta visade att biotensider inte innehöll någon peptiddel. Blå och gröna fläckar observerades i alla TLC-plattor, när de färgades med anisaldehydfläck (figur 7c). Detta visade att biotensider innehöll en kolhydratdel. Av resultaten av TLC drogs slutsatsen att alla biotensider var glykolipider.

Kemisk identifiering av biotensider med LCMS avslöjade att Rhodococcus sp. IITD102 och Lysinibacillus sp. IITD104 producerar samma typ av biotensider, som identifierades som Di-rhamnopyranosisk hydroxidekansyra med en massa av 480,25 Da. Strukturen av biotensider stöddes av 1H NMR- och FT-IR-data (figur 8).

I 1H NMR-spektrum representerade de kemiska skiften erhållna vid 7, 2 protonerna i karboxylgrupper. Kemiska skift motsvarande protoner av metylgrupp erhölls i intervallet 1-2 ppm. Skift motsvarande protoner bundna till alkylgrupper erhölls vid 2, 3 ppm. FT-IR-spektra av biotensider extraherade från Rhodococcus sp. IITD102 och Lysinibacillus sp. IITD104 visade närvaron av starka toppar vid vågnummer 3,290 cm-1, vilket bekräftar närvaron av OH-funktionell grupp. En liten topp vid vågnummer 2 951 cm-1 motsvarar CH-sträckning. En stark topp vid 1 620 cm-1 representerade närvaron av karboxylgrupp i biotensider. Andra toppar som erhölls vid 1 530, 1 410, 1 200 och 1 060 bekräftade närvaron av alkyl-,CH3-, C-O-C- respektive C-CH3-funktionella grupper. Både NMR- och FT-IR-data stödde strukturen hos biotensidern som bestämdes från LCMS-studier. LCMS av rå biotensider från Paenibacillus sp. IITD108 (Figur 9) visade att det producerar en rhamnolipid innehållande tre lipidkedjor som bildar den fluorkoliska kärnan i biotensidern. Biotensider identifierades som 2decanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hydroxidekansyra med en massa av 802 Da. Resultaten av LCMS stöddes av 1H NMR- och FT-IR-data.

Upplägget för förbättrad oljeåtervinning visas i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Experimentell uppsättning för förbättrad oljeåtervinning med hjälp av sandpackkolonntekniken. Kolonnen packad med jord monterades på hållaren. Bottenutloppet förseglades med glasull och glasplätor. Efter sekundär återvinning utsattes restoljan inuti kolonnen för ökad oljeåtervinning genom tillsats av blandningen av biotensider till den. Röret placerat längst ner i kolonnen användes för att samla den eluerade fraktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

I det simulerade förbättrade oljeåtervinningsexperimentet, av 50 ml saltlösning tillsatt till toppen av kolonnen, samlades 12 ml i genomströmningen och därför uppskattades porvolymen till 38 ml. När olja tvingades genom kolonnen släpptes 33 ml saltlösning från kolonnen. Detta representerade initial oljemättnadsvolym. Sekundär återvinning med användning av 10 porvolymer saltlösning resulterade i eluering av 10 ml olja. Restoljan kvar i kolonnen var 23 ml. Vatten som innehöll blandningen av biotensider kunde återvinna 13 ml olja från kolonnen (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Simulerad förbättrad oljeåtervinning med hjälp av en sandpackkolonn. Den initiala oljemättnadsvolymen för både kontroll- och testkolonnen var cirka 33 ml. Under sekundär oljeåtervinningen återfanns cirka 10 ml olja från både kontroll- och testkolonnerna. Skillnaderna i testets och kontrollkolonnernas återvinningsprofiler observerades endast under återvinningen av den kvarvarande oljan kvar i kolonnen. Blandningen av biotensider resulterade i ytterligare återvinning av 13 ml restolja kvar från testkolonnen medan i kontrollkolonnen endast 1,03 ml olja återfanns i detta steg. Detta visar att blandningen av biotensider har stor potential att öka återvinningen av restolja från reservoarerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Detta innebar förbättrad oljeåtervinning. Därför kunde vatten innehållande blandningen av biotensider återvinna 56,52% av restoljan från kolonnen (tabell 1). Å andra sidan kunde lösningar av 10% SDS, 10% Tween 80 och 10% saponin återvinna 85%, 68% och 73% restolja från kolonnen.

Parametrar Kontrollera översvämningar Kombinerad översvämning av biotensider 10 % SDS 10 % Tween 10 % Saponin
Pv (ml) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (ml) 33 33 33 29 33
Kassa (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
SOR (ml) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (ml) 23.23 23 21.5 18.8 23
ROS (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ROR (ml) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
AOR (%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

där PV = porvolym bestämd efter initial kolonnmättnad med saltlake, OOIP = originalolja på plats, IOSV = initial oljemättnadsvolym, POS = Procentuell oljemättnad, Sv = volym saltlösning tillsatt för sekundär återvinning, SOR = sekundärolja som återvunns efter översvämning av saltlake, ROC = restolja i kolonn efter sekundär återvinning, ROS = restoljemättnad, ROR = Restolja som återvunns efter översvämning av biotensider, AOR = ytterligare olja som återvinns

Tabell 1: Simulerad förbättrad oljeåtervinning i en sandpackkolonn.

Figure 4
Figur 4: Screeninganalyser för produktion av biotensider (a) Drop collapse assay: Vattendroppen kollapsade inte efter att ha tillsatts till den oljebelagda ytan medan det kemiska ytaktiva ämnet och cellfria supernatanterna hos de tre bakteriestammarna resulterade i droppkollapsen. b) Oljeförskjutningsanalys: Vattendroppen ledde inte till förskjutning av oljan medan det kemiska tensiden och de cellfria supernatanterna hos de tre bakteriestammarna trängde undan oljelagren (c) Analys av emulsionsindex: De cellfria supernatanterna och den kommersiella tensidlösningen resulterade alla i bildandet av ett stabilt emulsionsindex. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Minskning av ytspänningen på grund av produktion av biotensider. Bestämning av minskning av mediets ytspänning på grund av mikrobiell tillväxt bekräftade produktionen av biotensider av de mikrobiella medlemmarna. IITD 102 och Lysinibacillus sp. IITD 104 minskade mediets ytspänning från 59 mN/m till 45 mN/m. På grund av tillväxten av Paenibacillus sp. IITD 108 minskade mediets ytspänning från 59 mN / m till 28 mN / m. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Emulsionsstabilitet vid olika (a) temperaturer, (b) pH-värden och (c) saltkoncentrationer. Alla emulsioner som genereras med användning av supernatanterna hos de tre mikrobiella stammarna och blandningen av kommersiellt ytaktivt medel visar stor stabilitet under olika miljöförhållanden. Inom de testade temperatur-, pH- och saltkoncentrationsområdena var de emulsionsindex som bestämdes likartade och ingen större minskning av EI observerades vid högre värden av de varierande faktorer som tyder på att biotensider kan användas under extrema miljöförhållanden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: TLC-karakterisering av biotensider (a) Plattor färgade med jodånga: Olika fläckar som utvecklats på TLC-plattan visar att de extraherade biotensider är en blandning av olika föreningar innehållande en lipidgrupp. Fläckarna markerade med blå pil representerar biotensider, som har färgat positivt för närvaron av lipiddel. De andra fläckarna representerar resten av föreningarna som finns i blandningen av det råa biotensideret. b) Plattor betsade med ninhydrin: Inga lila fläckar uppstod när plattorna färgades med ninhydrin. Detta representerade frånvaro av aminosyror i biotensidblandningen och (c) Plattor färgade med anisaldehyd: Ljusgröna och gula fläckar uppträdde på TLC-plattan och dessa representerar föreningarna som innehåller sockerarter. Fläckarna markerade med svarta pilar representerar de biotensider som har färgat positivt för närvaron av kolhydratdeln. Fläckarna som färgade både med jod och anisaldehyd representerar föreningar som innehåller både lipid- och kolhydratdelar och kan eventuellt vara ett glykolipidbiotensider. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Kemisk karakterisering av biotensider extraherat från Rhodococcus sp. a) representerar FT-IR-spektra för de biotensider som extraherats från Rhodococcus sp. IITD 102 och Lysinibacillus sp. IITD 104, b) representerarH1 NMR-spektra för de biotensider som extraherats från Rhodococcus sp. IITD 102 och Lysinibacillus sp. IITD 104, och (c) visar strukturen hos de råa biotensider som extraherats från Rhodococcus sp. IITD 102 och Lysinibacillus sp. IITD 104. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Kemisk karakterisering av det biotensider som extraherats från Paenibacillus sp. a) representerar FT-IR-spektra för de biotensider som extraherats från Paenibacillus sp. IITD 108, b) representerar 1H NMR-spektra av de biotensider som extraherats från Paenibacillus sp. IITD 108, och c) visar strukturen hos de råa biotensider som extraherats från Paenibacillus sp. IITD 108. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur S1: Struktur för olika typer av biotensider. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tabell S1: Effekt av biotensider på gränssnittsspänningen (IFT) mellan vatten och kolväten. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biotensider är en av de mest mångsidiga grupperna av biologiskt aktiva komponenter som blir attraktiva alternativ till kemiska tensider. De har ett brett utbud av applikationer inom många branscher som tvättmedel, färger, kosmetika, livsmedel, läkemedel, jordbruk, petroleum och vattenbehandling på grund av deras bättre vätbarhet, lägre CMC, diversifierad struktur och miljövänlighet18. Detta har lett till ett ökat intresse för att upptäcka fler mikrobiella stammar som kan producera biotensider. Här illustrerar vi metoderna för screening, identifiering och applicering av en blandning av biotensider som produceras av Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. Produktionen av biotensider screenades genom fallkollaps, oljespridning, analys av emulsionsindex och bekräftades genom att mäta minskningen av ytspänningen hos mediet på grund av mikrobiell tillväxt. Olika rapporter om produktion av glykolipida biotensider (rhamnolipider och trehalolipider) från Rhodococcus finns i litteraturen 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. har rapporterat produktion och optimering av ett lipopeptid biotensider från Paenibacillus sp. alvei ARN6325. Bezza et al. har rapporterat biologisk nedbrytning av pyren av ett lipopeptidbiotensider framställt av Paenibacillus dendritiformis CN526. Biotensid produktion (Lipopeptider och glykolipider) har också rapporterats av andra stammar av Paenibacillus 27,28,29,30,31. Olika arter av Lysinibacillus har rapporterats producera biotensider 32,33,34. Lysinibacillus sphaericus har rapporterats producera rhamnolipid som kan solubilisera hydrofoba bekämpningsmedel35.

En av de fördelar som biotensider erbjuder jämfört med sina kemiska motsvarigheter är deras stabilitet under extrema miljöförhållanden. De biotensider som produceras av Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 och Paenibacillus sp. IITD 108 analyserades för deras stabilitet under olika temperatur-, pH- och saltkoncentrationer och befanns vara stabila under extrema värden av dessa parametrar. Tidigare rapporterade Habib et al. en lipopeptid producerad av kolvätenedbrytande Rhodococcus sp. som visade stabilitet över olika temperaturintervall, pH-värden och saltkoncentrationer36. Ökad koncentration av oorganiska salter har rapporterats öka stabiliteten hos emulsionen37. Kolloidernas tendens att agglomerera eller separera är en funktion av de attraktiva (Van der Walls-krafterna) och repulsiva krafterna (elektrostatiska krafter) som är involverade under partikelinteraktion38. Saltkristallerna vid upplösning i vatten etablerar sina egna elektriska laddningar och jonerna frigör adsorberar på emulsionsdropparna. Vid ökning av saltkoncentrationen minskar expansionen och avstötningen av det andra skiktet. Ju högre laddningsdensitet hos en jon, desto lägre är längden på det elektriska skiktet. Således resulterar tvåvärda katjoner såsomNa2+ i bildandet av stabilare emulsioner jämfört med monovalenta katjoner39.

En annan fördel som biotensider har jämfört med kemiska tensider är att de är biologiskt nedbrytbara40. Zeng et al. har jämfört nedbrytningsförmågan hos syntetiskt ytaktivt medel Triton X 100, linjära alkylbensensulfonater (LAS) och rhamnolipid och funnit att rhamnolipid biotensider var helt nedbrutet medan LAS och Triton X 100 endast delvis försämrades41. Liu et al. rapporterar också att i motsats till syntetiska tensider CTAB, Triton X 100 och SDS uppvisar rhamnolipid ingen toxicitet och kan lätt brytas ned av B. subtilis och andra kompostmikroorganismer42.

De biotensider som producerades av alla tre mikrobiella stammarna visade sig vara glykolipider. Rhodococcus har tidigare rapporterats producera glykolipid av olika forskargrupper 20,21,23. Liknande rapporter om glykolipid biotensider produktion av Lysinibacillus och Paenibacillus finns också i litteraturen31,32,35,43,44. Kemisk identifiering av biotensider visade att de var rhamnolipider. Rhamnolipider är klassen av glykolipida biotensider som innehåller en eller två rhamnosenheter anslutna till en lipidkedja45. De är den mest studerade typen av biotensider. Olika mikrobiella stammar har rapporterats producera rhamnolipider 7,46,47,48,49. Rhamnolipider har rapporterats uppvisa hög potential för att förbättra återvinningen av restolja 50,51,52,53. I vår studie fann vi att blandningen av biotensider som produceras av Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 och Paenibacillus sp. IITD 108 återhämtade sig framgångsrikt cirka 56,52% av restoljan i ett simulerat sandpaketkolonntest. Detta visade att blandningen av biotensider kan användas för återvinning av restolja från markreservoarerna. I ett liknande sandpakettest har Sun et al. rapporterat att biotensider lyckades återvinna 50% av restoljan54. Biotensider som innehåller cellfri buljong av Bacillus subtilis har också rapporterats vara effektiva för att återvinna 33 % avrestoljan 55. Restoljeåtervinning på 27% och 26%-36% har också rapporterats av Darvishi et al. och Wahabi et al.56,57.

Ekonomisk utvärdering av biotensider för återvinning av restolja från reservoarer visar att utnyttjande av biotensider i EOR är ekonomiskt ett lönsamt alternativ. Moutinho et al. rapporterade att den typiska kostnaden för ett kommersiellt biotensider (rhamnolipider) är cirka 59,6 USD per kg58. I en annan studie har det också rapporterats att koncentrationen av biotensider på 28 mg/l biotensider förbättrade återvinningen av restolja och ledde till produktion av 52,5 m3 ytterligare olja59. Studierna visade att koncentrationen av biotensider på 10 mg/l var tillräcklig för att mobilisera oljeåtervinningen. Enligt de rapporterade uppgifterna är mängden biotensider som krävs för att producera 52,5 m3 ytterligare olja cirka 0,525 kg. Den totala produktionskostnaden för 52,5 m3 olja är cirka 21463 US $varav endast 30 USD är produktionskostnaden för biotensidern. Uppgifterna visar att den procentuella kostnaden för biotensider i oljeproduktionen per fat endast är 0,0000139%.

Våra resultat tyder på att kombinationen av biotensider effektivt kan användas för att återvinna restolja från reservoarerna. Såvitt vi vet är detta den första rapporten om att förbättra återvinningen av restoljan från reservoaren med hjälp av en blandning av biotensider som produceras av olika mikrobiella stammar. Även om vår studie tydligt beskriver de metoder som är involverade i screening, strukturell karakterisering och tillämpning av biotensider vid förbättrad oljeåtervinning, ger studien inte en detaljerad funktionell karakterisering av biotensider, vilket påverkar deras effektivitet i olika applikationer. Kritisk micellkoncentration, som är måttet på effektiviteten hos något ytaktivt medel vid bildandet av micellerna och specificerar den begränsande koncentrationen av tensiden för dess meningsfulla användning, har inte fastställts i föreliggande studie60. På samma sätt har den termiska stabiliteten hos biotensidern, som bestämmer dess tillämplighet vid reservoarförhållanden för EOR, inte heller beskrivits61. Biotensider i vissa applikationer används också som antibiofilmmedel. Deras ytvätbarhet spelar en viktig roll för att bestämma deras antibiofilm natur. Ytvätbarhetsstudier har inte heller genomförts i det aktuella arbetet62. Andra funktionella egenskaper som är viktiga i olika tillämpningar av biotensider, som inkluderar deras biologiska nedbrytbarhet och antimikrobiella natur har inte heller fastställts i denna studie63,64. Således har vi fokuserat på strukturell karakterisering av biotensider. Beroende på målapplikationen kan funktionell karakterisering såsom stabilitet, biologisk nedbrytbarhet och antimikrobiell aktivitet utföras.

I droppe kollapsanalysen och oljespridningsanalysen, för att öka synligheten, är det bättre att använda en olja som har viss färg. I oljespridningsanalysen bör emulsionen observeras efter 24 timmar. Lätta skum, om de bildas, sönderdelas på 24 timmar. Tensiometrar är mycket känsliga instrument, därför bör kärlet och sonden rengöras ordentligt före varje mätning för att undvika eventuella fel på grund av överföringar av senaste mätningar. Extraktion av biotensider innefattar tillsats av kloroformmetanolblandning till den cellfria supernatanten. Steget ska antingen utföras i en draghuv, eller kolven ska täckas med aluminiumfolie omedelbart efter överföring av extraktionsblandningen. Under sekundär återvinning i ett EOR-experiment bör saltlösning tillsättas i överskott tills ingen ytterligare olja kommer ut ur kolonnen.

Metoden diskuterar omfattningen av blandning av biotensider vid återvinning av restolja från kolonnerna. Processen är beroende av många faktorer. Tillväxtstadiet hos mikroberna vid vilka de ursprungliga kulturerna skördas. Vissa biotensider har rapporterats produceras i loggfasen, medan andra har rapporterats produceras i den stationära fasen. Kulturerna bör skördas i enlighet med detta i det särskilda skede då produktionen av biotensider har nått sitt maximum. Screeninganalyser av biotensider är mindre känsliga, därför bör alla analyser utföras innan man når en slutsats om den biotensidproducerande förmågan hos en viss stam. Rening av biotensider bör utföras före kemisk karakterisering av biotensider om koncentrationen av biotensider är låg i det råa biotensidermedlet. Förbättrade oljeåtervinningsexperiment är mycket beroende av vilken typ av jord som används för att packa kolonnen. Marken måste vara helt torr och bör siktas för att avlägsna större granulat och andra fasta föroreningar. En blandning av sandjord och torr trädgårdsjord (i lika förhållande) bör föredras för att packa kolonnen. Kolonnutloppet måste förseglas ordentligt med glasull och glaspärlor för att undvika läckage av jord från kolonnen under experimentets gång.

Den beskrivna metoden är användbar för att bestämma betydelsen av de producerade biotensider och deras blandningar vid återvinning av ytterligare olja i ett simulerat sandpackkolonnexperiment. Olika biotensider har olika specificiteter eftersom de innehåller olika funktionella grupper65. En kombination av biotensider möjliggör solubilisering av olika kolväten och kommer därför att öka den återstående oljeåtervinningen från behållarna. Den beskrivna metoden kommer att bidra till att bestämma potentialen hos biotensidblandningar i fältapplikationer såsom förbättrad oljeåtervinning från oljebrunnar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Institutionen för bioteknik, Indiens regering, för ekonomiskt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, J. D., Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61 (1), 47-64 (1997).
  2. Banat, I. M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology. 51 (1), 1-12 (1995).
  3. Singh, A., Van Hamme, J. D., Ward, O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances. 25 (1), 99-121 (2007).
  4. Shah, N., Nikam, R., Gaikwad, S., Sapre, V., Kaur, J. Biosurfactant: types, detection methods, importance and applications. Indian Journal of Microbiology Research. 3 (1), 5-10 (2016).
  5. McClements, D. J., Gumus, C. E. Natural emulsifiers-Biosurfactants, phospholipids, biopolymers, and colloidal particles: Molecular and physicochemical basis of functional performance. Advances in Colloid and Interface Science. 234, 3-26 (2016).
  6. Nguyen, T. T., Youssef, N. H., McInerney, M. J., Sabatini, D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Research. 42 (6-7), 1735-1743 (2008).
  7. Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 54 (5), 625-633 (2000).
  8. Banat, I. M., Makkar, R. S., Cameotra, S. S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53 (5), 495-508 (2000).
  9. Mulugeta, K., Kamaraj, M., Tafesse, M., Aravind, J. A review on production, properties, and applications of microbial surfactants as a promising biomolecule for environmental applications. Strategies and Tools for Pollutant Mitigation: Avenues to a Cleaner Environment. , 3-28 (2021).
  10. Sharma, J., Sundar, D., Srivastava, P. Biosurfactants: Potential agents for controlling cellular communication, motility, and antagonism. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 727070 (2021).
  11. Vijayakumar, S., Saravanan, V. Biosurfactants-types, sources and applications. Research Journal of Microbiology. 10 (5), 181-192 (2015).
  12. Curiel-Maciel, N. F., et al. Characterization of enterobacter cloacae BAGM01 producing a thermostable and alkaline-tolerant rhamnolipid biosurfactant from the Gulf of Mexico. Marine Biotechnology. 23 (1), 106-126 (2021).
  13. Nikolova, C., Gutierrez, T. Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry: current state of knowledge and future perspectives. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  14. Rastogi, S., Tiwari, S., Ratna, S., Kumar, R. Utilization of agro-industrial waste for biosurfactant production under submerged fermentation and its synergistic application in biosorption of Pb2. Bioresource Technology Reports. 15, 100706 (2021).
  15. Zargar, A. N., Lymperatou, A., Skiadas, I., Kumar, M., Srivastava, P. Structural and functional characterization of a novel biosurfactant from Bacillus sp. IITD106. Journal of Hazardous Materials. 423, Pt B 127201 (2022).
  16. Adnan, M., et al. Functional and structural characterization of pediococcus pentosaceus-derived biosurfactant and its biomedical potential against bacterial adhesion, quorum sensing, and biofilm formation. Antibiotics. 10 (11), 1371 (2021).
  17. Du Nouy, P. L. A new apparatus for measuring surface tension. The Journal of General Physiology. 1 (5), 521-524 (1919).
  18. Akbari, S., Abdurahman, N. H., Yunus, R. M., Fayaz, F., Alara, O. R. Biosurfactants-a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnology Research and Innovation. 2 (1), 81-90 (2018).
  19. Bicca, F. C., Fleck, L. C., Ayub, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia. 30 (3), 231-236 (1999).
  20. Kuyukina, M. S., et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. Journal of Microbiological Methods. 46 (2), 149-156 (2001).
  21. Philp, J., et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Applied Microbiology and Biotechnology. 59 (2), 318-324 (2002).
  22. Mutalik, S. R., Vaidya, B. K., Joshi, R. M., Desai, K. M., Nene, S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp. MTCC 2574. Bioresource Technology. 99 (16), 7875-7880 (2008).
  23. Shavandi, M., Mohebali, G., Haddadi, A., Shakarami, H., Nuhi, A. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces. 82 (2), 477-482 (2011).
  24. White, D., Hird, L., Ali, S. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp., strain PML026. Journal of Applied Microbiology. 115 (3), 744-755 (2013).
  25. Najafi, A., et al. Interactive optimization of biosurfactant production by Paenibacillus alvei ARN63 isolated from an Iranian oil well. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 82 (1), 33-39 (2011).
  26. Bezza, F. A., Chirwa, E. M. N. Pyrene biodegradation enhancement potential of lipopeptide biosurfactant produced by Paenibacillus dendritiformis CN5 strain. Journal of Hazardous Materials. 321, 218-227 (2017).
  27. Jimoh, A. A., Lin, J. Biotechnological applications of Paenibacillus sp. D9 lipopeptide biosurfactant produced in low-cost substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (3), 921-941 (2020).
  28. Liang, T. -W., et al. Exopolysaccharides and antimicrobial biosurfactants produced by Paenibacillus macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (2), 933-950 (2014).
  29. Mesbaiah, F. Z., et al. Preliminary characterization of biosurfactant produced by a PAH-degrading Paenibacillus sp. under thermophilic conditions. Environmental Science and Pollution Research. 23 (14), 14221-14230 (2016).
  30. Quinn, G. A., Maloy, A. P., McClean, S., Carney, B., Slater, J. W. Lipopeptide biosurfactants from Paenibacillus polymyxa inhibit single and mixed species biofilms. Biofouling. 28 (10), 1151-1166 (2012).
  31. Gudiña, E. J., et al. Novel bioemulsifier produced by a Paenibacillus strain isolated from crude oil. Microbial Cell Factories. 14 (1), 1-11 (2015).
  32. Pradhan, A. K., Pradhan, N., Sukla, L. B., Panda, P. K., Mishra, B. K. Inhibition of pathogenic bacterial biofilm by biosurfactant produced by Lysinibacillus fusiformis S9. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (2), 139-149 (2014).
  33. Manchola, L., Dussán, J. Lysinibacillus sphaericus and Geobacillus sp biodegradation of petroleum hydrocarbons and biosurfactant production. Remediation Journal. 25 (1), 85-100 (2014).
  34. Bhardwaj, G., Cameotra, S. S., Chopra, H. K. Biosurfactant from Lysinibacillus chungkukjangi from rice bran oil sludge and potential applications. Journal of Surfactants and Detergents. 19 (5), 957-965 (2016).
  35. Gaur, V. K., et al. Rhamnolipid from a Lysinibacillus sphaericus strain IITR51 and its potential application for dissolution of hydrophobic pesticides. Bioresource Technology. 272, 19-25 (2019).
  36. Habib, S., et al. Production of lipopeptide biosurfactant by a hydrocarbon-degrading Antarctic Rhodococcus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6138 (2020).
  37. Shao, P., Ma, H., Zhu, J., Qiu, Q. Impact of ionic strength on physicochemical stability of o/w emulsions stabilized by Ulva fasciata polysaccharide. Food Hydrocolloids. 69, 202-209 (2017).
  38. Trefalt, G., Borkovec, M. Overview of DLVO theory. , Available from: https://archive-ouverte.unige.ch/unige:148595 (2014).
  39. Kazemzadeh, Y., Ismail, I., Rezvani, H., Sharifi, M., Riazi, M. Experimental investigation of stability of water in oil emulsions at reservoir conditions: Effect of ion type, ion concentration, and system pressure. Fuel. 243, 15-27 (2019).
  40. Chong, H., Li, Q. Microbial production of rhamnolipids: opportunities, challenges and strategies. Microbial Cell Factories. 16 (1), 1-12 (2017).
  41. Zeng, G., et al. Co-degradation with glucose of four surfactants, CTAB, Triton X-100, SDS and Rhamnolipid, in liquid culture media and compost matrix. Biodegradation. 18 (3), 303-310 (2007).
  42. Liu, G., et al. Advances in applications of rhamnolipids biosurfactant in environmental remediation: a review. Biotechnology and Bioengineering. 115 (4), 796-814 (2018).
  43. John, W. C., Ogbonna, I. O., Gberikon, G. M., Iheukwumere, C. C. Evaluation of biosurfactant production potential of Lysinibacillus fusiformis MK559526 isolated from automobile-mechanic-workshop soil. Brazilian Journal of Microbiology. 52 (2), 663-674 (2021).
  44. Naing, K. W., et al. Isolation and characterization of an antimicrobial lipopeptide produced by Paenibacillus ehimensis MA2012. Journal of Basic Microbiology. 55 (7), 857-868 (2015).
  45. Wittgens, A., et al. Novel insights into biosynthesis and uptake of rhamnolipids and their precursors. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (7), 2865-2878 (2017).
  46. Rahman, K., Rahman, T. J., McClean, S., Marchant, R., Banat, I. M. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnology Progress. 18 (6), 1277-1281 (2002).
  47. Bahia, F. M., et al. Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  48. Kim, C. H., et al. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environment Research. 91 (8), 739-747 (2019).
  49. Nalini, S., Parthasarathi, R. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production from Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its biocontrol efficacy against Fusarium wilt of eggplant. Annals of Agrarian Science. 16 (2), 108-115 (2018).
  50. Wang, Q., et al. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology and Bioengineering. 98 (4), 842-853 (2007).
  51. Câmara, J., Sousa, M., Neto, E. B., Oliveira, M. Application of rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa in microbial-enhanced oil recovery (MEOR). Journal of Petroleum Exploration and Production Technology. 9 (3), 2333-2341 (2019).
  52. Amani, H., Mehrnia, M. R., Sarrafzadeh, M. H., Haghighi, M., Soudi, M. R. Scale up and application of biosurfactant from Bacillus subtilis in enhanced oil recovery. Applied Biochemistry and Biotechnology. 162 (2), 510-523 (2010).
  53. Gudiña, E. J., et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation. Bioresource Technology. 177, 87-93 (2015).
  54. Sun, G., Hu, J., Wang, Z., Li, X., Wang, W. Dynamic investigation of microbial activity in microbial enhanced oil recovery (MEOR). Petroleum Science and Technology. 36 (16), 1265-1271 (2018).
  55. Jha, S. S., Joshi, S. J., SJ, G. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian Journal of Microbiology. 47 (4), 955-964 (2016).
  56. Darvishi, P., Ayatollahi, S., Mowla, D., Niazi, A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 84 (2), 292-300 (2011).
  57. Al-Wahaibi, Y., et al. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B30 and its application in enhancing oil recovery. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 114, 324-333 (2014).
  58. Moutinho, L. F., Moura, F. R., Silvestre, R. C., Romão-Dumaresq, A. S. Microbial biosurfactants: A broad analysis of properties, applications, biosynthesis, and techno-economical assessment of rhamnolipid production. Biotechnology Progress. 37 (2), 3093 (2021).
  59. Youssef, N., Simpson, D. R., McInerney, M. J., Duncan, K. E. In-situ lipopeptide biosurfactant production by Bacillus strains correlates with improved oil recovery in two oil wells approaching their economic limit of production. International Biodeterioration & Biodegradation. 81, 127-132 (2013).
  60. Ruckenstein, E., Nagarajan, R. Critical micelle concentration and the transition point for micellar size distribution. The Journal of Physical Chemistry. 85 (20), 3010-3014 (1981).
  61. de Araujo, L. L., et al. Microbial enhanced oil recovery using a biosurfactant produced by Bacillus safensis isolated from mangrove microbiota-Part I biosurfactant characterization and oil displacement test. Journal of Petroleum Science and Engineering. 180, 950-957 (2019).
  62. Banat, I. M., De Rienzo, M. A. D., Quinn, G. A. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (24), 9915-9929 (2014).
  63. Klosowska-Chomiczewska, I., Medrzycka, K., Karpenko, E. Biosurfactants-biodegradability, toxicity, efficiency in comparison with synthetic surfactants. Research and Application of New Technologies in Wastewater Treatment and Municipal Solid Waste Disposal in Ukraine, Sweden, and Poland. 17, 141-149 (2013).
  64. Fernandes, P. A. V., et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (4), 704-709 (2007).
  65. Santos, D. K. F., Rufino, R. D., Luna, J. M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 401 (2016).

Tags

Miljövetenskap utgåva 184
Förbättrad oljeåtervinning med en kombination av biotensider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter