Summary
Capace di recupero funzionale dopo lesioni del midollo spinale, il pesce zebra adulto è un sistema modello premier per chiarire i meccanismi innati di rigenerazione neurale. Qui, descriviamo la resistenza al nuoto e i saggi di comportamento del nuoto come letture funzionali della rigenerazione del midollo spinale.
Abstract
Grazie alla loro rinomata capacità rigenerativa, i pesci zebra adulti sono un modello di vertebrato di prim'ordine per interrogare i meccanismi di rigenerazione innata del midollo spinale. Dopo la completa trasezione del midollo spinale, i pesci zebra estendono i ponti gliali e assonali attraverso il tessuto reciso, rigenerano i neuroni prossimali alla lesione e riacquistano le loro capacità di nuoto entro 8 settimane dalla lesione. Il recupero della funzione di nuoto è quindi una lettura centrale per la riparazione funzionale del midollo spinale. Qui, descriviamo una serie di saggi comportamentali per quantificare la capacità motoria del pesce zebra all'interno di un tunnel di nuoto chiuso. L'obiettivo di questi metodi è quello di fornire misurazioni quantificabili della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto. Per la resistenza al nuoto, i pesci zebra sono sottoposti a una velocità di corrente dell'acqua in costante aumento fino all'esaurimento e viene riportato il tempo all'esaurimento. Per la valutazione del comportamento di nuoto, i pesci zebra sono soggetti a basse velocità di corrente e i video di nuoto vengono catturati con una vista dorsale del pesce. L'attività percentuale, la frequenza di scoppio e il tempo trascorso contro la corrente dell'acqua forniscono letture quantificabili del comportamento del nuoto. Abbiamo quantificato la resistenza al nuoto e il comportamento di nuoto nel pesce zebra selvatico prima dell'infortunio e dopo la trasduzione del midollo spinale. Abbiamo scoperto che il pesce zebra perde la funzione di nuoto dopo la traslazione del midollo spinale e gradualmente riacquista quella capacità tra 2 e 6 settimane dopo l'infortunio. I metodi descritti in questo studio potrebbero essere applicati a studi di rigenerazione neurocomportamentale, muscolo-scheletrica, muscolare scheletrica e di rigenerazione neurale nel pesce zebra adulto.
Introduction
I pesci zebra adulti sono eminentemente utilizzati per studiare i meccanismi di sviluppo neuromuscolare e muscolo-scheletrico e la modellazione della malattia1,2,3. I pesci zebra sono in grado di riparare in modo efficiente e spontaneo più tessuti, tra cui il cervello, il midollo spinale e il muscolo scheletrico4,5,6,7. La notevole capacità di rigenerare i tessuti neuromuscolari e le malattie modello sta attirando una crescente comunità scientifica nella ricerca sul pesce zebra adulto1,2,3. Tuttavia, mentre i saggi di locomozione e comportamento di nuoto sono disponibili e standardizzati per il pesce zebra larvale, vi è una crescente necessità di sviluppare protocolli analoghi nei pesci adulti8,9,10,11. L'obiettivo di questo studio è descrivere i protocolli per quantificare la resistenza al nuoto e il comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto. Presentiamo questi protocolli nel contesto della ricerca sulla rigenerazione del midollo spinale. Tuttavia, i protocolli comportamentali qui descritti sono ugualmente applicabili agli studi di rigenerazione neurale e muscolare, sviluppo neuromuscolare e muscolo-scheletrico, nonché modelli di malattie neuromuscolari e muscoloscheletriche.
Zebrafish inverte la paralisi entro 8 settimane dalla completa traslazione del midollo spinale. A differenza dei mammiferi scarsamente rigenerativi, i pesci zebra mostrano risposte immunitarie, neuronali e gliali pro-rigenerative necessarie per la riparazione funzionale del midollo spinale12,13,14. Una lettura definitiva della riparazione funzionale del midollo spinale è la capacità del tessuto lesionato di riacquistare la sua funzione dopo la lesione. Una serie di metodi standardizzati per valutare la rigenerazione funzionale nei roditori include test locomotori, motori, sensoriali e sensomotori15,16,17. I test ampiamente utilizzati nelle lesioni del midollo spinale del topo includono la basso mouse scale locomotoria (BMS), i test motori degli arti anteriori, i test sensoriali tattili e i test sensomotori di camminata a griglia15,17. A differenza dei sistemi di zebrafish mammiferi o larvali, i test comportamentali nei pesci zebra adulti sono meno sviluppati, ma molto necessari per soddisfare le crescenti esigenze delle comunità di rigenerazione dei tessuti e di modellazione delle malattie.
Le trasmissioni complete del midollo spinale provocano una paralisi completa caudale al sito della lesione. Poco dopo l'infortunio, gli animali paralizzati sono meno attivi ed evitano di nuotare il più possibile. Per compensare la perdita di capacità di nuoto, gli animali paralizzati mostrano brevi e frequenti esplosioni abusando delle loro pinne pettorali, che giacciono rostrali alla lesione. Questa strategia di nuoto compensativa si traduce in un rapido esaurimento e in una minore capacità di nuoto. Man mano che il midollo spinale del pesce zebra si rigenera, gli animali riacquistano una funzione di nuoto oscillatorio liscia caudale alla lesione, consentendo una maggiore resistenza al nuoto e migliori parametri di comportamento del nuoto. Qui, descriviamo i metodi per quantificare la resistenza al nuoto del pesce zebra all'aumentare le velocità della corrente d'acqua e il comportamento del nuoto a basse velocità attuali.
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Protocol
Il pesce zebra adulto dei ceppi Ekkwill e AB è stato mantenuto presso la Zebrafish Core Facility della Washington University. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli istituzionali sugli animali IACUC.
NOTA: un esempio della configurazione sperimentale è illustrato nella Figura 1A. Il coperchio di calibrazione (personalizzato), il coperchio di resistenza al nuoto (personalizzato) e il coperchio di comportamento di nuoto (standard, coperchio del tunnel chiuso) sono mostrati nella Figura 1B. Il flusso di lavoro sperimentale è presentato nella Figura 2.
1. Preparazione e calibrazione del tunnel di nuoto
- Riempire il tunnel di nuoto e la vasca tampone circostante con acqua di sistema zebrafish (10 L di acqua filtrata; alcalinità: 50-150 mg / L CaCO3; pH: 6,8-7,5; temperatura: 26-28,5 °C; nitrato < 50 mg / L; nitrito < 0,1 mg / L; e salinità < 0,5-1 g / L).
- Riempire un ulteriore serbatoio di flusso con acqua del sistema zebrafish (≈7,5 L). Posizionare il tunnel di nuoto e il serbatoio di flusso per consentire all'acqua in eccesso del sistema zebrafish di fluire dal serbatoio tampone nel serbatoio di flusso attraverso un tubo di deflusso fissato sul lato del serbatoio tampone.
- Una volta riempiti il tunnel e il serbatoio tampone, eseguire le operazioni seguenti.
- Posizionare la pompa di scarico all'interno del serbatoio tampone e collegarla al tunnel di nuoto adiacente con tubi in PVC. Posizionare la pompa di flusso all'interno del serbatoio di flusso e collegarla alla parete del serbatoio tampone.
- Accendere la pompa di scarico situata all'interno del serbatoio tampone e la pompa di flusso situata nel serbatoio di flusso per iniziare la circolazione dell'acqua.
NOTA: il sistema a doppia pompa garantirà un flusso continuo dell'acqua nel tunnel di nuoto (dalla pompa di scarico) e nel serbatoio tampone (dalla pompa passante). - Eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno del tunnel di nuoto aumentando gradualmente la velocità della corrente d'acqua da 10 cm / s a 100 cm / s a intervalli di 10 cm / s. Ridurre la velocità a 0 cm/s a intervalli di 10 cm/s. Per controllare la velocità del flusso, fare clic sulle frecce su e giù nella sezione Velocità del software di controllo della velocità del flusso (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: il motore e il rotore sono collegati al computer di accompagnamento. Il software di controllo della velocità del flusso comunica con il motore per creare la velocità del flusso desiderata. L'uso del software di controllo della velocità del flusso è opzionale. L'alternativa è controllare manualmente il motore della corrente d'acqua.
- Taratura
NOTA: la calibrazione è necessaria prima di ogni esperimento.- Utilizzare il coperchio di calibrazione per chiudere il tunnel di nuoto.
NOTA: il coperchio di calibrazione è personalizzato con un'apertura centrale rinforzata che si adatta alla sonda del flussometro utilizzata per la calibrazione (Figura 1B). Otto dadi alari sono utilizzati per fissare tutti i coperchi al tunnel. - Accendere il misuratore di portata digitale e collegarlo alla sonda del flussometro. Posizionare la sonda del flussometro all'interno del tunnel di nuoto tramite il coperchio di calibrazione. Posizionare le pale della sonda del flussometro perpendicolarmente alla direzione del flusso.
- Calibrare l'uscita del motore del tunnel di nuoto (controllato con il software di controllo della velocità del flusso) utilizzando il misuratore di portata digitale. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
- Aprire il software di controllo della velocità del flusso e fare clic su Calibrazione.
- Cambia le opzioni in alto a sinistra in RPM vs Tensione. Aumentare la velocità del flusso da 0 cm/s a 100 cm/s con incrementi di 5 cm/s, digitando i valori nella sezione Velocità del software di controllo della velocità del flusso. Ad ogni passaggio, fare clic sul pulsante "+" e registrare la velocità corrente indicata dal misuratore di portata digitale.
NOTA: la relazione lineare risultante deve avere un valore R2 vicino a 1. - Per confermare la calibrazione, aumentare le velocità della corrente dell'acqua da 0 a 10, 25, 50, 75 e 100 cm/s, quindi diminuire le velocità a 75, 50, 25, 10 cm/s utilizzando le frecce su e giù nella sezione Uwater [cm/s] del software di controllo della velocità del flusso. Ad ogni velocità (dal software), misurare e registrare la velocità corrispondente indicata dal misuratore di portata digitale.
- Considerare il tunnel calibrato e accurato se le velocità di corrente dell'acqua misurate rientrano in una deviazione di ±2 cm/s. Se la deviazione è superiore a ±2 cm/s, ripetere i passaggi da 1.4.4 a 1.4.6 per garantire una corretta calibrazione.
- Utilizzare il coperchio di calibrazione per chiudere il tunnel di nuoto.
2. Valutazione della resistenza al nuoto
NOTA: I gruppi sperimentali sono divisi in gruppi di 10 o meno animali per la resistenza al nuoto.
- Impostare il software di controllo della velocità del flusso.
NOTA: l'uso del software di controllo della velocità del flusso in questa sezione è facoltativo. L'alternativa è controllare manualmente il motore della corrente d'acqua. Per il controllo manuale della corrente d'acqua, procedere al passaggio 2.3 e aumentare manualmente la velocità della corrente dell'acqua negli incrementi specificati nei passaggi 2.5 e 2.6.- Aprire il software di controllo della velocità del flusso. Fai clic sulla casella Esperimento. Deseleziona Uswim e Uwater.
- Modificare la velocità del flusso nella casella Uwater [cm/s] in basso a sinistra per regolare le velocità della corrente dell'acqua.
- Per avviare un protocollo automatizzato, fare clic sulla casella Avvia registrazione . Nella finestra di dialogo che si apre, scegli Automatico dall'elenco a discesa.
- Per scegliere un file di protocollo salvato in precedenza, fare clic sull'icona del file accanto a File di protocollo per aprire il protocollo desiderato.
- Impostare il file di output facendo clic sull'icona del file accanto a File di registro. Nella finestra di Esplora file che si apre, assegna un nome al file di output e salvalo nella posizione desiderata.
- Impostare una finestra del timer del giro diviso. Assicurarsi di avere accesso simultaneo al software di controllo della velocità del flusso e alle finestre del timer sullo schermo del computer.
- Allestire un acquario per la raccolta dei pesci per ospitare i pesci esausti dopo la loro rimozione dal tunnel di nuoto. Riempire la vasca di raccolta con acqua del sistema zebrafish (0,75 L). Riempire un lungo tubo in PVC con acqua di sistema zebrafish.
- Posizionare un'estremità (estremità 1) del tubo in PVC preriempito nel serbatoio di raccolta e l'altra estremità (estremità 2) nel serbatoio tampone. Assicurarsi che l'acqua possa fluire liberamente dal serbatoio tampone al serbatoio di raccolta.
- Bloccare l'estremità superiore del tubo in PVC (estremità 2) con una clip legante per impedire il flusso d'acqua. Utilizzare la clip legante per controllare il deflusso dell'acqua secondo necessità.
- Chiudere il tunnel di nuoto utilizzando il coperchio di resistenza al nuoto.
NOTA: il coperchio di resistenza al nuoto è personalizzato con una finestra del tunnel di nuoto per rimuovere i pesci esausti dal tunnel di nuoto, senza interrompere il resto del test (Figura 1B). - Posiziona un gruppo di pesci all'interno del tunnel di nuoto. Avviare il timer split lap regolando la velocità corrente a 0 cm/s per 5 min, 9 cm/s per 5 min e 10 cm/s per 5 min digitando questi valori nella sezione Uwater [cm/s] del software di controllo della velocità del flusso.
NOTA: questo passaggio acclimaterà gli animali al tunnel di nuoto e alla direzione del flusso. - Dopo l'acclimatazione del pesce, avviare il programma di controllo automatico della velocità del flusso che aumenterà la velocità della corrente dell'acqua di 2 cm / s ogni minuto.
NOTA: Il pesce nuoterà fino all'esaurimento. I pesci esausti vengono spinti verso la parte posteriore del tunnel di nuoto. - Quando un pesce è esausto, sblocca il tubo di raccolta dei pesci, apri la finestra del tunnel di nuoto e raccogli il pesce nella vasca di raccolta. Registra il tempo all'esaurimento usando il timer split lap.
NOTA: i pesci possono occasionalmente andare alla deriva verso la parte posteriore del tunnel di nuoto senza essere esausti. Per assicurarti che un pesce sia esausto, tocca delicatamente l'estremità posteriore del tunnel o crea un'ombra su quell'area per stimolare il pesce a nuotare. I pesci esausti non rispondono allo stimolo dello startle e giacciono piatti all'estremità posteriore del tunnel. - Ripetere il passaggio 2.7 fino a quando tutti i pesci sono esauriti e raccolti nella vasca di raccolta. Fare clic sul pulsante Arresto di emergenza sul software di controllo della velocità del flusso e arrestare il timer.
NOTA: ricontrolla durante la nuotata se il numero di pesci rimossi dalla camera del tunnel di nuoto corrisponde ai tempi registrati. - Ripetere i passaggi da 2,5 a 2,8 per ogni gruppo di pesci.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui, ma per essere precisi al punto temporale dopo l'infortunio, si consiglia di eseguire film e nuotate di resistenza nello stesso giorno. Il tunnel può continuare a circolare mentre gli esperimenti sono in pausa.
3. Acquisizione di video per il test del comportamento di nuoto
NOTA: è possibile rintracciare solo fino a cinque animali alla volta. Se i gruppi sperimentali sono più grandi di cinque animali, è possibile eseguire più video per ciascun gruppo, in cui il primo video traccia cinque o meno animali e il secondo video tiene traccia degli altri cinque o meno animali. Per gli studi longitudinali che mirano a tracciare i singoli animali nel tempo, i pesci possono essere alloggiati individualmente e tracciati su più punti temporali. Tutti gli script per il monitoraggio e l'analisi sono disponibili tramite GitHub (vedere Tabella dei materiali).
- Accendi il pannello a infrarossi situato sotto il tunnel di nuoto. Fissare la telecamera su un supporto a soffitto sulla parte superiore del tunnel di nuoto. Regola le ghiere di messa a fuoco e apertura.
NOTA: le impostazioni di messa a fuoco e apertura dipendono dalla distanza tra la fotocamera e il tunnel di nuoto, nonché dall'ambiente luminoso. - Aprire il software di registrazione della telecamera (vedere Tabella dei materiali). Impostare le impostazioni del software come segue.
- Fate clic sulla visualizzazione dell'aspetto 1:4. Assicurati che il campo visivo copra l'intero tunnel di nuoto. Disattiva il contrasto automatico e il bilanciamento automatico del bianco per normalizzare lo sfondo e il contrasto tra i gruppi.
- Aprire la finestra Proprietà fotocamera facendo clic sull'icona della chiave inglese. Imposta i parametri come segue: Pixel Clock: 344 MHz, Frame Rate: 70 fps, fai clic sulla casella accanto a Hold per controllarlo, Tempo di esposizione: 0.290 ms. Non chiudere questa finestra.
- Ritagliare la finestra di registrazione per coprire solo la camera di nuoto del tunnel inclinando/ruotando la telecamera in base alle esigenze.
- Apri la finestra di registrazione facendo clic sull'icona della bobina del film. Impostare le impostazioni di registrazione come segue:
- Selezionare la casella relativa al numero massimo di fotogrammi.
- Immettere manualmente 63.000 per il numero di fotogrammi.
- Seleziona la casella Calc. Frame Rate. Ciò consente al programma di tirare il frame rate definito nel passaggio 3.2.2 (70 fps).
- Modificare la qualità JPEG su 30.
- Registrare un'esecuzione di test.
- Fare clic su Crea e denominare il nuovo file Test e salvarlo sul desktop.
- Torna alla finestra di registrazione e fai clic su Registra. Lascia che il filmato di prova venga eseguito per l'intera durata del protocollo (15 min).
- Una volta terminato il test, assicurarsi che non vi siano fotogrammi caduti e che vengano registrati 63.000 fotogrammi.
- Posizionare un gruppo di pesci nel tunnel di nuoto e chiudere il tunnel utilizzando un coperchio standard completamente chiuso (Figura 1B).
NOTA: Assicurarsi che tutti i pesci siano nel tunnel prima di stringere completamente il coperchio. Assicurati che non ci siano bolle d'aria sotto il coperchio. Ciò influenzerà altrimenti i risultati. - Aprire una nuova finestra di registrazione e assegnare un nome al file. Esempio: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
NOTA: assicurarsi che le impostazioni siano conformi ai parametri descritti nei passaggi 3.2 e 3.3. La qualità JPEG tornerà sempre ai valori predefiniti e deve essere ripristinata per ogni nuovo filmato.
ATTENZIONE: non fare ancora clic su Registra. - Inizia un nuovo esperimento utilizzando il software di controllo della velocità del flusso.
Nota : per avviare un protocollo automatico, fare clic sulla casella Avvia registrazione . Nella finestra di dialogo che si apre, scegli Automatico dall'elenco a discesa. Per scegliere un file di protocollo salvato in precedenza, fare clic sull'icona del file accanto a File di protocollo per aprire il protocollo desiderato.- Per iniziare un protocollo manuale, impostare la velocità del flusso su 0 cm/s per 5 min, 10 cm/s per 5 min, seguita da 20 cm/s per 5 min utilizzando la casella Uwater [cm/s] nel software di controllo della velocità del flusso.
- Salva il nuovo file di output dei dati (verrà salvato come file .csv) con lo stesso nome del file filmato e nella stessa cartella.
ATTENZIONE: non fare ancora clic su Avvia.
- Posiziona un tovagliolo di carta o un pezzo di tessuto sul lato del tunnel di nuoto per assicurarti che tutti i comportamenti siano dovuti al nuoto dei pesci e non a una risposta di spavento causata dal movimento nell'ambiente.
- In rapida successione, assicurati che l'acqua sia calma e che non si muovano increspature sul telaio. Fare clic su Registra nella finestra del software della fotocamera per avviare la registrazione del filmato. Fare clic su Avvia nel software di controllo della velocità del flusso per avviare il protocollo, che continuerà ininterrottamente.
- Guarda il filmato per assicurarti che nessun fotogramma venga lasciato cadere, che non ci siano bolle nel campo visivo e che tutti i pesci siano registrati.
- Una volta completata la registrazione del filmato, fare clic su Arresto di emergenza per terminare il protocollo di controllo della velocità del flusso. Verificare la presenza del file di output dei dati salvato automaticamente. Fare clic su Chiudi nella finestra di registrazione per salvare il file filmato.
- Rimuovere il coperchio. Recupera con cura i pesci e riportali al loro acquario.
- Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,12 per tutti i gruppi di pesci.
- Una volta terminata la registrazione del filmato per tutti i gruppi, converti i filmati da video a 70 fps a video a 20 fps con lo script MovieProcessing_v5.bat . Per fare ciò, sposta il file di script nella cartella contenente i video raw. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file e selezionare Esegui.
NOTA: lo script viene eseguito automaticamente. Verrà visualizzata una finestra del prompt dei comandi che mostra l'avanzamento dello script. Il passaggio precedente è facoltativo. Riduce il numero di fotogrammi in un video di 15 minuti da 63.000 a 18.000 fotogrammi e rende il SwimBehavior_v7. Lo script R viene eseguito più rapidamente. - Svuotare il tunnel e riporre tutta l'attrezzatura.
4. Analisi dei filmati per la valutazione del comportamento di nuoto
NOTA: la registrazione e l'analisi dei filmati possono essere completate in giorni separati.
- Aprire lo script Tracking_v2.ijm in Fiji e fare clic su Esegui per iniziare il programma. Nella finestra che si apre, scegli la cartella contenente i filmati di comportamento del nuoto da tenere traccia e fai clic su Apri. Cerca il fotogramma 1 del primo filmato, una finestra di dialogo e il gestore della regione di interesse (ROI) che verrà visualizzato.
- Seguire le istruzioni fornite nella finestra di dialogo. Create un ROI della parte inferiore della camera del tunnel di nuoto e fate clic su OK. Assicurarsi che non vengano visualizzati angoli neri.
NOTA: la finestra di soglia si aprirà insieme a un frame 1 modificato e con soglia. - Cambia la combinazione di colori da B&W a Red. Regolate il valore massimo fino a quando il fotogramma 1 mostra il pesce in rosso e nient'altro. Registrare la soglia. Fare clic su OK nella finestra di dialogo.
NOTA: il programma verrà eseguito automaticamente. Il ROI creato per il frame 1 verrà continuamente selezionato e deselezionato per i frame successivi. Una barra di avanzamento monitorerà il processo nell'angolo in basso a destra della finestra Figi . Il monitoraggio richiede circa 40 minuti per film. Quando tutti i film vengono tracciati, il programma Fiji si fermerà. Il ROI smetterà di essere selezionato. La cartella contenente i filmati avrà ora un file _raw.csv per ogni filmato. Le Figi possono essere chiuse a questo punto. - Allineamento, assemblaggio e acquisizione di statistiche descrittive
- Apri il Behavior_v7 Swim. Script R in R Studio.
- Fai clic su Sorgente nell'angolo in alto a destra della sezione script. In una nuova finestra che si apre, scegli la cartella contenente i file _raw.csv generati da Fiji. Fare clic su Apri.
NOTA: il programma verrà eseguito automaticamente. - In una finestra di dialogo che viene visualizzata chiedendo di confermare il numero di pesci in ogni filmato, fare clic su Sì se i numeri indicati sono corretti oppure fare clic su No se i numeri non sono corretti.
NOTA: se è stato fatto clic su No , verrà visualizzato un messaggio che chiede che i film vengano tracciati nuovamente con un nuovo ROI e una nuova soglia. Se è stato fatto clic su Sì , il programma procederà. - Nella nuova finestra che si apre chiedendo se il pesce che non nuota deve essere rimosso, fare clic su Sì o No.
NOTA: Il pesce non nuotatore è definito come pesce con un'attività inferiore al 50% a 10 cm / s. Non è consigliabile rimuovere i pesci non nuotatori. - In una nuova finestra pop-up che chiede se i gruppi sono non ciechi e se l'utente desidera combinare gruppi, unblind o combinare gruppi se c'è più di un gruppo di controllo.
- Dopo aver dato una risposta per la domanda precedente, assicurarsi che il programma fornisca un messaggio Allineando il file X di Y, dove X è il file corrente allineato e Y è il numero totale di file da allineare. Ci vogliono circa 30 s per ogni file per essere allineato.
- Una volta allineati i file, verificare la presenza di un nuovo file .csv generato con lo stesso nome (_aligned.csv). Assicurarsi che il programma combini i dati, esegua statistiche e stampi grafici di output. Verificare la presenza dei file di analisi generati in una nuova cartella denominata Risultati all'interno della cartella principale contenente i file _raw.csv e _aligned.csv .
- All'interno della cartella Risultati, verificare la presenza di due cartelle denominate Diagnostica e Grafici e di quattro file .csv denominati BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg e SummaryData_Full.
NOTA: il SummaryData_Full.csv contiene i dati individuali per ogni pesce di ciascun gruppo in ogni punto temporale. Questi dati vengono tracciati automaticamente, ma possono essere estratti e tracciati altrove.- Assicurarsi che la cartella Graphs contenga i grafici generati dal programma e .csv file contenenti i punti dati per ogni grafico.
- Verificare che la cartella Diagnostica contenga un singolo file .csv con i dati di diagnostica per i file allineati .
Nota : colonne nel file diagnostico.csv includono quanto segue: a) Il numero di fotogrammi contenenti oggetti aggiuntivi, che deve essere inferiore a 100. Troppi fotogrammi con oggetti extra suggeriscono un problema con il tracciamento. b) Il numero di fotogrammi con oggetti mancanti o uniti. È normale che questa metrica sia alta. I pesci che non si sono rigenerati bene saranno spesso spazzati sul retro del tunnel e saranno conteggiati come dispersi. c) Cornici con salti superiori a 240 pixel. Questo numero aumenta con il numero di oggetti (pesci) in un singolo filmato. Una spiegazione dettagliata di come sono state calcolate le metriche di comportamento è fornita nel file supplementare 1.
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Representative Results
Abbiamo impostato il tunnel di nuoto come descritto nella sezione 1 di questo protocollo (Figura 1). Abbiamo valutato la resistenza al nuoto (sezione 2 di questo protocollo) e il comportamento di nuoto (sezioni 3 e 4 di questo protocollo) del pesce zebra adulto al basale e dopo la lesione del midollo spinale (Figura 2).
Per stabilire la funzione motoria di base, abbiamo esaminato la resistenza al nuoto del pesce zebra selvatico sotto l'aumentare delle velocità della corrente d'acqua (Figura 3A). In questo test, il pesce zebra selvatico ha nuotato per 41 minuti prima di esaurirsi. I pesci sono stati quindi sottoposti a transezioni complete del midollo spinale come descritto in precedenza e sono stati eseguiti test di resistenza al nuoto6. Dopo aver anestetizzato il pesce zebra usando MS-222, viene praticata una piccola incisione con forbici fini per transettare il midollo spinale 4 mm caudale nella regione del tronco cerebrale. Una traselezione completa è stata confermata visivamente. Per confermare la perdita della capacità di nuoto dopo l'intervento chirurgico al midollo spinale, gli animali feriti sono stati valutati a 2 o 3 giorni dopo l'infortunio (dpi). In questo momento, i pesci zebra sono completamente paralizzati caudali al sito della lesione. La resistenza al nuoto è stata valutata a 2, 4 e 6 settimane dopo l'infortunio (wpi). A 2 wpi, i pesci lesionati hanno perso il 60% della loro capacità di resistenza al nuoto (Figura 3A). Il pesce rigenerante ha gradualmente riacquistato resistenza al nuoto a 4 e 6 wpi. Questi risultati hanno indicato che i pesci zebra selvatici sono in grado di riacquistare la capacità di resistenza al nuoto dopo una lesione del midollo spinale.
Per esaminare il comportamento di nuoto del pesce zebra durante la rigenerazione del midollo spinale, abbiamo monitorato il comportamento di nuoto di animali selvatici a velocità di corrente d'acqua di 0 cm / s o sotto velocità di corrente costante e bassa di 10 e 20 cm / s (Figura 3B). Le tracce medie della posizione dei pesci nella camera del tunnel di nuoto sono state utilizzate per la valutazione visiva del comportamento di nuoto a basse velocità di corrente (Figura 3B). In questo test, i controlli illesi nuotavano costantemente nella parte anteriore della camera del tunnel di nuoto (più vicina alla fonte di corrente d'acqua), che corrisponde a una posizione Y elevata (Figura 3B). Al contrario, a 2 wpi, i pesci feriti non erano in grado di mantenere una capacità di nuoto costante contro corrente. Di conseguenza, le loro piste di nuoto sono più irregolari con una diminuzione complessiva della posizione Y (Figura 3B). La posizione Y è aumentata a 4 e 6 wpi, indicando che gli animali rigeneranti hanno gradualmente riacquistato la loro capacità di nuotare nella parte anteriore della camera del tunnel di nuoto. Per quantificare i parametri di comportamento del nuoto, abbiamo calcolato l'attività percentuale, la posizione nel tunnel di nuoto (posizione Y) e il tempo nuotato contro corrente (Figura 3C-E). Rispetto ai controlli illesi, gli animali lesionati a 2 wpi erano marcatamente meno attivi (Figura 3C), bloccati nel quadrante posteriore del tunnel di nuoto (Figura 3D) e perdevano la loro capacità di nuotare contro basse velocità di corrente (Figura 3E). Coerentemente con la loro innata capacità di raggiungere il recupero funzionale, gli animali lesionati hanno gradualmente normalizzato i parametri di comportamento del nuoto a 4 e 6 wpi (Figura 3C-E). I parametri di resistenza al nuoto e comportamento del nuoto insieme hanno offerto letture quantificabili della funzione di nuoto e della riparazione funzionale del midollo spinale nel pesce zebra.
Figura 1: Configurazione del tunnel di nuoto e coperchi personalizzati. (A) Immagini rappresentative della galleria di nuoto allestita, comprese le viste superiori e laterali ingrandite della camera del tunnel di nuoto. (B) Immagini dei coperchi delle gallerie di nuoto utilizzate per le varie applicazioni descritte nel presente protocollo. Un coperchio standard del tunnel di nuoto completamente chiuso viene utilizzato per i test del comportamento di nuoto (sezione 3 di questo protocollo). Per la calibrazione viene utilizzato un coperchio del tunnel di nuoto modificato che ospita un misuratore di portata digitale portatile (sezione 1 di questo protocollo). Un coperchio di resistenza al nuoto modificato, contenente un coperchio rimovibile all'estremità posteriore della camera del tunnel di nuoto, consente la rimozione del pesce esausto durante i test di resistenza al nuoto (sezione 2 di questo protocollo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pipeline sperimentale per il test della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto. Per la resistenza al nuoto, i pesci nuotavano contro una corrente d'acqua crescente fino all'esaurimento. Per il comportamento di nuoto, i parametri di nuoto sono valutati in assenza e a basse velocità di corrente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Recupero funzionale nel pesce zebra selvatico dopo lesione del midollo spinale. (A) Funzione motoria determinata da saggi di resistenza al nuoto per pesci zebra selvatici al basale e 2, 4 e 6 wpi. I punti indicano singoli animali da due esperimenti indipendenti. (B) I saggi di comportamento di nuoto hanno monitorato il pesce zebra selvatico a basse velocità di corrente dell'acqua. La posizione media a Y viene mostrata in ogni punto temporale durante il tracciamento (0 cm / s per 5 min, 10 cm / s per 5 min e 20 cm / s per 5 min). (C-E) L'attività percentuale (C), la posizione media Y nel tunnel (D) e il tempo nuotato contro il flusso (E) sono stati quantificati a 20 cm / s. Per tutte le quantificazioni, vengono mostrati due esperimenti indipendenti. n = 30 nella condizione pre-infortunio; n = 23 a 2 wpi, n = 20 a 4 wpi, n = 18 a 6 wpi. ANOVA unidirezionale è stato utilizzato per analisi statistiche. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
I pesci zebra adulti sono un popolare sistema di vertebrati per modellare le malattie umane e studiare i meccanismi di rigenerazione dei tessuti. L'editing del genoma CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato gli studi genetici inversi per la modellazione della malattia nel pesce zebra; tuttavia, la genetica su larga scala nel pesce zebra adulto è stata ostacolata da sfide biologiche e tecniche, tra cui l'indisponibilità dei tessuti di zebrafish adulti alla fenotipizzazione ad alto rendimento. Data la complessa anatomia del pesce zebra adulto, è necessaria un'elaborazione istologica prolungata per ottenere e analizzare l'architettura dei tessuti. I saggi di resistenza al nuoto e comportamento di nuoto descritti in questo studio possono essere utilizzati per il pre-screening per fenotipi neurali, muscolari o scheletrici a un throughput medio prima dell'istologia. Inoltre, poiché gli studi sulla rigenerazione dei tessuti mirano a migliorare la riparazione funzionale dei tessuti, i protocolli descritti in questo studio saranno ampiamente applicabili, se non essenziali, per gli studi di ricerca sulla rigenerazione neurale, muscolare e scheletrica.
I saggi di locomozione funzionale sono stati parte integrante della nostra comprensione dello sviluppo e della rigenerazione neurale. I saggi locomotori standard sono ampiamente disponibili nelle specie di vertebrati, tra cui ratti, topi e pesci zebra larvali. I sistemi modello di topo e ratto hanno saggi di locomozione comportamentali e funzionali come BMS16 e BBB17,18, rispettivamente. Allo stesso modo, sono stati descritti una serie di protocolli per misurare la locomozione, la risposta allo startle e il comportamento nel pesce zebra larvale. Questi protocolli sono efficaci per rivelare differenze comportamentali tra gruppi sperimentali in ambienti chiari e scuri, evasione dei predatori e attività19,20,21. Qui, descriviamo metodi quantificabili e riproducibili per misurare il recupero funzionale dopo lesioni del midollo spinale nel pesce zebra adulto.
Si noti che questo studio presenta diverse limitazioni. In primo luogo, gli studi comportamentali dipendono fortemente da fattori genetici e ambientali. Per controllare la variabilità genetica, abbiamo usato fratelli per controllare l'età, il sesso e il background genetico in tutti i gruppi sperimentali22,23. Per controllare i fattori ambientali, ci siamo assicurati che gli esperimenti venissero eseguiti alla stessa ora del giorno, in condizioni di temperatura e illuminazione controllate20. In secondo luogo, mentre il test del comportamento di nuoto è meno sensibile all'analisi distorta, il ricercatore che esegue il test di resistenza al nuoto determina quando un pesce raggiunge l'esaurimento e procede a rimuovere il pesce esausto dalla camera del tunnel di nuoto senza interrompere il resto della coorte di pesci. Pertanto, i nostri esperimenti di resistenza al nuoto sono stati eseguiti da un singolo ricercatore che è cieco alle condizioni sperimentali. È particolarmente importante evitare la variabilità da ricercatore a ricercatore per gli studi longitudinali di gruppi sperimentali nel tempo. Infine, le collisioni tra pesci possono complicare l'analisi del tracciamento nei test del comportamento di nuoto. Raccomandiamo quindi di eseguire test di comportamento di nuoto per gruppi di cinque o meno pesci per ridurre al minimo le possibilità di collisioni tra pesci.
In considerazione dei passaggi critici, notiamo che i pesci feriti possono essere fragili soprattutto nei primi giorni dopo l'infortunio. Raccomandiamo quindi di maneggiare il pesce con estrema cura. Per i test di resistenza al nuoto, la raccolta del pesce con il tubo in PVC il più rapidamente possibile, prima la testa o la coda, riduce la possibilità di lesioni secondarie durante il processo di raccolta. Per i test di comportamento di nuoto, la pompa di scarico può occasionalmente creare onde, distorcendo i filmati e causando errori di analisi. In questo caso, la pompa di scarico può essere brevemente spenta. Tuttavia, non è consigliabile spegnere la pompa di scarico per tempi prolungati per garantire che l'acqua circoli costantemente tra la camera del tunnel di nuoto e il serbatoio tampone. Il monitoraggio della registrazione del filmato consente la chiusura e il riavvio immediati del filmato se un fotogramma è stato lasciato cadere o un pesce si allontana dall'area di registrazione. In ulteriori considerazioni, durante l'esecuzione dell'analisi di rilevamento, se il codice R genera un errore durante l'elaborazione dei file, il problema più probabile è nella denominazione dei file. Il programma è fatto per funzionare sotto una strategia di denominazione molto specifica: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything altro (ad esempio, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Questa denominazione consente di tracciare e allineare più punti temporali, gruppi e sottogruppi. Infine, mentre i checkpoint sono stati integrati nello script di analisi per garantire un tracciamento corretto, è importante controllare attentamente l'output dell'analisi. Il programma chiederà automaticamente se il numero del pesce è corretto e richiederà filmati per la ri-analisi se il numero del pesce non è corretto. Gli artefatti rettilinei possono essere visualizzati nel grafico della posizione media Y, indicando che un oggetto aggiuntivo è stato riconosciuto come un pesce. In questo caso, la migliore linea d'azione è guardare attentamente il film per escludere artefatti extra che tendono ad apparire a una velocità di flusso più elevata.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo la Washington University Zebrafish Shared Resource per la cura degli animali. Questa ricerca è stata supportata dal NIH (R01 NS113915 to M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
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