Summary
De huidige studie schetst een zeer reproduceerbare en handelbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsgebeurtenissen in vitro te bestuderen. Dit protocol werd toegepast om de impact van paracriene Wnt5a-signalering in muizenneuraalcellen en myoblasten te evalueren.
Abstract
Niet-canonische Wnt-signalering reguleert de intracellulaire actinefilamentorganisatie en gepolariseerde migratie van voorlopercellen tijdens embryogenese. Dit proces vereist complexe en gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Aangezien deze interacties kunnen optreden tussen verschillende soorten cellen uit verschillende afstammingslijnen, kan in vivo evaluatie van celspecifieke defecten een uitdaging zijn. De huidige studie beschrijft een zeer reproduceerbare methode om paracriene niet-canonische Wnt-signalering in vitro te evalueren. Dit protocol is ontworpen met de mogelijkheid om (1) functionele en moleculaire beoordelingen uit te voeren van niet-canonische Wnt-signalering tussen twee celtypen van belang; (2) de rol van signaalzendende versus signaal-ontvangende moleculen in de niet-canonische Wnt-signaleringsroute te ontleden; en (3) fenotypische reddingsexperimenten uitvoeren met standaard moleculaire of farmacologische benaderingen.
Dit protocol werd gebruikt om neurale crest cell (NCC)-gemedieerde niet-canonische Wnt-signalering in myoblasten te evalueren. De aanwezigheid van NCC's is geassocieerd met een verhoogd aantal falloïdine-positieve cytoplasmatische filopodia en lamellipodie in myoblasten en verbeterde myoblastmigratie in een wondgenezingstest. De Wnt5a-ROR2-as werd geïdentificeerd als een cruciale niet-canonische Wnt-signaleringsroute tussen NCC en tweede hartveld (SHF) cardiomyoblastvoorlopers. Kortom, dit is een zeer handelbaar protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsmechanismen in vitro te bestuderen.
Introduction
Niet-canonische Wnt-signalering is een evolutionair geconserveerde route die de organisatie van cellulair filament en directionele migratie reguleert. Deze route is betrokken bij meerdere biologische processen, waaronder embryonale weefselmorfogenese 1,2,3, lymfatische en vasculaire angiogenese 4,5,6,7, en kankergroei en metastase 8,9,10 . Op cellulair niveau wordt niet-canonische Wnt-signalering uitgevoerd door gecoördineerde paracriene interacties tussen signaal-zendende en signaal-ontvangende cellen. Deze interacties komen vaak voor tussen cellen van verschillende afstammingslijnen of typen en omvatten een divers moleculair netwerk dat tot 19 liganden en meerdere receptoren, co-receptoren en downstream signaaltransductie-effectoren omvat11. Om dit signaleringsproces verder te compliceren, hebben eerdere studies aangetoond dat ligand-receptorcombinaties op een context- en weefselafhankelijke manier kunnen variëren12,13, en dat dezelfde bronliganden die niet-canonische Wnt-signalering in signaal-ontvangende cellen aandrijven, kunnen worden geproduceerd door meerdere signaalzendende celtypen14,15 . Gezien de cellulaire en moleculaire complexiteit geassocieerd met niet-canonische Wnt-signalering, is het vermogen om individuele en klinisch relevante mechanismen in vivo te bestuderen beperkt.
Er zijn pogingen gedaan om niet-canonische Wnt-signalering te bestuderen met behulp van celkweektechnieken in vitro. Wondgenezingstests uitgevoerd in cellulaire monolagen zijn bijvoorbeeld gebruikt om cellulaire directionele migratie functioneel te beoordelen 4,16,17,18,19. Immunostaining-technieken zijn gebruikt om ruimtelijke analyses van oppervlakte-eiwitexpressie uit te voeren om niet-canonische Wnt-geïnduceerde veranderingen in cellulaire morfologie 7,10, architectuur en asymmetrische polarisatie 18,19,20 te evalueren. Hoewel deze benaderingen belangrijke hulpmiddelen hebben geboden voor het karakteriseren van Wnt-gerelateerde fenotypen in signaalontvangstcellen, beperkt het gebrek aan signaalzendende componenten in deze protocollen hun vermogen om paracriene signaleringsmechanismen die in vivo worden waargenomen nauwkeurig te modelleren. Als gevolg hiervan blijft er een kritieke behoefte om in vitro systemen te ontwikkelen die een robuuste en reproduceerbare evaluatie van paracriene signaleringsinteracties tussen signaal-verzendende en ontvangende cellen van de niet-canonische Wnt-route mogelijk maken, met name die van verschillende celtypen.
Hiertoe was het primaire doel van deze studie het opstellen van een protocol om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsinteracties in vitro te modelleren. We ontwikkelden een contactloos cocultuursysteem dat signaalzendende en signaalontvangstcomponenten van deze interacties samenvat en het gebruik van standaard moleculaire, genetische of farmacologische benaderingen mogelijk maakt om onafhankelijk specifieke ligandreceptormechanismen in de niet-canonische Wnt-route te bestuderen. Mechanismen van NCC-gemedieerde Wnt-signalering werden onderzocht in myoblasten met behulp van gevestigde muizencellijnen. Als bewijs van het principe werd dit model gebruikt om bevindingen van eerdere in vivo studies bij muizen te bevestigen die de Wnt5a-ROR2-as impliceren als een relevante niet-canonieke Wnt-signaleringsroute tussen NCC's21 en SHF cardiomyoblastvoorlopers 3,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preexperimentele expansie en passaging van cellen
- C2C12 celcultuur:
- Bereid 500 ml C2C12 kweekmedium door Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) te combineren met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
- Ontdooi een injectieflacon met C2C12-cellen in een waterbad van 37 °C. Terwijl de C2C12-cellen ontdooien, voegt u 5 ml C2C12-medium toe aan een conische buis van 15 ml. Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over naar de buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet.
OPMERKING: C2C12-cellen zijn muizenmyoblastcellen die eerder zijn gebruikt en gevalideerd als primaire cellijn voor het modelleren van cardiomyoblastvoorlopercellen. - Meng voorzichtig C2C12-cellen in de conische buis met behulp van een serologische pipet. Voeg vervolgens het volledige volume ontdooide cellen in C2C12-medium (6 ml) toe aan een kolf van 75 cm2 .
- Voeg 6 ml vers C2C12-medium toe aan de kolf voor een totaal volume van 12 ml. Draai de kolf voorzichtig zo dat de cel en de media-oplossing de gehele bodem van de kolf bedekken. Plaats de kolf in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO2) zodat de cellen zich kunnen hechten.
- Laat de cellen in de incubator uitzetten totdat ze ~60% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: Dit kan worden bepaald door de cellen periodiek uit de incubator te verwijderen en snel hun samenvloeiing onder een microscoop te controleren. Zorg ervoor dat u de tijd dat cellen uit de incubator worden verwijderd, minimaliseert.
- C2C12-cellen passeren:
- Verwarm het C2C12 medium, 500 ml 1x PBS en 0,25% trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C. Nadat de reagentia zijn opgewarmd, brengt u alle reagentia over naar de celkweekkap.
- Breng de kolf met de C2C12-cellen in de celkweekkap. Spoel de kolf met daarin de C2C12 cellen met warme 1x PBS tweemaal voorzichtig af.
- Kantel de kolf in een hoek van 45° en zuig het C2C12-medium aan met een glazen pipet die is aangesloten op vacuümafzuiging. Met behoud van een hoek van 45°, voeg voorzichtig 10 ml warme 1x PBS toe aan de hoek van de kolf met behulp van een serologische pipet. Leg de kolf plat op het oppervlak en beweeg de kolf voorzichtig in cirkelvormige bewegingen om ervoor te zorgen dat de 1x PBS over de hele monolaag van cellen spoelt.
OPMERKING: Pas op dat u de C2C12-monolaag niet verstoort tijdens het aanzuigen van het medium.
- Kantel de kolf in een hoek van 45° en zuig het C2C12-medium aan met een glazen pipet die is aangesloten op vacuümafzuiging. Met behoud van een hoek van 45°, voeg voorzichtig 10 ml warme 1x PBS toe aan de hoek van de kolf met behulp van een serologische pipet. Leg de kolf plat op het oppervlak en beweeg de kolf voorzichtig in cirkelvormige bewegingen om ervoor te zorgen dat de 1x PBS over de hele monolaag van cellen spoelt.
- Verwijder de 1x PBS na de tweede wasbeurt. Voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kolf, beweeg de kolf voorzichtig zoals hierboven beschreven om de trypsine-EDTA-oplossing over zoveel mogelijk van de monolaag te laten verspreiden en plaats de kolf gedurende 2 minuten in de incubator.
- Verwijder na 2 minuten incubatie de kolf uit de couveuse en tik er voorzichtig op om de resterende cellen los te maken.
- Voeg 9 ml C2C12 medium toe aan de kolf met een serologische pipet om het trypsine te doven. Spoel met behulp van de serologische pipet de cellen voorzichtig af met het medium en verzamel de 10 ml trypsinized celsuspensie. Voeg 10 ml van de celsuspensie toe aan een verse conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 100 × g .
- Breng de conische buis terug naar de celkweekkap en verwijder het supernatant met een glazen pipet die is aangesloten op vacuümafzuiging. Let er bij het aanzuigen van het supernatant op dat u de celpellet aan de onderkant van de conische buis niet verstoort. Om dit te doen, laat ~ 0,2 ml van het supernatant in de conische buis. Resuspendeer de cellen in 10 ml vers C2C12-medium.
- Voeg voor extra passaging 1 ml van de geresuspendeerde cellen toe aan een kolf van 75 cm2 . Voeg met een serologische pipet 11 ml C2C12 medium toe aan de kolf en plaats de kolf in de broedmachine.
- STO celkweek:
- Bereid STO-kweekmedium door 500 ml DMEM te maken met 7% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 nM L-glutamine.
- Bereid 0,1% gelatine door 0,5 g gelatinepoeder toe te voegen aan een fles met 500 ml weefselwaardig of geautoclaveerd water. Voeg 7 ml 0,1% gelatine-oplossing toe aan een kolf van 75 cm2 . Draai de kolf zodanig dat de gelatineoplossing de gehele bodem van de kolf bedekt. Laat de kolf 30 min bij kamertemperatuur incuberen in de celkweekkap.
- Verwijder na 30 minuten incubatie de overtollige gelatine met behulp van een pipet die is aangesloten op vacuümafzuiging. Laat de kolven voor gebruik nog 30 minuten in de broedmachine staan.
- Ontdooi een injectieflacon stocellen in een waterbad van 37 °C. Breng met behulp van een P1000-pipet de ontdooide cellen onmiddellijk over naar een conische buis van 15 ml met 5 ml vers bereid STO-kweekmedium.
OPMERKING: STO-cellen zijn muizenembryonale fibroblasten die routinematig worden gebruikt als feedercellen in celkweekprotocollen. - Meng de cellen in de conische buis voorzichtig met behulp van een serologische pipet. Voeg het volledige volume (6 ml) cellen toe aan een met gelatine beklede kolf van 75 cm2 . Draai de kolf om ervoor te zorgen dat de celsuspensie goed verdeeld is over de bodem van de kolf.
- Voeg 6 ml vers STO-medium toe aan de kolf voor een totaal volume van 12 ml. Draai de kolf zoals hierboven beschreven om ervoor te zorgen dat de cellen en het medium goed verdeeld zijn over de bodem van de kolf. Plaats de kolf in de incubator van 37 °C om de cellen te laten hechten. Laat de cellen zich vermenigvuldigen in de incubator totdat ze ~ 60-70% samenvloeiing bereiken.
- Passerende STO-cellen:
- Warm STO-celmedium, 1xPBS en 0,25% trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C.
- Spoel de kolf met STO-cellen voorzichtig af met warm 1x PBS tweemaal zoals beschreven in stap 1.2.2.1.
- Voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kolf met behulp van een P1000-pipet. Plaats de kolf gedurende 5 minuten in de incubator van 37 °C.
- Verwijder na 5 minuten incubatie de kolf uit de broedmachine. Tik voorzichtig op de kolf om eventuele aanhangende cellen los te maken.
- Voeg 9 ml STO-medium toe aan de kolf om de trypsine te doven en verzamel de 10 ml trypsinized celsuspensie zoals hierboven beschreven. Voeg 10 ml van de celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 100 × g .
- Verwijder het supernatant en resuspensieer de cellen in 10 ml STO-medium zoals hierboven beschreven. Voeg voor extra passaging 1 ml van de geresuspendeerde cellen toe aan een kolf van 75 cm2 . Voeg 11 ml STO-medium toe, draai de kolf om een gelijkmatige verdeling van de cellen en het medium langs de bodem van de kolf te garanderen en plaats de kolf in de incubator.
- Inactieve STO-celkweek en O9-1 cel basaal mediumpreparaat:
- Bereid O9-1 cel basaal kweekmedium door 500 ml DMEM te mengen met 15% FBS, 1% penicilline /streptomycine, 2 nM L-glutamine, 0,1 mM minimale niet-essentiële aminozuren, 1 nM natriumpyruvaat en 55 μM bèta-mercaptoethanol.
- Bereid mitomycine C-oplossing in 1x PBS in een concentratie van 0,5 mg/ml door 4 ml 1x PBS rechtstreeks aan een injectieflacon met mitomycine C toe te voegen. Pipetteer de oplossing meerdere keren met een P1000 pipet. Om de mitomycine C verder op te lossen in 1x PBS, plaatst u de injectieflacon op een vortexmixer of benchtop rocker gedurende 45 minuten tot 1 uur.
- Inactiveer de STO-cellen door de STO-platen te behandelen met een eindconcentratie van 0,01 mg/ml mitomycine C toegevoegd aan het standaard STO-medium. Plaats de STO-platen gedurende 2 uur in de couveuse en zorg ervoor dat de kolf met mitomycine C tegen licht wordt beschermd door de tijd die buiten de incubator wordt doorgebracht te minimaliseren. Was na mitomycinebehandeling de cellen in 1x PBS tweemaal zoals beschreven in stap 1.2.2.1.
OPMERKING: Mitomycine C remt de proliferatie van STO-cellen, zodat ze kunnen worden gebruikt om gedurende meerdere dagen geconditioneerd medium te genereren zonder overconfluent in de kolf te worden. - Voeg na het verwijderen van de 1x PBS 12 ml O9-1 basaal kweekmedium toe aan de geïnactiveerde STO-celculturen en incubeer ze gedurende 24 uur. Verzamel het geconditioneerde, geïnactiveerde STO + O9-1 basale kweekmedium en plaats het in conische buizen van 50 ml gewikkeld in folie om het te beschermen tegen licht.
- Voeg 12 ml vers O9-1 basaal kweekmedium toe aan de geïnactiveerde STO-celculturen zoals hierboven beschreven. Herhaal deze stap door elke 24 uur een nieuw O9-1 basaal kweekmedium toe te voegen aan dezelfde flanken die de geïnactiveerde STO-cellen bevatten.
OPMERKING: Na behandeling met mitomycine C kunnen de geïnactiveerde STO-cellen zich niet vermenigvuldigen; daarom kunnen de kolven met de geïnactiveerde STO-cellen worden hergebruikt om geconditioneerd medium te genereren. - Bewaar de in folie verpakte conische buizen van 50 ml met geconditioneerd, geïnactiveerd STO + O9-1 basaal kweekmedium bij 4 °C totdat in totaal 500 ml van het medium is verzameld.
- O9-1 celcultuur:
- Bereid O9-1 celgroeimedium voor met behulp van 500 ml geconditioneerde STO + O9-1 basaal medium en voeg 103 eenheden leukemie remmende factor (LIF) en 25 ng / ml basis fibroblastgroeifactor (basis-FGF) toe.
- Bereid 0,1% met gelatine beklede kolven zoals beschreven in stap 1.3.2-1.3.3.
- Ontdooi een injectieflacon met O9-1 cellen in een waterbad van 37 °C. Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over naar een conische buis van 15 ml met 5 ml vers bereid O9-1 groeimedium.
OPMERKING: De O9-1 cellijn is de enige stabiele, multipotente neurale crest cellijn die door de muis is gegenereerd. Deze cellijn wordt vaak gebruikt in neurale crest in vitro experimenten. - Meng de cellen voorzichtig met behulp van een serologische pipet. Voeg de volledige 6 ml cellen toe aan een met gelatine beklede kolf van 75 cm2 .
- Voeg 6 ml O9-1 groeimedium toe aan de kolf voor een totaal volume van 12 ml. Plaats de kolf in de incubator van 37 °C om de cellen te laten hechten. Laat de cellen zich vermenigvuldigen in de incubator totdat ze ~ 60-70% samenvloeiing bereiken.
- O9-1 cellen passeren:
- Warm O9-1 groeimedium, 1x PBS en 0,25% trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C.
- Spoel de plaat met O9-1 cellen voorzichtig af met warme 1x PBS tweemaal zoals beschreven in stap 1.2.2.1.
- Voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kolf en plaats deze gedurende 5 minuten in de incubator van 37 °C.
- Verwijder na 5 minuten incubatie de kolf uit de couveuse en tik zachtjes op de kolf om eventuele aanhangende cellen los te maken.
- Voeg 9 ml O9-1 groeimedium toe aan de kolf om het trypsine te doven. Verzamel 10 ml van de trypsinized celsuspensie en voeg 10 ml van deze celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in 10 ml O9-1 groeimedium. Voeg voor extra passaging 1 ml van de geresuspendeerde cellen toe aan een kolf van 75 cm2 . Voeg 11 ml O9-1 groeimedium toe en plaats de kolf met de cellen in 12 ml medium in de incubator van 37 °C.
2. Plating cellen in een cocultuursysteem
- Plating C2C12 celkamers:
- Na trypsinisatie (zoals beschreven in stap 1.2) resuspensie van de C2C12-celpellet in 10 ml C2C12-medium. Verdun de cellen in een verhouding van 1:20 in C2C12-medium door 0,5 ml van de geresuspendeerde C2C12-cellen te verwijderen en toe te voegen aan een nieuwe conische buis van 15 ml met 9,5 ml vers C2C12-medium. Meng de suspensie voorzichtig met een serologische pipet.
- Voeg 1 ml van de 1:20-verdunde C2C12-cellen toe aan elke put van een nieuwe put met 4 kamers met behulp van een P1000-pipet en plaats de put met 4 kamers in de incubator.
- Plating O9-1 cel inserts:
- Na trypsinisatie resuspenseert u de O9-1-celpellet in 10 ml O9-1 groeimedium. Verdun de cellen in een verhouding van 1:20 in O9-1 groeimedium door 0,5 ml van de geresuspendeerde C2C12-cellen te verwijderen en toe te voegen aan een nieuwe conische buis van 15 ml met 9,5 ml vers O9-1 groeimedium. Meng de suspensie voorzichtig met een serologische pipet.
- Plaats een enkele doorlatende insert (zie de tabel met materialen) in elke put van een nieuwe put met 4 kamers gevuld met 1 ml O9-1 groeimedium.
OPMERKING: Deze put met 4 kamers moet verschillen van die met de C2C12-cellen uit stap 2.1.3. - Voeg 300 μL van de verdunde O9-1 celsuspensie toe aan elke insert met behulp van een P1000-pipet. Zorg ervoor dat de bodem van elke insert wordt ondergedompeld in de put gevuld met 1,3 ml O9-1 groeimedium. Plaats de put in de incubator van 37 °C.
- (Optioneel). Voer siRNA knockdown uit in de O9-1 cellen of C2C12 cellen.
- Voer gen knockdown uit door siRNA 18-24 uur na het platen van O9-1 celinzetstukken of C2C12-celkamerputten.
- Verdun het siRNA- en transfectiereagens in gereduceerd serummedium (zie de materiaaltabel) volgens de aanbevelingen van de fabrikanten en de gewenste concentraties voor het experiment. Meng voorzichtig het verdunde siRNA en transfectiereagens (1:1) en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
OPMERKING: In dit protocol werden 50 nM-concentraties gebruikt omdat deze siRNA-concentratie werd bepaald om te resulteren in voldoende knockdown van doelgenexpressie. - Voeg de siRNA-lipidecomplexen toe aan de O9-1 celinzetstukken of de C2C12-celkamerputten zoals bepaald door het experimentele ontwerp en incubeer de cellen met de siRNA-lipidecomplexen gedurende ~ 36-48 uur.
- Verdun het siRNA- en transfectiereagens in gereduceerd serummedium (zie de materiaaltabel) volgens de aanbevelingen van de fabrikanten en de gewenste concentraties voor het experiment. Meng voorzichtig het verdunde siRNA en transfectiereagens (1:1) en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
- Voer gen knockdown uit door siRNA 18-24 uur na het platen van O9-1 celinzetstukken of C2C12-celkamerputten.
3. Het uitvoeren van wondtesten en het kwantitatief beoordelen van myoblastmigratie
- Wondtest:
- Laat de O9-1 celinzetstukken en C2C12-celkamerputten zich hechten en vermenigvuldigen in de incubator totdat beide cellen ~ 70-80% samenvloeiing hebben voordat u doorgaat met dit deel van het protocol. Als cellen >90% confluent groeien, ga dan niet verder met de krastest, omdat cellen alleen maar loskomen van de put.
- Verwarm 1x PBS en C2C12 medium door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen.
- Verwijder supernatant medium goed uit de C2C12 kamer en was de cellen eenmaal met 1x PBS. Verwijder de 1x PBS en kras de cellen onmiddellijk met een steriele P10 pipetpunt.
- Geef de steriele P10 pipetpunt stevig in één richting om de volledige lengte of breedte van de celmonolaag te overspannen (bijvoorbeeld van rechts naar links, van boven naar beneden). Zorg ervoor dat u elke put met cellen slechts één keer krast.
OPMERKING: Om de krasresultaten te optimaliseren, krabt u putten van verschillende experimentele omstandigheden op een vergelijkbaar niveau van samenvloeiing. Om dit te doen, moet u ervoor zorgen dat elke put met 4 kamers cellen heeft voor elke vereiste experimentele toestand (bijv. Goed # 1 negatieve controle, goed # 2 positieve controle). Gebruik bovendien een nieuwe steriele P10-pipet voor elke kras en oefen elke keer een vergelijkbare hoeveelheid kracht uit op de pipet. Probeer niet meer dan één kras in elke put te maken. - Voeg na het krabben snel 1 ml 1x PBS terug in de put met behulp van een P1000 pipetpunt. Herhaal dit proces voor elke put die wordt bekrast.
OPMERKING: Gezien de variabiliteit die gepaard gaat met elke kras, wordt aanbevolen dat meerdere putten (n = 3) worden gebruikt voor het maken van wondjes in elke experimentele toestand. Werk snel omdat het van cruciaal belang is om de duur te minimaliseren waarvoor de cellen tijdens deze stappen zonder 1x PBS zijn. Na het verwijderen van 1x PBS uit elke put, mag men niet meer dan 5 s nodig hebben om een wond in elke put te genereren.
- Geef de steriele P10 pipetpunt stevig in één richting om de volledige lengte of breedte van de celmonolaag te overspannen (bijvoorbeeld van rechts naar links, van boven naar beneden). Zorg ervoor dat u elke put met cellen slechts één keer krast.
- Nadat u een wond hebt gegenereerd en 1x PBS weer aan elke put hebt toegevoegd, brengt u de kras in beeld met een omgekeerde microscoop en gebruikt u deze afbeelding als de basiswondgrootte (tijd 0). Voer de volgende stappen uit om afbeeldingen te maken:
- Schakel de computer en de microscoop in (zie de tabel met materialen) door op de aan / uit-knop te drukken. Plaats de kamerschuif op het werkgebied en draai de objectiefknop naar 5x vergroting.
- Open de beeldbewerkingssoftware (zie de materiaaltabel) door te dubbelklikken op het softwarepictogram op het bureaublad van de computer. Klik op het tabblad Camera op het startscherm van de software. Klik op de knop Live om de cellen op het tabblad AxioCam IC te visualiseren.
- Zorg ervoor dat het lichtfilter helemaal naar buiten wordt getrokken om licht door te laten naar de camera en het computerscherm. Verplaats en/of draai de kamerschuif handmatig om het wondgebied in het midden van het livebeeld op het tabblad AxioCam IC te plaatsen.
- Als u foto's wilt maken, klikt u op Uitlijnen om een nieuw tabblad te openen naast het tabblad AxioCam IC dat de afbeelding bevat.
- Als u deze stilstaande afbeelding wilt opslaan, klikt u op bestand linksboven op de startpagina van de software | opslaan als | voert u de bestandsnaam in het vak bestandsnaam in. Sla de figuur op in Carl Zeiss-afbeelding (*.czi) -indeling (de standaardinstelling) en selecteer het bureaublad op de balk aan de linkerkant om het bestand op het bureaublad op te slaan als een .czi-bestand , dat alleen kan worden geopend in het Zen lite 2012-softwareprogramma.
- Als u de afbeelding als .tiff wilt opslaan, klikt u op bestand | opslaan als | voert u de bestandsnaam in het vak Bestandsnaam in. Sla de figuur op als gelabeld afbeeldingsbestand (*.tiff) door op de knop Opslaan als type te klikken en *.tiff te selecteren in het vervolgkeuzemenu.
OPMERKING: Het .tiff formaat kan in elke beeldverwerkingssoftware worden geopend. - Verplaats de kamerschuif handmatig om nog 2-3 afbeeldingen te maken op andere punten van de wond in dezelfde put.
OPMERKING: In totaal zal dit resulteren in 3-4 niet-overlappende, hoge vergrotingsbeelden van de wond in elke put.
- Verwijder de 1x PBS uit elk putje en voeg 1 ml C2C12 medium toe.
OPMERKING: Wees voorzichtig om niet te agressief te pipetteren bij het verwijderen of toevoegen van oplossingen aan de kamer na het genereren van wond, omdat dit ertoe kan leiden dat cellen goed loskomen van de kamer. Kantel bovendien de kamer goed, zodat aspiratie en herintroductie van oplossingen op de hoeken van elke put kan worden gedaan om verstoring van de celmonolagen te minimaliseren. - Monteer het cocultuursysteem van de putinzet door de inzetstukken met de O9-1-cellen handmatig in elke put van de kamerput te plaatsen. Duw de inserts voorzichtig naar beneden in de put, zodat de onderkant van de insert net boven de onderliggende C2C12-cellen zit. Breng de putinzetconstructies terug naar de incubator.
OPMERKING: Sta niet toe dat de onderkant van het inzetstuk de onderliggende C2C12-cellen fysiek raakt en mechanisch verstoort. - Laat de cellen migreren voor een totaal van 9-12 uur. Om de optimale migratietijd te bepalen, controleert u de cellen op 6 uur na het maken van de wond en daarna om de 2-3 uur. Beëindig het experiment wanneer de cellen in controle- of positieve controleomstandigheden de wond volledig beginnen te bedekken.
OPMERKING: Gezien de contactloze aard van de constructie, hoeft de bovenliggende insert niet uit de putten te worden verwijderd bij het controleren van de intervalmigratievoortgang. Migratievariabiliteit zal worden waargenomen afhankelijk van factoren zoals de celtypen die in deze test worden gebruikt, cellulaire dichtheid op het moment van wondgeneratie, de breedte van de gecreëerde wond en experimentele omstandigheden van gemanipuleerde cellen (bijv. Gen knockdown, recombinante eiwittoevoeging). De concentraties van deze reagentia moeten experimenteel worden bepaald met richtsnoeren van aanbevelingen van de fabrikant.
4. Immunofluorescentiekleuring en beeldvorming van migrerende myoblasten
- Het beëindigen van de migratietest en het deconstrueren van het putinzetsysteem:
- Verwijder de O9-1 celinzetstukken na een migratieperiode van 9-12 uur (of een alternatieve tijd die wordt aangewezen door experimentele omstandigheden). Zuig het C2C12 medium voorzichtig aan met een P1000 pipet. Voeg 0,5 ml 1x PBS toe aan de kamerputten en maak definitieve beelden van cellen na migratie.
- Zuig zorgvuldig alle 0,5 ml 1x PBS gemengd met medium en verwijder de plastic kamers uit de kamerputten met behulp van kitinstructies, waarbij de onderliggende dia met de C2C12-cellen achterblijft.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de C2C12-cellen die aan de dia hechten niet verstoort bij het verwijderen van de kamerputten.
- Immunostaining uitvoeren:
- Plaats de dia onmiddellijk in een diahouder met 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Giet de 4% PFA uit en voeg 0,1% Triton X-100-bevattende 1x PBS (1x PBST) toe aan de schuifhouder om de glijbaan 15 minuten op kamertemperatuur te wassen. Giet de 1x PBST uit en voeg 1x PBS toe aan de diahouder om de glijbaan 10 minuten op kamertemperatuur te wassen. Herhaal deze stap nogmaals voor een totaal van twee 1x PBS-wasbeurten.
- Verwijder de dia uit de schuifhouder. Teken de buitenranden van de dia met een hydrofobe pen om een hydrofobe rand rond de dia te creëren om te voorkomen dat oplossingen van de dia morsen. Zorg ervoor dat u de aanhangende cellen niet verstoort.
- Voeg 1% runderserumalbumine (BSA) blokkerende oplossing (verdund in 1x PBS) toe aan de dia (~ 0,5 ml per dia). Zorg ervoor dat de oplossing zich binnen de hydrofobe grens bevindt die in stap 4.2.4 is gemaakt. Incubeer de glijbaan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde schuifkamer.
OPMERKING: Hoewel BSA-blokkering niet vereist is voor phalloidine-immunostaining, maakt deze stap in het protocol koppeling met fluorescentie-antilichaamkleuring mogelijk. - Giet na 1 uur blokkeren de blokkerende oplossing uit de dia, voeg het falloïdine-antilichaam (verdund tot 1:200 in 1% BSA-blokkerende oplossing toe door 5 μL van het antilichaam toe te voegen aan 995 μL BSA-oplossing) toe aan de dia en incubeer bij 4 °C 's nachts. Zorg er nogmaals voor dat de oplossing zich bevindt binnen de hydrofobe grens die in stap 4.2.4 is gemaakt. Aangezien het falloïdine-antilichaam is geconjugeerd aan Alexa Fluor-488-kleurstof, minimaliseer de blootstelling aan licht van het antilichaamreagens voor en na toevoeging aan de dia.
- Plaats de volgende dag de dia in een diahouder die beschermd is tegen blootstelling aan licht (wikkel de diahouder bijvoorbeeld in folie of gebruik een niet-transparante diahouder). Was de cellen in de diahouder met 1x PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Herhaal de wasbeurt gedurende in totaal drie wasbeurten van 10 minuten.
- Voeg 4',6-diamidino-2-fenyladool (DAPI)-bevattend montagemedium toe en monteer de dia's met glazen coverslips. Stel de cellen af die zijn gemigreerd met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effecten van NCC's op de migratiecapaciteit van muizenmyoblasten
Deze test werd voor het eerst toegepast om de impact van NCC's op de migratiecapaciteit van myoblasten te evalueren. Figuur 1 schetst het schematische model van de test. Om deze impact te testen, werden krastests uitgevoerd met myoblasten die geïsoleerd werden gekweekt (zonder NCC-inserts) in vergelijking met die gekweekt in de aanwezigheid van inserts. Als positieve controle werd 500 ng/ml recombinant Wnt5a (rWnt5a) toegevoegd aan kamerputten met NCC-inserts. Deze concentratie van rWnt5a werd bepaald door een dosis-responsanalyse uitgevoerd in C2C12-cellen (aanvullende figuur S1). Representatieve afbeeldingen van NCC-inserts worden weergegeven in aanvullende figuur S2, waaruit blijkt dat de NCC's op dit moment gezond zijn. Immunofluorescentie toont robuuste knockdown van Wnt5a op eiwitniveau na incubatie met 50 nM Wnt5a siRNA (supplementale figuur S3). Na een migratieperiode van 9 uur bleek dat de aanwezigheid van NCC's de migratiecapaciteit van myoblasten significant verhoogde in vergelijking met myoblasten die werden getest in afwezigheid van NCC-inserts (72,6% wondbevolkt gebied versus 59,1% wondbevolkt gebied, p = 0,033). De toevoeging van rWnt5a aan cocultuurputten versnelde de migratie van myoblasten, waarbij sommige wondgebieden volledig herstel vertoonden tegen het 9 uur durende tijdstip, zoals weergegeven in figuur 2. Zoals verwacht vertoonden migrerende myoblasten in alle drie de omstandigheden een normale migrerende cellulaire morfologie, waaronder goed gevormde en uitstekende filopodia en lamellopodia en asymmetrische polarisatie van actinecytoskeletale projecties (figuur 2C).
Belang van NCC-afgeleide Wnt5a voor gepolariseerde migratie van myoblasten
Om het paracriene effect van NCC-afgeleide Wnt5a op myoblastmigratie te evalueren, werden wondgenezingstests uitgevoerd in myoblasten na de siRNA-gemedieerde knockdown van Wnt5a in NCC's. Ten eerste werd de knockdown-efficiëntie van Wnt5a gevalideerd in NCC's door real-time-kwantitatieve polymerasekettingreactie. Behandeling met 50 nM siRNA tegen Wnt5a bleek de Wnt5a-genexpressie met 64% te verminderen in vergelijking met negatief controle (gecodeerd) siRNA (figuur 3A). Met behulp van deze concentratie werden O9-1 celinzetstukken getransfecteerd met controlesiRNA of Wnt5a siRNA 48 uur voorafgaand aan het assembleren van de cocultuur. C2C12-cellen werden onder normale omstandigheden gekweekt en wonden werden gemaakt bij de juiste samenvloeiing. Onmiddellijk na het genereren van wondjes werden negatieve controle of Wnt5a knockdown NCC-inserts aan elke put toegevoegd. Na een migratieperiode van 10 uur bleek dat knockdown van Wnt5a in NCC's de onderliggende myoblastmigratiecapaciteit aanzienlijk verminderde in vergelijking met myoblasten die werden getest met controle-NCC's (39,1% wondbevolkt gebied versus 74,8% wondbevolkt gebied, p < 0,001). Bovendien vertoonden myoblasten getest in aanwezigheid van NCC's met knockdown van Wnt5a abnormale cytologische morfologie door immunostaining, waaronder verminderde cytoplasmatische gebieden en minder actinecytoskeletale projecties (figuur 3D). Om myoblastmigratie te redden, werd exogene suppletie van 500 ng / ml rWnt5a toegevoegd aan cocultuurputten met Wnt5a knockdown-inserts. De toevoeging van exogene rWnt5a bleek migrerende en morfologische defecten die bij deze myoblasten werden waargenomen volledig te redden (figuur 3C,D).
Wnt5a signalering via ROR2 in myoblasten als aanjager van gepolariseerde migratie
Om de signaal-ontvangende celmechanismen in dit paracriene model beter te begrijpen, werd de test herhaald na de knockdown van de ROR2-receptor in myoblasten. In dit experiment werden myoblasten getransfecteerd met 50 nM ROR2 siRNA ~ 40 uur voorafgaand aan wondgeneratie, wat voldoende bleek te zijn om de ROR2-genexpressie met 54% te verminderen (figuur 4A). Gedurende deze tijd werden NCC-inserts parallel gekweekt onder normale omstandigheden. Nadat myoblasten de juiste samenvloeiing hadden bereikt, werden krastests uitgevoerd en werden cocultuurputinzetstukken geassembleerd. Na een migratieperiode van 10 uur in aanwezigheid van NCC-inserts vertoonden ROR2 knockdown-myoblasten een verminderde migratiecapaciteit in vergelijking met myoblasten behandeld met negatief controlesiRNA (48,1% wondbevolkt gebied versus 75,7% wondbevolkt gebied, p = 0,019) (figuur 4B, C). De toevoeging van 500 ng/ml rWnt5a heeft de migratiecapaciteit van myoblasten na ror2 knockdown niet kunnen redden, wat suggereert dat ROR2-uitputting het vermogen van myoblasten om Wnt5a-signalen te ontvangen verstoort (figuur 4B, C). Immunostaining voor falloïdine bevestigde de migratiegegevens en toonde aan dat een vermindering van falloïdine-positieve lamellopodie en filopodia in ROR2 knockdown myoblasten niet werd hersteld door aanvullende rWnt5a (figuur 4D).
Figuur 1: Schematisch model van de test. Stap 1 omvat de in vitro expansie van C2C12 myoblasten en NCC's met behulp van STO-feedercellen. Stap 2 omvat de plating van NCC's en C2C12-cellen in het cocultuursysteem. Stap 3 omvat de wondtest uitgevoerd in onderliggende C2C12-cellen om de cellulaire migratiecapaciteit te evalueren. Stap 4 omvat immunostaining voor falloïdine om cytologische architectuur en morfologie van gemigreerde cellen te evalueren. Afkortingen: NCC's = neurale crest cellen; Ab = antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Aanwezigheid van neurale crestcellen verhoogt de migratiecapaciteit van myoblasten. (A) De aanwezigheid van neurale crest cell (NCC) inserts op het moment van wondgeneratie leidt tot verbeterde myoblastmigratie. De toevoeging van exogene recombinant Wnt5a (rWnt5a) aan NCC-C2C12 coculturen heeft het sterkste positieve effect op myoblastmigratie. (B) Kwantificering van het gemiddelde herbevolkte areaal van myoblasten na 9 uur na het ontstaan van wondjes (foutbalken tonen standaarddeviatie). (C) Falloidinekleuring van myoblasten aan de wondrand 9 uur na wondgeneratie. Onderbroken rechthoeken tonen met falloidine bevlekte myoblasten aan het migratiefront. Voor elke in B gekwantificeerde experimentele toestand werden in totaal n = 3 monsters gebruikt. Schaalstaven = 200 μm (voor A en C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Neural crest cell-derived Wnt5a is noodzakelijk voor myoblastmigratie. (A) Relatieve mRNA-expressie van Wnt5a om siRNA-gemedieerde knockdown in NCC's te valideren. (B) Migratie van C2C12-myoblasten is aanzienlijk verminderd na Wnt5a knockdown in NCC's. Toevoeging van exogene rWnt5a is voldoende om dit migratietekort in myoblasten te redden. (C) Kwantificering van het gemiddelde myoblast-herbevolkte gebied op 10 h na het ontstaan van wond (foutbalken tonen standaarddeviatie). (D) Phalloidinekleuring van myoblasten aan de wondrand 10 uur na wondgeneratie. Onderbroken rechthoeken tonen met falloidine bevlekte myoblasten aan het migratiefront. Voor elke in C gekwantificeerde experimentele toestand werden in totaal n = 3 monsters gebruikt. Schaalstaven = 200 μm (voor B en D). Afkortingen: NCC's = neurale crest cellen; siRNA = klein interfererend RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Wnt5a-signalen via ROR2-receptoren in myoblasten om migratie te stimuleren. (A) Relatieve mRNA-expressie van ROR2 om siRNA-gemedieerde knockdown in C2C12-cellen te valideren. (B) Knockdown van ROR2 in myoblasten vermindert hun migratiecapaciteit ondanks de aanwezigheid van NCC's. Exogene rWnt5a slaagt er niet in om myoblastmigratie te redden na ROR2 knockdown. (C) Kwantificering van het gemiddelde myoblast-herbevolkte gebied op 10 h na het ontstaan van wond (foutbalken tonen standaarddeviatie). (D) Phalloidinekleuring van myoblasten aan de wondrand 10 uur na wondgeneratie. Onderbroken rechthoeken tonen met falloidine bevlekte myoblasten aan het migratiefront. Voor elke in C gekwantificeerde experimentele toestand werden in totaal n = 3 monsters gebruikt. Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: NCC's = neurale crest cellen; siRNA = klein interfererend RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Dosisafhankelijke analyse voor recombinante Wnt5a-suppletie. Dosisafhankelijke analyse voor recombinant Wnt5a-suppletietests 0 ng / ml, 100 ng / ml en 500 ng / ml vonden 500 ng / ml exogene rWnt5a de optimale concentratie om myoblastmigratie en phalloidine cytoarchitecturale veranderingen tijdens een migratieperiode van 12 uur in vitro te stimuleren. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Representatieve afbeeldingen van putinzetstukken. Brightfield-beelden van putinzetstukken met O9-1 neurale crest-cellen behandeld met (A) 50 nM negatieve controle siRNA en (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Schaalstaven = 200 μm. Afkorting: siRNA = klein interfererend RNA. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Representatieve beelden van Wnt5a-eiwitexpressie in O9-1-cellen na siRNA-gemedieerde Wnt5a-knockdown. Immunofluorescentiekleuring van Wnt5a-eiwit in celkweekputten met O9-1 neurale crestcellen behandeld met (A) 50 nM negatieve controle siRNA en (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Schaalstaven = 20 μM. Afkortingen: siRNA = klein storend RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De niet-canonische Wnt/planaire celpolariteit (PCP) signaleringsroute is een uiterst belangrijke cellulaire signaleringsroute die betrokken is bij meervoudige ontwikkelingsprocessen24,25 en ziekteprocessen24,26. Tijdens de embryonale ontwikkeling omvat niet-canonische Wnt-signalering een uitgebreid netwerk van moleculaire signalen van signaalzendende cellen die uiteindelijk veranderingen in morfologie, asymmetrische organisatie en directionele migratie in signaalontvangende cellen induceren11. Eerdere studies hebben aangetoond dat de specifieke ligandreceptorroutes die deze signalering aansturen divers zijn, contextafhankelijk en vaak variëren tussen celtypen 12,13,14,15. Vanwege deze moleculaire complexiteit is het vermogen om paracriene niet-canonische Wnt-signaleringsinteracties te beoordelen met behulp van conventionele genetische recombinatiemethoden in vivo beperkt. Hoewel in vitro systemen in toenemende mate worden gebruikt als een alternatieve benadering om niet-canonische Wnt cellulaire fenotypen te bestuderen, richten beschikbare protocollen zich uitsluitend op downstream signaalontvangstaspecten van de route en slagen ze er niet in om de intercellulaire en paracriene aard van deze signaleringsgebeurtenissen voldoende te modelleren. Daarom was het doel van deze studie om een protocol te ontwikkelen voor een contactloos cocultuursysteem dat paracriene Wnt-interacties in vitro samenvat. De focus van dit protocol lag op het modelleren van twee karakteristieke aspecten van functionele niet-canonische Wnt-signalering in vitro, waaronder de organisatie van intracellulaire filamenteiwitten en gepolariseerde migratiecapaciteit.
Als proof of concept werd dit protocol toegepast om paracriene mechanismen te bestuderen in de context van de ontwikkeling van het hart. Tijdens cardiogenese zijn wederzijdse signaleringsgebeurtenissen tussen cardiale NCC's en SHF-voorlopercellen cruciaal voor de juiste rijping van het hartuitstroomkanaal (OFT)27,28,29. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat tijdens de cardiale ontwikkeling van muizen NCC-gemedieerde Wnt/PCP-signalering in faryngeale SHF-cellen vereist is voor shf-voorlopercelincorporatie in de zich ontwikkelende OFT en voor normale OFT-uitlijning21. Schleiffarth et al. en anderen hebben aangetoond dat genetische knock-out van het gen dat codeert voor het Wnt / PCP-ligand, Wnt5, de organisatie en migratiecapaciteit van SHF-voorlopercellen verstoort, wat resulteert in een verkorte en verkeerd uitgelijnde cardiale OFT 22,23,30. Met gevestigde muizen-NCC (O9-1)31- en myoblast (C2C12)-cellijnen toont dit protocol aan dat cocultuur met NCC's geassocieerd is met verhoogde falloïdine-positieve cytoplasmatische filopodie en lamellipodie en verbetert de migratiecapaciteit van myoblasten in een wondgenezingstest. Deze moleculaire en functionele eindpunten in vitro bouwen voort op eerder gepubliceerde protocollen voor NCC-manipulatie31 en modelleren nauw de in vivo fenotypische veranderingen beschreven in Wnt5a global knockout muizen, waarbij het nut van dit model wordt gevalideerd.
Om de specifieke moleculaire route te bepalen die niet-canonische Wnt-signalering tussen NCC's en myoblasten aandrijft, werden parallelle celspecifieke knockdown-experimenten uitgevoerd voor de genen die coderen voor het kandidaat-ligand, Wnt5a, in NCC's en de bijbehorende receptor, ROR2, in myoblasten. Zoals verwacht verstoorde knockdown van moleculen in zowel signaal-zendende (Wnt5a in NCC's) als signaal-ontvangende (ROR2 in myoblasten) cellen onafhankelijk Wnt / PCP-gerelateerde actine cytoarchitecturale veranderingen en remde myoblastmigratie. Belangrijk is dat fenotypische redding met recombinant Wnt5a alleen werd waargenomen in de NCC-Wnt5a knockdown-toestand, die een mechanisme ondersteunt waarbij NCC-afgeleide Wnt5a PCP-signalering in myoblasten activeert via ROR2-receptoren. Deze resultaten komen overeen met gegevens uit genetische studies bij muizen die de Wnt5a-ROR2-as identificeren als een cruciale Wnt/PCP-signaleringsas tussen NCC's en SHF-cellen tijdens de embryonale hartontwikkeling 3,21. Hoewel niet experimenteel getest in dit protocol, blijft het onduidelijk of SHF-afgeleide Wnt5a wederzijdse paracriene signalen levert aan de neurale top via ROR2-receptoren. Deze hypothese kan met behulp van dit protocol worden getest door de experimenten met C2C12-cellen aan de bovenkant en O9-1-cellen aan de onderkant van de putinzetconstructie te herhalen. Als SHF-afgeleide Wnt5a een reciproqueen paracrien signaal levert via NCC-ROR2, dan zou men verwachten dat de knockdown van Wnt5a in C2C12-cellen de migratiecapaciteit en actinepolymerisatie van de onderliggende O9-1-cellen remt.
Er zijn verschillende unieke sterke punten van dit protocol. Ten eerste is het een contactloos putinzetsysteem dat het sequentiële gebruik van wondgenezingstests en immunostainingtechnieken omvat om functionele en moleculaire Wnt / PCP-kenmerken in dezelfde populatie van signaalontvangende cellen te evalueren. Dit biedt niet alleen een robuuste benadering van fenotypering van niet-canonische Wnt-geïnduceerde intracellulaire filamentorganisatie en gepolariseerde migratieveranderingen in vitro , maar maakt ook meer granulaire beoordelingen van signaaltransductiemechanismen mogelijk. Hoewel dit protocol een bewijs van principe biedt met betrekking tot Wnt5a-ROR2-moleculen, leent het model zich ook gemakkelijk voor het evalueren van de effecten van andere liganden en receptoren in de niet-canonische Wnt-signaleringsroute. Men kan het immunostainingprotocol verder aanpassen om de expressie van meerdere potentiële downstream-effectoreiwitten (bijv. RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) te evalueren waarvan is aangetoond dat ze niet-canonische Wnt-signalen in vivo transduceren. Bovendien kunnen eiwitniveaus van deze verschillende effectormoleculen worden gecorreleerd met migrerende of actinecytoarchitectuurfenotypen. Ten tweede maakt het contactloze karakter van het cocultuursysteem de onafhankelijke manipulatie mogelijk van specifieke signaal-zendende versus signaal-ontvangende moleculen in de Wnt / PCP-route. In deze representatieve resultaten werd gekozen om celspecifieke siRNA-knockdown uit te voeren. Dit protocol is echter ook vatbaar voor het gebruik van farmacologische remmers of genetisch gemodificeerde cellijnen om kandidaat-ligandreceptorroutes voor klinische toepassing te evalueren. Evenzo kan men fenotypische reddingsexperimenten uitvoeren door moleculaire of farmacologische verbindingen toe te voegen aan het cocultuurmedium, zoals werd aangetoond met recombinant Wnt5a. Door deze verbindingen te richten op het selectief redden van signaal-verzendende versus signaal-ontvangende derangementen, worden paracriene mechanistische paden verder gevalideerd op manieren die niet zijn toegestaan met behulp van de huidige in vivo modelsystemen.
Er zijn veel kritieke stappen van dit protocol. Ten eerste is het belangrijk om ervoor te zorgen dat primaire cellen worden uitgebreid en op de juiste samenvloeiing worden gehouden gedurende het hele protocol. Als C2C12-myoblasten zich mogen vermenigvuldigen tot 100% samenvloeiing, zullen ze beginnen te fuseren en differentiëren van myoblasten in myobuizen. Daarom moeten deze cellen worden doorgegeven met de juiste dichtheid zoals beschreven. Ten tweede, gezien het feit dat STO-feedercellen nodig zijn om geconditioneerd medium te genereren om O9-1-cellen te laten groeien, is het noodzakelijk dat men STO-cellen op de juiste manier inactiveert met mitomycine C en voldoende (ten minste 500 ml) O9-1-groeimedium maakt met behulp van geïnactiveerde STO-cellen voordat O9-1-cellen worden ontdooid en platgelegd. Misschien wel de meest kritische stap in dit protocol is het genereren van geschikte krassen met uniforme geometrie en breedte in de myoblast monolaag 32,33. Stap 3.1.4 beschrijft verschillende tips voor het optimaliseren van dit deel van het protocol. Ondanks deze aanbevelingen moet worden erkend dat de variabiliteit die gepaard gaat met standaard 2D-krastests een technische uitdaging en een beperking van dit protocol blijft. Daarom is het noodzakelijk om meerdere technische replica's van elke experimentele toestand te hebben.
Ten slotte, hoewel de hier gepresenteerde resultaten werden gegenereerd met behulp van muizen-NCC's en myoblasten, kan dit protocol in principe worden aangepast om elke signaal-verzendende en signaal-ontvangende cel van belang te omvatten. Als gevolg hiervan heeft dit systeem niet alleen toepassingen voor het bevorderen van basismechanismen van paracriene niet-canonische Wnt-signalering in verschillende ontwikkelingscontexten, maar kan het ook worden gebruikt om therapeutische mechanismen voor Wnt / PCP-gerelateerde ziekteprocessen te testen. Voorbeelden hiervan zijn farmacologische screening op geneesmiddelen die de door Wnt/PCP geïnduceerde migratiecapaciteit van kwaadaardige cellen remmen of de directionele migratie herstellen van van de patiënt afgeleide terminale celtypen met een defecte PCP-signaleringscapaciteit bij baseline. Naast de niet-canonische Wnt-signaleringsroute kan dit protocol ook worden aangepast om andere paracriene signaleringsmechanismen en -routes tussen twee celtypen te bestuderen. SiRNA-gemedieerde knockdown van bekende secretoire moleculen in andere routes (bijv. Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) in O9-1-cellen kan bijvoorbeeld worden gekoppeld aan immunostaining van proliferatieve, differentiatie- of apoptotische markers in onderliggende myoblasten.
Concluderend stelt dit protocol een nieuw en zeer handelbaar experimenteel protocol vast om mechanismen van niet-canonische Wnt-gerelateerde intracellulaire filamentorganisatie en gepolariseerde migratie in vitro te bestuderen. De hier beschreven methoden verbeteren bestaande technieken door de intercellulaire en paracriene aard van Wnt-interacties te behouden en maken de onafhankelijke beoordeling van signaal-verzendende versus signaal-ontvangende componenten van deze route mogelijk. Dit protocol kan breed worden toegepast om basale paracriene Wnt/PCP-signaleringsmechanismen tussen twee celtypen te onderzoeken en te screenen op nieuwe therapeutische verbindingen gericht op Wnt/PCP-gerelateerde ziekteprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F30HL154324 aan O.T. en K08HL121191 en R03HL154301 aan S.R.K. De auteurs willen graag erkennen dat het schema in figuur 1 in dit manuscript is gemaakt met biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al.
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al.
