模拟旁分泌非经典Wnt信号通路 体外

摘要

本研究概述了一种高度可重复且易于操作的方法，用于在体外研究旁分泌非经典Wnt信号事件。in vitro。该方案已应用于评估旁分泌Wnt5a信号对小鼠神经嵴细胞和成肌细胞的影响。

摘要

非经典Wnt信号通路在胚胎发生过程中调控细胞内肌动蛋白丝的组装以及前体细胞的极化迁移。该过程需要信号发出细胞与信号接收细胞之间复杂而协调的旁分泌相互作用。鉴于这些相互作用可发生于来自不同谱系的多种类型细胞之间， 体内 评估细胞特异性缺陷可能具有挑战性。本研究描述了一种高度可重复的方法，用于评估旁分泌非经典Wnt信号通路 体外 本方案设计旨在实现以下目标：（1）对任意两种目标细胞之间的非经典Wnt信号通路进行功能与分子水平的评估；（2）解析非经典Wnt信号通路中信号发送分子与信号接收分子各自的作用；（3）采用常规分子生物学或药理学方法开展表型挽救实验。

本方案用于评估神经嵴细胞（NCC）介导的成肌细胞非经典Wnt信号通路。成肌细胞中存在神经嵴细胞与肌动蛋白丝（phalloidin阳性）胞质丝状伪足和片状伪足数量增加相关，并可改善划痕愈合实验中成肌细胞的迁移能力。 Wnt5a-ROR2 轴被确定为神经嵴细胞（NCC）与第二心区（SHF）心肌母细胞前体之间关键的非经典Wnt信号通路。总之，这是一种高度可行的方案，可用于研究旁分泌型非经典Wnt信号机制 体外.

引言

非经典Wnt信号通路是一种在进化上保守的通路，可调控细胞丝状结构的组织及定向迁移。该通路参与多种生物学过程，包括胚胎组织形态发生^1,2,3淋巴管和血管生成^4,5,6,7，以及癌症生长和转移^8,9,10在细胞水平上，非经典Wnt信号通路通过信号发送细胞与信号接收细胞之间协调的旁分泌相互作用来实现。这些相互作用常发生在不同谱系或类型的细胞之间，涉及一个复杂的分子网络，其中包括多达19种配体以及多种受体、共受体和下游信号转导效应分子。¹¹此外，先前的研究表明，配体-受体组合可因不同环境和组织而异，使该信号传导过程更加复杂^12,13，且在信号接收细胞中驱....

方案

1. 实验前细胞的扩增与传代

1. C2C12 细胞培养
   1. 通过将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）与10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素混合，制备500 mL C2C12细胞培养基。
   2. 在37 °C水浴中解冻一管C2C12细胞。细胞解冻的同时，在15 mL离心管中加入5 mL C2C12培养基。使用P1000移液器立即将解冻的细胞转移至15 mL离心管中。
      注意：C2C12 细胞是小鼠成肌细胞，既往已被使用并验证为模拟心肌母细胞前体的主要细胞系。
   3. 使用移液管轻轻混匀锥形管中的C2C12细胞。然后，将解冻的C2C12细胞完全转移至6 mL C2C12培养基中，并接种于75 cm²培养瓶中。² 烧瓶
   4. 向烧瓶中加入 6 mL 新鲜 C2C12 培养基，终体积为 12 mL。轻轻旋转烧瓶，使细胞与培养基溶液覆盖烧瓶底部的整个表面。将烧瓶置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中。₂) 以使细胞贴壁。
   5. 在培养箱中培养细胞，直至其融合度达到约60%。
      注意：可通过定期将细胞从培养箱中取出，并在显微镜下快速检查其汇合度来确定。务必尽量减少细胞离开培养箱的时间。
2. C2C12细胞传代
   1. 将C2C12培养基、500 mL 1x PBS和0.....

结果

神经嵴细胞对小鼠成肌细胞迁移能力的影响
本实验首先用于评估神经嵴细胞（NCCs）对成肌细胞迁移能力的影响。图1展示了该实验的示意图。为检测这一影响，对单独培养（无NCC插入物）的成肌细胞与共培养（含NCC插入物）的成肌细胞分别进行了划痕实验。作为阳性对照，在含有NCC插入物的培养室中加入500 ng/mL重组Wnt5a（rWnt5a）。该rWnt5a浓度是通过在C2C12细胞中进行剂量-反应分析确定的（补充图S1）。补充图S2展示了NCC插入物的代表性图像，表明在此时间点NCCs状态良好。免疫荧光结果显示，在使用50 nM Wnt5a siRNA孵育后，Wnt5a蛋白水平显著降低（补充图S3）。经过9小时的迁移后发现，与未添加NCC插入物的成肌细胞相比，NCC的存在显著提高了成肌细胞的迁移能力（伤口再填充面积分别为72.6%和59.1%，p = 0.033）。在共培养孔中添加rWnt5a可进一步加速成肌细胞迁移，部分伤.......

讨论

非经典Wnt/平面细胞极性（PCP）信号通路是一种至关重要的细胞信号通路，已被证实参与多种发育过程^24,25 和疾病过程^24,26在胚胎发育过程中，非经典 Wnt 信号传导涉及来自信号发送细胞的庞大分子信号网络，最终诱导信号接收细胞在形态、不对称结构和定向迁移方面发生改变¹¹先前的研究表明，驱动该信号传导的特异性配体-受体通路具有多样性，依赖于具体环境，并且常因细胞类型不同而有所差异。^12,13,14,15由于这种分子复杂性，评估旁分泌非经典通路的能力 Wnt 使用传统.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M-7522
含DAPI的抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200-10	4 ℃下保存 °C
牛血清白蛋白	Santa Cruz Biotechnology	sc-2323	4 ℃ 保存 °C
C2C12 小鼠成肌细胞系	ATCC	CRL-1772
细胞培养瓶，75 cm²2	赛默飞世尔科技	156499
4孔板式培养皿系统	赛默飞世尔科技	154526
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM高糖培养基（4.5 g/L），含L-谷氨酰胺（2 mM）	康宁	10-017-CV	4°C 下保存 °C
Falcon 锥形离心管，15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
24孔板用Falcon可渗透支持膜，孔径0.4 µM 透明 PET 膜	康宁	353095
胎牛血清	Fisher Scientific	W3381E	-20℃下分装保存于50 mL等份中 °C
0.1% 明胶溶液	ATCC	PCS-999-027	4°C 下保存 °C
10 个带刻度的无菌移液器吸头 µL	USA Scientific	1111-3810
白血病抑制因子（LIF），106 单位/毫升	默克生命科学	ESG1106
L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液)	Gibco	25030-081
Lipofectamine RNAiMAX	赛默飞世尔科技	13778-075
MEM非必需氨基酸（MEM NEAA）100×	Gibco	11140-050
最低必需培养基（MEM）	康宁	10-022-CV
丝裂霉素C	罗氏	10107409001
防粘连自动盖玻片，24 x 55 mm	Springside Scientific	HRTCG2455
O9-1 神经嵴细胞系	默克生命科学	SCC049
Opti-MEM I, 1x	Gibco	31985-070
PBS 中的 4% 多聚甲醛溶液	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	4 ℃下保存 °C
青霉素-链霉素（10,000 U/mL 青霉素和 10,000 μg/mL 链霉素）	Fisher Scientific	W3470H	-20℃下以10 mL等分试样保存 °C
鬼笔环肽-iFluor 488	Abcam	ab176753	储存于 -20 °C，避光
磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4	康宁	21-040-CV	4°C 下保存 °C
重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGF-basic）	R&D Systems	233-FB-025
重组人/小鼠 Wnt5a 蛋白	R&D Systems	645-WN-010
丙酮酸钠，100 mM	Gibco	11360-070
带网格的方形培养皿	托马斯科学公司	1219C98
STO 小鼠成纤维细胞饲养层细胞	ATCC	CRL-1503
Triton X-100 溶液	Sigma Aldrich	X100-100ML
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	W3513C	4 ℃下保存 °C
蔡司 Apotome.2 荧光显微镜	卡尔·蔡司股份公司
蔡司倒置 Axio Vert.A1 光学显微镜	卡尔·蔡司股份公司
Zen lite 2012 显微镜软件	卡尔·蔡司股份公司		成像软件