Summary
For at fremme skal vækst kegler udøve trækkraft mod det ydre miljø. Generationen af trækkraft er afhængig af actin dynamik og kobling kobling. Den foreliggende undersøgelse beskriver metoder til analyse actin dynamik, kobling kobling og trækkraft kræfter for vækst kegle forhånd.
Abstract
For at etablere funktionelle netværk skal neuroner migrere til deres relevante destinationer og derefter udvide axoner mod deres målceller. Disse processer afhænger af fremskridtene i vækst kegler, der ligger ved spidsen af neurites. Axonal vækst kegler generere drivkræfter ved at fornemme deres lokale mikromiljø og modulerende cytoskeletal dynamik og actin-adhesion kobling (kobling kobling). Årtiers forskning har ført til identifikation af vejledningsmolekyler, deres receptorer og downstream-signaleringskaskader til regulering af neuronal migration og axonal vejledning; men de molekylære maskiner, der kræves for at generere kræfter til at drive vækst kegle forhånd og navigation er lige begyndt at blive belyst. På forkant med neuronal vækst kegler, actin filamenter gennemgå tilbageskridt flow, som er drevet af actin polymerisering og actomyosin sammentrækning. En kobling kobling mellem F-actin retrograd flow og klæbende substrat genererer trækkraft kræfter for vækst kegle forhånd. Denne undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til overvågning af F-actin retrograd flow af enkelt speckle imaging. Det er vigtigt, at når den kombineres med en F-actin-markør Lifeact, kan denne teknik kvantificere 1) F-actin polymeriseringshastigheden og 2) koblingskoblingens effektivitet mellem F-actin retrograd flow og klæbesubstratet. Begge er kritiske variabler for at generere kræfter til vækst kegle forhånd og navigation. Derudover beskriver denne undersøgelse en detaljeret protokol af trækkraftmikroskopi, som kan kvantificere 3) trækkraft genereret af vækst kegler. Således, ved at koble analyser af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi, kan efterforskere overvåge den molekylære mekanik underliggende vækst kegle forhånd og navigation.
Introduction
I den udviklende hvirveldyrhjerne gennemgår neuroner kunstfærdigt organiserede migrationer og projektakser mod passende synaptiske partnere for at etablere funktionelle neuronale netværk1,2,3. Vækst kegler, som er sensoriske og motile strukturer placeret på spidsen af neurites, bestemme hastigheden og retningen af neuronal migration og axon udvækst3,4,5. Da neuroner er omgivet af tætpakkede miljøer, må vækstke udøve kræfter mod deres miljø for at komme videre6,7. For at forstå de mekanismer, der ligger til grund for neuronal migration og axonal vejledning, er analyser af molekylær mekanik for vækstkeglefremrykning afgørende.
Årtiers analyse har vist, at trækkraft til at drive vækst kegle forhånd er genereret af 'kobling' mekanisme; denne mekanisme menes at fungere ikke kun i den axonale vækstkegle, men også i den førende procesvækstkegle af migrerende neuroner8,9,10,11,12. Nemlig actin filamenter (F-actins) i vækst kegler polymerisere på forkant og depolymerize proximally, skubbe ud den førende membran13,14,15. Den resulterende kraft, i forbindelse med actomyosin sammentrækning, fremkalder bagudgående bevægelse af F-actins kaldet retrograd flow7,11,16,17,18,19,20,21. Koblings- og celle vedhæftningsmolekyler formidler mekanisk kobling mellem F-actin retrograd flow og det klæbende substrat og overfører kraften af F-actin flow på substratet, hvorved trækkraften for vækstkegle forhånd7,8,9,11,12,22 . Samtidig reducerer actin-substratkoblingen F-actin-strømningshastigheden og konverterer actin polymerisering til kraften for at stikke den førende membran 9,10.
Axonal vækst kegler fornemme lokale kemiske signaler og transduce dem i en retningsbestemt drivkraft for vækst kegle navigation3,23,24,25. For eksempel stimulerer et axon-styremolekyle netrin-1 sin receptor slettet i kolorektal cancer (DCC) og aktiverer Rho guanosin triphosphat (GTP)-bindende proteiner celledelingskontrolprotein 42 (Cdc42) og Ras-relateret C3 botulinum toksin substrat 1 (Rac1) og deres downstream kinase p21-aktiveret kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 og Rac1 fremme 1) actin polymerisering, og Pak1 fosforylerer en kobling molekyle shootin122,26. Shootin1 interagerer med F-actin retrograd flow via en actin-bindende protein cortactin27. Shootin1 interagerer også med L1 celle vedhæftning molekyle (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering øger de bindende tilhørsforhold til cortactin og L1-CAM, og forbedrer shootin1-medieret 2) kobling24,27. Inden for vækstkeglen øges asymmetriske aktiveringer af actin polymerisering og koblingskobling 3) trækkraft på siden af netrin-1-kilden, hvilket skaber retningsbestemt drivkraft for vækstkegledrejning (figur 1)24. Intensiv forskning i løbet af de sidste par årtier med hensyn til neuronal migration og axon vejledning har øget forståelsen af vejledning molekyler, deres receptorer, og tilhørende downstream signalering kaskader2,10,28,29,30. Men de molekylære bemaskiner til at generere kræfter til vækst kegle forhånd er lige begyndt at blive belyst; dette kan tilskrives den begrænsede anvendelse af protokollerne til mekanobiologiske analyser.
Den foreliggende undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til overvågning af F-actin retrograd flow af enkelt speckle imaging16,18. Overvågning af F-actin retrograd flow er blevet udført i vid udstrækning ved hjælp af super-opløsning mikroskopi, spinning-disk konfokal mikroskopi og total interferens refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollen i denne undersøgelse bruger imidlertid et standard epifluorescencemikroskop og kan således let antages11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Når det kombineres med F-actin mærkning af Lifeact43, enkelt speckle imaging giver mulighed for kvantificeringer af actin polymerisering sats og kobling kobling effektivitet mellem F-actin tilbagegradering flow og klæbemiddel substrat39,42. Denne undersøgelse beskriver endvidere en detaljeret protokol af trækkraftmikroskopi ved hjælp af en fluorescerende perle-indlejret polyacrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denne metode registrerer og kvantificerer trækkraft under vækstkeglen ved at overvåge kraftinducerede perlebevægelser44,45. Der leveres en open source traction force-analysekode, og metoden til kvantificering af trækkraft under migration af vækstkegle forklares i detaljer. Ved hjælp af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi, forståelse af molekylær mekanik underliggende vækst kegle migration og navigation vil blive lettet. Disse teknikker er også anvendelige til analyse af molekylær mekanik underliggende dendritiske rygsøjlen udvidelsen, som er kendt for at være vigtigt i læring og hukommelse42.
Protocol
Alle forsøg med laboratoriedyr blev udført med Den Institutionelle Animal Care and Use Committee af Nara Institute of Science and Technology. Efterforskerne bør følge fastlagte retningslinjer fra deres institutionelle og nationale dyreregulerende udvalg for pleje og anvendelse af laboratoriedyr.
1. Udarbejdelse af løsninger og medier
- Forbered løsningerne og kulturmedierne som opsummeret i supplerende fil 1
2. Fremstilling af poly-D-lysin (PDL)/lamininbelagte substrater
- Glasbundsfakke med 14 mm diameter med 100 μg/mL PDL, opløst i fosfatbufferet saltvand (PBS, pH 7.4) og inkuberes natten over i en befugtet inkubator ved 37 °C.
BEMÆRK: Glasfladerne må ikke tørres op efter dette trin - Fjern PDL-opløsningen og pipetten 1 mL PBS på glasset i 10 s tre gange.
- Oplag retterne med 5 μg/mL laminin, opløst i PBS, og inkuber for natten over i en befugtet inkubator ved 37 °C.
- Fjern lamininopløsningen og pipetten 1 mL PBS på glasset i 10 s tre gange.
- Fjern PBS og placer 0,5 mL af neurobasalmediet på glasfladerne. Opvasken opbevares i en befugtet inkubator ved 37 °C.
BEMÆRK: PDL/laminin-coatede retter kan opbevares i 2-3 dage i en befugtet inkubator ved 37 °C.
3. Dissektion og dissociation af hippocampus
- Aflive en gravid mus ved cervikal dislokation.
BEMÆRK: Denne undersøgelse anvender mus, der er kommercielt tilgængelige (se Materialetabel). Efterforskere bør bruge mus, der opdrættes og humant behandles i et steriliseret miljø. - Dissekere embryonale dag-16 (E16) mus embryoner, og læg dem på is.
- I en laminar flow hætte, dissekere hjernen med en saks og placere dem på en steril 10 cm skål indeholdende 10 mL af iskold dissektion løsning.
- Med en dissektion stereo mikroskop, omhyggeligt skræl væk meninges af cerebral halvkugler og derefter dissekere ud hippocampi ved hjælp af sammenkævninger.
- Overfør hippocampi i 5 mL iskold fordøjelsesopløsning i et 15 ML rør. Inkuberes hippocampi i et vandbad i 20 min ved 37 °C.
- Fjern fordøjelsesopløsningen, og tilsæt 3 mL dissektionsopløsning.
- Rør forsigtigt hippocampi fire gange med en Pasteur pipette.
- Inkuberes hippocampi i et vandbad i 20 min ved 37 °C.
- Overfør celleaffjedringen til et 50 mL centrifugerør. Der tilsættes 3 mL ny dissektionsopløsning til det ikke-udslyttede væv.
- Gentag trin 3.7-3.9, indtil hippocampi er helt adskilt.
- Fjern de flydende aggregater af DNA fra celleaffjedringen ved at hvirvle og aspirere med en Pasteur pipette. Centrifuge celleaffjedringen ved 180 x g i 20 min ved 4 °C.
BEMÆRK: DNA fra beskadigede celler vil forstyrre centrifugeringsprocessen. Hvis neuroner forbliver i supernatanten, centrifugere celleaffjedringen igen efter omhyggeligt fjernelse af DNA'et. - Ekvilibrere neurobasalt medium, der indeholder 10 % føtalt kvægserum (FBS), penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 μg/mL) i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
4. Transfection og dyrkning neuroner
- Fjern supernatanten, og tilsæt 5 mL iskold PBS i 50 mL-røret. Resuspend celle pellet ved blid pipettering.
- Overfør 10 μL af celleaffjedringen til et mikrocentrifugerør, tilsæt 10 μL 0,5% trypanblå opløsning, og tæl derefter antallet af celler med et hæmocytometer.
- Centrifuge celleaffjedringen i 50 mL-røret ved 180 x g i 20 min ved 4 °C.
- I mellemtiden, aliquot for transfection, 1 μg pFN21A-HaloTag-actin og 3 μg pmNeonGreen-N1-Lifeact pr 1 x 106 celler, i en mikrocentrifuge rør.
- Efter centrifugering fjernes supernatanten og tilsættes 100 μL elektroporeringsmedium (leveret af transfection kit) i 50 mL-røret. Brug cellepillen igen ved at pipettere.
- Bland celleaffjedringen med den aliquoted DNA-opløsning og overfør blandingen til et cuvette (leveret af transfection kit).
BEMÆRK: Da luftbobler forstyrrer elektroporationen, skal de fjernes fra celleaffjedringen. - Sæt cuvette i elektroporeringsapparatet (Materialetabel), og udfør elektroporering ved hjælp af program O-005.
- Tilsæt straks 1 mL af det forvarmede og ekvilibrerede neurobasale medium, der indeholder 10% FBS, penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 μg/mL) til cuvette.
- Overfør celleaffjedringen til et 15 mL centrifugerør ved hjælp af en plastpipette (leveret af transfection kit).
- Overfør 10 μL af celleaffjedringen til en mikrotube, tilsæt 10 μL 0,5% trypan blå opløsning, og tæl derefter antallet af celler med et hæmocytometer.
- Tag PDL/laminin-coated glasbundsfade ud af inkubatoren, og fjern neurobasalmediet.
- Pipette 0,5 mL af celleaffjedringen indeholdende 2,0 x 105 celler pr. skål og inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 timer.
- Udskift mediet med 0,5 mL neurobasal medium, der indeholder 2% B-27 supplement, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 μg/mL). Kultur neuronerne i en befugtet inkubator i 3 dage ved 37 °C med 5% CO2.
5. Enkelt speckle imaging på neuronal vækst kegler
- På dag in vitro (DIV) 3, behandle neuroner med tetramethyl-rhodamin (TMR) ligand ved en fortynding af 1:2000 fortynding i kultur medium. Neuronerne tilbageholdes i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2.
- Vask TMR ligand tre gange med forvarmet PBS.
- Pbs og pipetten 0,5 mL opvarmet Leibovitz's L-15 medium indeholder 2% B-27 supplement, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/mL), og streptomycin (100 μg/mL).
- Neuroner skal vedligeholdes i 1 time ved 37 °C.
- Tænd et epifluorescencemikroskop, og indstil fase-top inkubatoren til 37 °C.
BEMÆRK: Den nuværende protokol bruger en epifluorescence mikroskop udstyret med en supplerende metal-oxid halvleder kamera, en 100x/1.40 NA olie nedsænkning objektive linse, en kviksølv lampe og et billede erhvervelse software (se Tabel af materialer). Andre epifluorescencemikroskoper med tilsvarende specifikationer kan også anvendes til denne analyse. - Anbring de TMR ligandbehandlede neuroner i glasbundsskålen på den opvarmede fase-top inkubator.
- Angiv parametrene for billedopsamling på følgende måde: eksponeringstid, 500 ms for Lifeact- og HaloTag-actin fluorescerende kanaler; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm pr. pixel); tidsinterval, 3 s; varighed, 50 billeder.
- Vælg en vækstkegle, der stærkt udtrykker Lifeact og svagt udtrykker HaloTag-actin.
BEMÆRK: Lifeact udtryk bør være stærk nok til at visualisere vækst kegle morfologi. HaloTag-actin-udtrykket bør være svagt utilstrækkeligt til at blive detekteret (Figur 2A). Niveauet af fluorescerende proteinudtryk kan justeres ved at variere mængden af DNA til transfection. - Luk mellemgulvets felt for at belyse et minimumsområde, der omfatter vækstkeglen (figur 2B).
BEMÆRK: Belysningen af et minimumsområde reducerer baggrundssignalet og øger fluorescenssignalet til støj (S/N), hvilket gør det muligt at detektere actin speckles (figur 2B). For yderligere at øge S/N-forholdet anbefales det at belyse vækstkeglen uden at reducere lyset ved hjælp af neutrale densitetsfiltre. - Hent time-lapse-billeder (supplerende fil 2). Gem som et multikanal time-lapse stack billede (tiff format).
6. Kvantificeringer af F-actin flow hastighed og polymerisering sats ved hjælp af et billede behandling og analyse software Fiji
BEMÆRK: Der henvises til supplerende fil 3 for praksisdata til kvantificering af F-actin-strømningshastigheden og actin polymeriseringshastigheden.
- Åbn multikanal time-lapse stack billedet på Fiji.
- Vælg Analyser > Indstil skala, og angiv billedernes pixelstørrelse.
- Find en actin speckle, der flyder tilbage i mindst fem tidsrammer inden for en F-actin bundt i filopodia eller lamellipodia.
- Vælg Billede > Transformer > Roter, og juster vinklen på billederne, så F-actin-bundtet peger opad (figur 3A).
- Klik på Rektangel på værktøjslinjen, og tegn en boks, der indeholder actin speckles og spidsen af F-actin bundt (Figur 3B, 1 og 2).
BEMÆRK: Signalerne fra HaloTag-actin speckles er svage. Derudover er Lifeact-signaler ved de distale spidser af vækstkeglene svage og svage (Figur 2B), fordi de distale spidser af vækstkeglen er tynde sammenlignet med den proksimale del. Efterforskere bør forbedre signalerne for at optimere kvantificeringerne af F-actin flowhastighed og polymeriseringshastighed (Figur 3B). Selvom Lifeact-signalet ved den proksimale vækstkegle bliver mættet, vil dette ikke forstyrre bestemmelsen af den distale ende af F-actins (Figur 3E, gul linje). - Vælg Billede > Dupliker og input de fem tidsrammer (Figur 3B, 3-5).
- Vælg Billede > stakke > Opret montage, og input parametrene: Kolonner, 5; Rækker, 1; Skalafaktor, 1.
- Klik på OK. Billedmontagen vises på skærmen.
- Vælg Billede > farve > opdelte kanaler. Dette adskiller de to fluorescerende kanaler.
- Kvantificering af F-actin flow hastighed.
- Vælg Analyser > Indstil målinger, og vælg Område og Afgræns rektangel.
- Klik på Oval på værktøjslinjen, og tegn en cirkel på en actin speckle (Figur 3C, 1 og 2).
- Vælg Billede > overlejring > Tilføj markering. Cirklen er overlejret på billedmontagen (Figur 3C, 3 og 4).
BEMÆRK: Farven på overlejringen kan ændres ved Redigering > indstillinger > farver. - Gentag overlejringen af cirkler for de resterende pletter (figur 3C, 5).
BEMÆRK: For præcist at bestemme centrene for actin speckle, bør efterforskere overlay cirkler på pletter. - Klik på Lige på værktøjslinjen, og tegn en linje, der forbinder cirklernes centre (Figur 3D, 1 og 2).
- Vælg Analyser > målpunkt. Resultatet vises på skærmen (Figur 3D, 3).
BEMÆRK: Den højde , der vises i resultatet, angiver omfordelingsafstanden for actin-speckle under observationen (figur 3D, 3). - Beregn F-actin-strømningshastigheden ved at dividere translokationsafstanden med observationstiden.
- Kvantificering af F-actin polymerisering sats.
- Tegn en streg, der forbinder spidserne i F-actin-bundtet (figur 3E, 1).
- Vælg Analyser > målpunkt. Resultatet vises på skærmen (Figur 3E, 2).
BEMÆRK: Højden i resultatet angiver forlængelseslængden af F-actin-bundtet under observationen (figur 3E, 2). - Beregn F-actin-forlængelseshastigheden ved at dividere forlængerlængden med observationstidspunktet.
- Beregn F-actin polymeriseringshastigheden som summen af F-actin-strømningshastigheden og forlængelseshastigheden (Figur 3F).
7. Udarbejdelse af en PAA gel til trækkraft mikroskopi og neuron kulturer
- Fremstilling af PAA geler, der kræves til trækkraftmikroskopi (figur 4)
- Pipette 0,5 mL NaOH (100 mM), opløst i destilleret H2O, på 27 mm diameter glasbundne retter, og inkubere i 15 min ved stuetemperatur (RT).
- Tilsæt 50 μL 3-aminopropyltrimethyoxysilane (APTMS) i NaOH-opløsningen på opvasken og bland opløsningerne ved skånsom pipettering, og inkuber i 15 minutter på RT.
- Vask glasbundsfadene med destilleret H2O, og tør.
- Pipette 0,5 mL 0,5% glutaraldehydopløsning, opløst i PBS, på den APTMS-behandlede glasbundsfad og inkuberes i 30 min ved RT.
- Vask glasbundsfadene med destilleret H2O og tør.
- Der fremstilles en opløsning, der indeholder destilleret H2O (412 μL), 30 % (w/v) acrylamidopløsning (63 μL), 2,5 % (w/v) bis-acrylamidopløsning (6 μL) og karboxoxylate modificeret mikrosfæreopløsning (fluorescerende perle) (20 μL).
BEMÆRK: Vortex den fluorescerende perleopløsning til at adskille aggregerede perler, før du tilføjer til acrylamidopløsningen. - Opløsningen afgasser i et vakuumkammer i 30 min på RT.
- Til denne opløsning tilsættes 1 μL på 10% (w/v) ammoniumpersulfat (APS), opløst i destilleret H2O og 1 μL N,N,N',N'-N'-tetramethylethylendiamin (TEMED) og blandes ved skånsom pipettering.
- Placer en glasdækslet (18 mm diameter) på hætten af et 15 mL centrifugerør.
- Tilsæt straks 25 μL af opløsningen til dækslet, og placer derefter forsigtigt en omvendt glasbundsfad på dækslet. Lad acrylamid polymerisere i 1 time ved RT.
- Påfør destilleret H2O på dækslet og skræl den væk fra gelen med en sprøjtenål med en bøjet spids.
- Fjern H2O og tilsæt sulfo-SANPAH (1 mM), opløst i PBS, til gelen.
- Under sterile forhold udsættes gelerne for ultraviolet lys i 5 min. Vask gelen tre gange med PBS i 15 min pr. vask.
- Bestemmelse af gelstivhed med en indrykningsmetode for mikrosfæren (figur 5A)44.
- Overfør en mikrosfære, der er angivet for diameteren og tætheden, til gelen og derefter placere den på prøvestadiet af en laser scanning konfokal mikroskop.
- Fokuser på geloverfladen, og registrer z-positionen (figur 5B).
- På samme måde skal du fokusere på bunden af mikrosfæren og registrere z-positionen (Figur 5C).
- Beregn indrykningsdybden som bestemt af forskellen mellem geloverfladens z-positioner og bunden af mikrosfæren.
- Beregn Youngs modul E af gelen ved:
hvor f er mikrosfærens opdriftskorrigerede vægt, d er indrykningsdybden af gelen, r er mikrosfærens radius, og v er Poissons forhold (hvis værdi er 0,3, som fastslået tidligere46).
- Coat gelerne med PDL og laminin som beskrevet i afsnit 2.
- Som beskrevet i afsnit 3 og 4 dissekerer dissekere E16-musefostre, tager afstand fra hippocampi og transfect med 5 μg pEGFP-C1 pr. 1,0 x 106 celler. Frø 2,0 x 105 celler på PDL/laminin-coatede geler.
BEMÆRK: Til trækkraftanalyse er mikroskopisk billeddannelse af fluorescerende mærkede celler nødvendig til bestemmelse af vækstkegleområdet.
8. Trækkraft mikroskopi på neuronal vækst kegler
- På DIV3 skal kulturmediet udskiftes med 0,5 mL opvarmet Leibovitz's L-15 medium, der indeholder 2% B-27 supplement, glutamin (1 mM), penicillin (100 U / mL) og streptomycin (100 μg/mL). Neuronerne skal vedligeholdes i 1 time ved 37 °C.
- Tænd et laserscanningsmikroskop, og indstil fasetopinkubatoren til 37 °C.
BEMÆRK: Denne undersøgelse bruger en laser scanning konfokal mikroskop udstyret med en 63x/1.2 NA vand nedsænkning objektive linse og et billede erhvervelse og analyse software (se Tabel over materialer). - Placer neuronerne i glasbundsskålen på den forvarmede fasetop-inkubator.
- Angiv parametrene for billedopsamling på følgende måde: scanningsstørrelse, 512 × 512 pixel; scanningsområde, 1,5-3x zoom; scanningshastighed, ~ 1 s pr. ramme; laserbølgelængde, 561 nm (excitationsbølgelængden for lysstofrørsperlerne) og 488 nm (excitationsbølgelængden for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP)); tidsinterval, 3 s; varighed, 50 billeder.
- For at visualisere vækstkeglemorfologien skal du vælge en vækstkegle, der stærkt udtrykker EGFP.
- Fokuser på geloverfladen, og hent time-lapse-billeder (figur 6A og supplerende fil 4).
BEMÆRK: Til trækkraftanalyse skal du bruge to lysstofrørskanaler (til fluorescerende perler og EGFP), og en lysfeltkanal (optagelse af differentialinterferenskontrast (DIC) eller fasekontrastbilleder anbefales). - Brug en billedbehandlingssoftware (f.eks. Fiji) til at producere tidsfordæmning af RGB-billedstakke med én kanal og gemme disse billeder som tiff-filer.
BEMÆRK: Det er afgørende, at efterforskerne også gemmer de rå data. - Påfør 100 μL på 10% (w/v) natrium dodecyl sulfat (SDS), opløst i destilleret H2O, til glasbundsskålen for at slappe af gelsubstratet ved at frigive neuroner fra substratet. Inkuber fadet i 5 min ved 37 °C for at stabilisere temperaturen.
BEMÆRK: Billedet af perlerne i et utrænet substrat bruges til at referere til de oprindelige perlepositioner under trækkraftanalyse (Figur 6C). Anvendelse af SDS-opløsning ændrer xyz-positionerne på grund af termisk ændring i inkubatoren og afslapningen af den celleinducerede deformation. Efterforskere er derfor nødt til at korrigere fokusplan og x-y position. - Fokuser på geloverfladen, og få et billede af perlerne i det ustrænede substrat (Figur 6B).
- Producere en enkelt kanal RGB billede af perlerne i den utrænede substrat, og gemme dette billede som en tiff fil.
- Korrektion af perlebilledets x-y-position i det utrænede substrat ved hjælp af Fiji
- I Fiji skal du åbne perlebilledet i det ustrænede substrat og time-lapse stack-billedet af fluorescerende perler.
- Vælg > stakke > > Sammenkæde. Der vises en dialogboks på skærmen (Figur 7A, 1).
- Vælg perlebilledet i det ustrænede substrat og time-lapse stack-billedet af fluorescerende perler i henholdsvis billede1 og billede2 (figur 7A, 2).
- Klik på OK. Perlebilledet i det ustrænede substrat føjes til time-lapse stack-billedet (Figur 7A, 3).
- Brug rullepanelet (Figur 7B, 1, rød ramme) til at vise den anden ramme i stakbilledet (rød pil).
- Vælg Plugins > StackReg (Figur 7B, 2). Der vises en dialogboks på skærmen (Figur 7B, 3).
- Vælg Stiv brødtekst på rullelisten (Figur 7B, 3, rød ramme), og klik på OK. Korrektionen af x-y positionen begynder derefter.
- Brug rullepanelet til at få vist den første ramme i x-y-positionskorrigeret stakbillede.
- Vælg Billede > dublet (Figur 7C, 1). Der vises en dialogboks på skærmen (Figur 7B, 2).
- Input 1 i området, fravælg dubletstak (figur 7C, 2), og klik på OK. Det x-y positionskorrigerede perlebillede i det utrænede substrat vises på skærmen (Figur 7C, 3). Gem dette billede som en tiff-fil.
- Kvantificering af trækkraft
BEMÆRK: Den metode, der er beskrevet her til trækkraftanalyse, bruger MATLAB og to MATLAB-værktøjskasser, 'Image Processing Toolbox' og 'Parallel Computing Toolbox'. Efterforskere bliver nødt til at installere dem forud for analysen. Trækkraftanalysekoden blev udviklet baseret på MATLAB version 2018a. Matlab version 2018a (eller nyere) skal derfor anvendes til analysen. De algoritmer, der anvendes til trækkraft analyse blev beskrevet tidligere22.- Download trækkraftanalysekoden TFM2021 fra supplerende fil 5. Åbn TFM 2021 i MATLAB
- Åbn main.m i TFM2021 og kør den. Der vises en grafisk brugergrænseflade på skærmen (Figur 8A).
- Klik på Læg utrænet substratbillede , og vælg det x-y positionskorrigerede perlebillede i utrænet substrat.
- Klik på Load fluorescerende perle billeder og vælg time-lapse stack billede af perler.
- Klik på Indlæs billeder i det lyse felt , og vælg time-lapse stack-billedet af bright-field.
- Klik på Indlæs GFP-billeder , og vælg time-lapse stack-billedet af EGFP.
- Vælg GFP på rullelisten i GUI (Figur 8A, rød boks).
- Klik på INVESTERINGSAFKAST for at angive rektangelområdet (ROI), herunder vækstkeglen, ved at klikke på to punkter på cellebilledet, der vises på GUI (Figur 8B).
- Klik på knappen Gem på GUI (Figur 8A, rød pil). De valgte stakbilleder gemmes sammen med investeringsafkast i en .mat-fil (MATLAB-formatfil).
- Klik på Spot opdage. Der vises en dialogboks på skærmen.
- Indtast en værdi (normalt 50-150) i dialogboksen for at bestemme en tærskel for registrering af perle. Hvis du klikker på OK , startes beregningen.
- Når du har afsluttet beregningen, skal du klikke på Plotsporet for at forstørre det område, der blev valgt i trin 8.12.8, og vise de fundne perler som hvide prikker (Figur 8C, 1).
BEMÆRK: Bekræft, om perledetektering (hvide prikker) overlapper med lysstofrør perlerne. Registrering af perle kan også registrere baggrundsstøj. Hvis du vil reducere denne eksterne interferens, skal du ændre tærskelværdien ved spotregistrering. Derudover skal du manuelt vælge de korrekte prikker på trin 8.12.13. - Klik på Vælg perler, og afgrænse en polygonal region, der omfatter de korrekte prikker under vækstkeglen. Tryk på Enter på tastaturet. De hvide prikker i det polygonale område ændres til en rød farve (Figur 8C, 2).
- Klik på Estimat force på GUI. Derefter inputværdier for følgende parametre: pixelstørrelse, μm/pixel; Youngs modulus, værdien beregnet til trin 7.2.5; Poissons forhold, 0,3.
- Udfør estimatkraft for at starte beregningen. Softwaren gemmer beregningsresultaterne automatisk i en regnearksformatfil.
BEMÆRK: Regnearket viser x-komponenten, y-komponenten og kraftstørrelsen ved hver tidsramme (Figur 8D). Der henvises til supplerende fil 6 for at få oplysninger om praksisdata til kvantificering af trækkraft.
Representative Results
Enkelt speckle imaging at kvantificere actin polymerisering sats og kobling kobling effektivitet
En høj Lifeact udtryk tillader F-actin visualisering inden for vækst kegle; en lav HaloTag-actin udtryk gør det muligt at overvåge F-actin tilbageskridt flow (Figur 3, Supplerende Fil 2). Sporing af actin speckles gør det muligt at måle F-actin-strømningshastigheden (Figur 3C, D). Da den mekaniske kobling af F-actin retrograd flow og klæbende substrat reducerer F-actin flow hastighed, kobling koblingen effektivitet kan estimeres fra hastigheden. Desuden, F-actin mærkning med Lifeact hjælpemidler visualisering af F-actin udvidelse og er nyttig til kvantificering af actin polymerisering sats (Figur 3E, F).
Kvantitativ analyse af trækkraft
Streng overholdelse af den metode, der præsenteres her, vil afsløre bevægelserne af fluorescerende perler under vækstkeglen (Figur 6C, supplerende fil 4). F-actin retrograd flow på substratet genererer trækkraft forårsager fluorescerende perler til at bevæge sig bagud under væksten kegle. Trækkraftanalysekoden estimerer trækkraften fra fluorescerende perleforskydning og udtrykker den beregnede trækkraft som en kraftvektor. Retningen og størrelsen af trækkraften bestemmes ud fra kraftvektorens x- og y-komponenter (Figur 8C,D). Den røde boks i figur 8D repræsenterer x- og y-komponenterne i en kraftvektor. Figur 8C skildrer den tilsvarende vækstkegle. Med hensyn til x-y koordinater peger vektoren på -93,8° mod x-aksen. denne orientering er rettet mod bagsiden af vækstkeglen (Figur 8C). Størrelsen af trækkraften F blev beregnet på følgende måde:
Figur 1: En vækst kegle maskiner til kraft generation og vækst kegle navigation. En netrin-1 kemoattractant gradient inducerer asymmetrisk stimulering af sin receptor DCC på en axonal vækst kegle. Dette aktiverer Rac1 og Cdc42, og deres downstream kinase Pak1. Rac1 og Cdc42 fremme (1) actin polymerisering, mens Pak1 fosforylater shootin1, øge shootin1-medieret (2) kobling kobling. Den asymmetriske aktivering af actin dynamik og kobling koblingen i vækst kegle øger (3) trækkraft på siden af netrin-1 kilde, hvilket skaber en retningsbestemt drivkraft for vækst kegle attraktion. Protokollerne her giver mulighed for kvantificering af de vigtigste variabler (1)-(3) for vækst kegle navigation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fluorescensbilleder af en neuronal vækstkegle under et fuldt åbnet og indsnævret mellemgulv. Vækstkeglen udtrykker Lifeact og HaloTag-actin. (A) Et højt Lifeact udtryk tillader visualisering af vækst kegle morfologi. På den anden side er HaloTag-actin udtryksniveauer meget lave, med svage signaler, når mellemgulvet er fuldt åbnet. (B) Når mellemgulvet er korrekt indsnævret, aftager baggrundssignalerne, og der forekommer enkelte actin-pletter i vækstkeglen. Skalastænger: 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Trin til kvantificering af F-actin flowhastighed og actin polymeriseringshastighed ved hjælp af en billedbehandlings- og analysesoftware Fiji. (A) Juster billedets vinkel til analyse. (1) Find og vælg en actin speckle (pilespids), der flyder i en F-actin bundt. (2) Vælg billede > transformer > rotere. (3) Indstil vinklen, så F-actin-bundtet er rettet opad. (4) Billedets vinkel ændres. B) Afgrænse regionen, herunder actin speckle og F-actin-bundtet. (1) Klik på Rektangel på værktøjslinjen. (2) Afgræns et område på billedet. Billedets lysstyrke og kontrast øges for at muliggøre en klar visualisering af actin-speckle og spidsen af F-actin-bundtet. (3) Vælg billede > dupliker. (4) Input de fem tidsrammer, der viser actin speckle flow i F-actin bundt. (5) Det valgte stakbillede vises på skærmen. (C) Overlay cirkler på actin speckle. (1) Klik på Oval på værktøjslinjen. (2) Tegn en cirkel på en actin speckle. (3) Vælg billede > overlejring > Tilføj markering. (4) Cirklen er overlejret. 5) Gentag overlejring af cirklerne på de resterende actin speckles. D) Mål om omfordelingsafstanden for actin speckles i løbet af de fem tidsrammer. (1) Klik på lige på værktøjslinjen. (2) Tegn en linje, der forbinder cirklernes centre. (3) Vælg Analyser > målpunkt. Resultatet, angivet med parameteren Højde (rød boks), relæ actin speckle translokation afstand. E) Måle ændringen i længden af F-actin fremspring i løbet af de fem tidsrammer. (1) Tegn en linje, der forbinder spidsen af F-actin fremspring. (2) Vælg Analyser > målpunkt. Resultatet (rød boks), Højde, angiver forlængelseslængden på F-actin-bundtet. (F) Actin polymerisering sats beregnes ud fra summen af F-actin flow hastighed og forlængelseshastigheden. Se også Supplerende fil 2. Supplerende fil 3 hjælper efterforskere til at praktisere den metode, der er beskrevet ovenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Trin til PAA gelpræparatet. Se trin 7.1 for en detaljeret beskrivelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bestemmelse af PAA gel stivhed. A) En indrykningsmetode for mikrosfæren. Når en mikrosfære er placeret på en fluorescerende perle-indlejret PAA gel, vægten af mikrosfæren forårsager en indrykning i gelen. Indrykningsdybden beregnes ved at trække paa geloverfladens z-positioner fra bunden af mikrosfæren (B,C) Fluorescensbilleder af en PAA gel indrykket af en mikrosfære og indeholdende fluorescerende perler. En laser scanning konfokale mikroskop blev brugt til at fange billeder af gel overflade (B) og bunden af mikrosfæren (C). Signaler fra lysstofrør perler er ikke synlige på geloverfladen i det indrykkede område (B, cirkel). De kan dog observeres i bunden af mikrosfæren. Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kraft kortlægning af en neuronal vækst kegle. (A-C) Fluorescensbilleder af perler indlejret i en PAA gel og en neural vækstkegle visualiseret med EGFP. Efter erhvervelsen af time-lapse billeder (A), neuron blev frigivet fra gel substratet ved at anvende SDS løsning, og et billede af perlerne i den ustræde substrat blev fanget (B). (C) Billedet af perlerne i det ustrænede substrat viser perlerne i deres oprindelige (grønne) og fordrevne (røde) positioner. EGFP-signalet fra vækstkeglen er vist med blåt. Kymografer (højre) viser bevægelser af perler med 3 s intervaller for en varighed på 147 s, angivet med pilene i boxed områder 1 og 2. Perlen i område 2 er en referenceperle. Skalastænger: 2 μm for (A), (B) og (C, til venstre) og 1 μm for (C, midten). Se også Supplerende fil 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Trin til korrektion af perlebilledets x-y-position i utrænet substrat ved hjælp af Fiji. (A) Foren perlebilledet i ustrænet substrat med time-lapse stack-billedet af fluorescerende perler. (1) Vælg > > stakke > værktøjer > Sammenkæde. (2) Vælg perlerne billedet i ustrænet substrat og time-lapse stack billede af fluorescerende perler i billede1 og billede2, henholdsvis. Klik på OK. (3) Perlebilledet i det ustrænede substrat føjes til time-lapse stack-billedet. (B) Ret x-y-positionen af det fluorescerende perlebillede. (1) Brug rullepanelet (rød ramme) til at markere den anden ramme (rød pil) i billedstakken. (2) Vælg plugins > StackReg. (3) Vælg Stiv brødtekst på rullelisten (rød ramme), og klik på OK. Korrektionen af x-y-positionen begynder. (C) Gem x-y-positionskorrigeret perlebillede. Når du har valgt den første ramme i x-y-positionskorrigeret stakbillede, skal du (1) vælge Billede > Duplicate. (2) input 1 i området, og fjern markeringen af dubletstakken. Klik derefter på OK. (3) det x-y positionskorrigerede perlebillede i det utrænede underlag vises på skærmen. Gem dette billede som en tiff-fil. Supplerende fil 6 hjælper efterforskere med at praktisere den metode, der er beskrevet ovenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Analyse af trækkraft under en neuronal vækstkegle ved hjælp af en open source traction force analysis code. (A) GUI til analyse af trækkraft. Time-lapse billeder valgt på GUI kan bekræftes fra rullelisten og med skyderen angivet (rød boks). (B) Vælg et område, der omfatter vækstkeglen. (1) Klik på ROI på GUI. Angiv to punkter (pilespidser) på cellebilledet med musemarkøren. (2) Der vises en rød boks på cellebilledet. To klik bestemmer placeringen af to hjørner. (C) Vælg de fundne perler (hvide prikker) under vækstkeglen. (1) På GUI skal du klikke på Vælg perler og afgrænse en polygonal region, der omfatter vækstkeglen ved at klikke. Tryk på Enter . (2) De hvide prikker i det polygonale område ændres til en rød farve. (D) Beregnede resultater af trækkraftens retning og størrelse. Den røde boks i regnearket repræsenterer x- og y-komponenterne i kraftvektoren, estimeret ved trækkraftanalyse. På x-y-koordinaten i højre panel peger kraftvektoren genereret af vækstkeglen på -93,8° mod x-aksen. denne orientering er rettet mod bagsiden af vækstkeglen i (C). Supplerende fil 6 hjælper efterforskere med at praktisere den metode, der er beskrevet ovenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Fil 1: Opskrifter af løsninger og medier, der anvendes i denne undersøgelse. Se tekst for detaljeret brug. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Fil 2: Fluorescens billeddannelse af Lifeact og fluorescerende speckle imaging af HaloTag-actin i en nerve vækst kegle. Lifeact (grøn) og HaloTag-actin (magenta). Billeder blev erhvervet hver 3 s for en samlet varighed på 147 s. Skalastang: 2 μm. Se også Figur 3. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Praksis data til kvantificering af F-actin flow hastighed og actin polymerisering sats. En multikanal time-lapse stack billede af Lifeact (grøn) og HaloTag-actin (magenta). Se også Figur 3. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Fil 4: En kraft-kortlægning video detektering trækkraft på en neuronal vækst kegle. Den oprindelige (grønne) og forskudte (røde) positioner af perlerne. EGFP-signalet i vækstkeglen er vist med blåt. Billeder blev erhvervet hver 3 s for 147 s. Skalastang: 2 μm. Se også figur 6. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Trækkraft analyse kode. Se trin 8.12 for detaljeret brug. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Øv data til kvantificering af trækkraft. En enkelt-kanalS RGB billede af perlerne i utrænet substrat og single-kanal time-lapse stak RGB billeder af fluorescerende perler under en vækst kegle, EGFP, og lyse-felt. Se også Figur 7 og 8. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
De protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger kommercielt tilgængelige materialer og mikroskopiudstyr, der rutinemæssigt findes i alle laboratorier, institutter og universiteter. Derfor kan efterforskere nemt vedtage den nuværende enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi i deres undersøgelser.
Speckle imaging kan analysere actin polymerisering og kobling kobling. Derudover kan speckle imaging overvåge retrograd strømmen af kobling molekyler såsom shootin1 og cortactin, som interagerer med F-actin retrograd flow. Ved hjælp af et TIRF-mikroskop kan tilbageskridtet af celle vedhæsionsmolekylet L1-CAM også overvåges23,41; L1-CAM gennemgår greb og slip adfærd, der afspejler kobling kobling effektivitet23,41. Selv om denne undersøgelse anvender TMR-HaloTag-systemet til speckle imaging, andre fluorescerende proteiner, såsom EGFP og monomerisk rød fluorescerende protein, er også tilgængelige i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det væsentlige for visualisering af actin speckles er et lavt udtryksniveau af fluorescerende actin og belysning af et minimumsområde (figur 2). I denne protokol, Lifeact og HaloTag-actin signaler er sekventielt erhvervet. Fordi actin retrograd flow er relativt langsom (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analyse af F-actin retrograd flow og actin polymerisering er upåvirket af sekventiel billedopsamling af forskellige fluorescerende kanaler (~ 1 s interval). Lifeact er en meget udbredt F-actin markør, men kan konkurrere med actin bindende proteiner47. Af yderligere betydning kan Lifeact ændre actin dynamikken og derved påvirke F-actin strukturer og cellemorfologi47,48,49.
Trækkraft mikroskopi kan opdage kræfter til at drive vækst kegle forhånd. Ved at montere neuronerne i en ekstracellulær matrix kan efterforskere også analysere kræfter genereret i et semi-3D-miljø11. Høj forstørrelse billeddannelse er vigtig for præcis kvantificering af trækkraft, fordi vækst kegler generere svage trækkraft7. Selv om andre metoder med nanopillars eller stress-følsomme biosensorer også anvendes til at måle trækkraft50,51, PAA gel-baseret metode er meget tilpasningsdygtig og giver mulighed for justering af substrat stivhed ved at variere koncentrationerne af acrylamid og bis-acrylamid41,44,52. I denne protokol fremstilles PAA gelen i en endelig koncentration på 3,75% acrylamid og 0,03% bis-acrylamid; Young's modulus er ~ 270 Pa22 og denne stivhed er inden for området hjernevæv (100-10.000 Pa)53,54,55. På grund af tykkelsen af PAA gel (~ 100 μm), denne metode begrænser brugen af høj forstørrelse linser under mikroskopi. For at opnå billeder med høj forstørrelse skal efterforskerne bruge zoomfunktionen i et laserscanningsmikroskop.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den nuværende speckle imaging og traction force mikroskopi muliggør kvantitative analyser af de vigtigste begivenheder i kraft generationer. Disse oplysninger vil være uvurderlige for at forbedre forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for vækst kegle avancement og navigation.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af AMED under bevillingsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. og Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) og JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Uhelbredelige Sygdomme (T.M.) og NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
| Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
| Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
| Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
| C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
| Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
| D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
| Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
| Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
| HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
| Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
| Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
| LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
| MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
| Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
| Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
| ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
| Papain | Nacalai | 26036-34 | |
| Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
| pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
| Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
| pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
| Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
| Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
| Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
| ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
| ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |
References
- TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H.
- Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
- Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
- Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
- Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
- Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
- Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
- Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
- Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863 (2020).
- Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
- Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
- Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
- Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
- Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
- He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
- Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
- Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
- Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593 (2018).
- Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
- Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
- Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
- Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727 (2011).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
- Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724 (2009).
- Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
- Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
- Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
- Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
- Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
- Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
- Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
- Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
- Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156 (2019).
- Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
- Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130 (2021).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
- Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S.
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241 (2019).
- Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006 (2020).
- du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
- Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
- Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
- Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
- Tyler, W. J.
