Summary
本研究概述了一种高度可重复和易于处理的体外研究旁分泌非典型Wnt信号事件的方法 。 该协议用于评估旁分泌Wnt5a信号传导对小鼠神经嵴细胞和成肌细胞的影响。
Abstract
非规范Wnt信号调节胚胎发生过程中细胞内肌动蛋白丝组织和祖细胞的极化迁移。这个过程需要信号发送和信号接收细胞之间复杂而协调的旁分泌相互作用。鉴于这些相互作用可能发生在不同谱系的各种类型的细胞之间，细胞特异性缺陷的 体内 评估可能具有挑战性。本研究描述了一种高度可重复的体外评估旁分泌非典型Wnt信号传导 的方法。 该协议的设计能够（1）对任何两种感兴趣的细胞类型之间的非规范Wnt信号传导进行功能和分子评估;（2）剖析信号发送分子与信号接收分子在非规范Wnt信号通路中的作用;（3）使用标准分子或药理学方法进行表型挽救实验。
该协议用于评估成肌细胞中神经嵴细胞（NCC）介导的非规范Wnt信号传导。NCC 的存在与成肌细胞中鬼笔环肽阳性细胞丝状伪足和板状伪足的数量增加以及伤口愈合测定中肌母细胞迁移的改善有关。 Wnt5a-ROR2 轴被确定为NCC和第二心野（SHF）心肌母细胞祖细胞之间关键的非规范Wnt信号通路。总之，这是一个高度易于处理的方案，用于研究 体外旁分泌非规范Wnt信号传导机制。
Introduction
非规范Wnt信号传导是一种进化保守的途径，可调节细胞丝组织和定向迁移。该途径与多种生物学过程有关，包括胚胎组织形态发生1，2，3，淋巴和血管生成4，5，6，7以及癌症生长和转移8，9，10.在细胞水平上，非规范的Wnt信号是通过信号发送和信号接收细胞之间的协调旁分泌相互作用进行的。这些相互作用经常发生在不同谱系或类型的细胞之间，并涉及多种分子网络，包括多达19个配体和多个受体，共受体和下游信号转导效应子11。使这种信号传导过程进一步复杂化的是，先前的研究表明，配体-受体组合可以以上下文和组织依赖性的方式变化12，13，并且驱动信号接收细胞中非规范Wnt信号传导的相同源配体可以由多种信号发送细胞类型产生14，15.鉴于与非规范Wnt信号传导相关的细胞和分子复杂性，研究体内个体和临床相关机制的能力受到限制。
已经尝试使用体外细胞培养技术研究非规范的Wnt信号传导。例如，在细胞单层中进行的伤口愈合测定已被用于功能评估细胞定向迁移4，16，17，18，19。免疫染色技术已被用于对表面蛋白表达进行空间分析，以评估非规范Wnt诱导的细胞形态变化7，10，结构和不对称极化18，19，20。 尽管这些方法为表征信号接收细胞中的Wnt相关表型提供了重要工具，但这些协议中缺乏信号发送组件限制了它们准确模拟体内观察到的旁分泌信号机制的能力。因此，仍然迫切需要开发体外系统，该系统允许对非规范Wnt途径的信号发送和接收细胞之间的旁分泌信号传导相互作用进行稳健和可重复的评估，特别是不同细胞类型的细胞。
为此，本研究的主要目的是建立一种方案来模拟体外旁分泌非规范Wnt信号相互作用。我们开发了一种非接触式共培养系统，该系统概括了这些相互作用的信号发送和信号接收成分，并允许使用标准的分子、遗传或药理学方法来独立研究非规范 Wnt 途径中的特定配体受体机制。使用已建立的鼠细胞系在成肌细胞中检查NCC介导的Wnt信号传导的机制。作为原理证明，该模型用于证实先前小鼠体内研究的结果，这些研究涉及Wnt5a-ROR2轴是NCC 21和SHF心肌母细胞祖细胞3，22，23之间的相关非规范Wnt信号通路。
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Protocol
1. 细胞的实验前扩增和传代
- C2C12细胞培养：
- 将 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 与 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素混合，制备 500 mL C2C12 培养基。
- 在37°C水浴中解冻一小瓶C2C12细胞。当 C2C12 细胞解冻时，将 5 mL C2C12 培养基加入 15 mL 锥形管中。立即使用 P1000 移液器将解冻的细胞转移到 15 mL 管中。
注意：C2C12细胞是鼠肌母细胞，以前已被使用并验证为模拟心肌母细胞祖细胞的原代细胞系。 - 使用血清移液管在锥形管中轻轻混合C2C12细胞。然后，将C2C12培养基（6mL）中解冻细胞的全部体积加入75cm2 烧瓶中。
- 向烧瓶中加入 6 mL 新鲜 C2C12 培养基，总体积为 12 mL。轻轻旋转烧瓶，使细胞和培养基溶液覆盖烧瓶的整个底部。将烧瓶置于细胞培养箱（37°C，5%CO2）中以使细胞粘附。
- 让细胞在培养箱中扩增，直到它们达到~60%汇合度。
注意：这可以通过定期从培养箱中取出细胞并在显微镜下快速检查其汇合度来确定。确保尽量减少从培养箱中取出细胞的时间。
- 传代C2C12细胞：
- 在37°C水浴中加热C2C12培养基，500mL的1x PBS和0.25%胰蛋白酶-EDTA。试剂加热后，将所有试剂转移到细胞培养罩中。
- 将装有C2C12细胞的烧瓶带入细胞培养罩中。用温热的1x PBS轻轻冲洗含有C2C12细胞的烧瓶两次。
- 将烧瓶倾斜45°角，并用连接到真空抽吸的玻璃移液管吸出C2C12介质。在保持 45° 角的同时，使用血清移液管小心地将 10 mL 温热的 1x PBS 添加到烧瓶的一角。将烧瓶平放在表面上，并以圆周运动轻轻移动烧瓶，以确保 1x PBS 冲洗整个单层细胞。
注意：吸气介质时注意不要破坏C2C12单层。
- 将烧瓶倾斜45°角，并用连接到真空抽吸的玻璃移液管吸出C2C12介质。在保持 45° 角的同时，使用血清移液管小心地将 10 mL 温热的 1x PBS 添加到烧瓶的一角。将烧瓶平放在表面上，并以圆周运动轻轻移动烧瓶，以确保 1x PBS 冲洗整个单层细胞。
- 第二次洗涤后取出 1x PBS。向烧瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，如上所述轻轻移动烧瓶，使胰蛋白酶-EDTA 溶液尽可能多地散布在单层上，并将烧瓶放入培养箱中 2 分钟。
- 孵育2分钟后，从培养箱中取出烧瓶并轻轻敲击以分离任何剩余的细胞。
- 用血清移液管向烧瓶中加入 9 mL C2C12 培养基以淬灭胰蛋白酶。使用血清移液器，用培养基轻轻冲洗细胞并收集10mL胰蛋白酶化细胞悬液。将 10 mL 细胞悬液加入新鲜的 15 mL 锥形管中，并以 100 × g 离心 5 分钟。
- 将锥形管返回到细胞培养罩中，并用连接到真空抽吸的玻璃移液管除去上清液。吸出上清液时，注意不要破坏锥形管底部的细胞沉淀。为此，将~0.2mL的上清液留在锥形管中。将细胞重悬于 10 mL 新鲜 C2C12 培养基中。
- 对于额外的传代，将 1 mL 重悬的细胞加入 75 cm2 烧瓶中。用血清移液管向烧瓶中加入 11 mL C2C12 培养基，并将烧瓶放入培养箱中。
- STO细胞培养：
- 通过用 7% FBS、1% 青霉素/链霉素和 2 nM L-谷氨酰胺制备 500 mL DMEM 来制备 STO 培养基。
- 通过将 0.5 g 明胶粉添加到装有 500 mL 组织级或高压灭菌水的瓶子中来制备 0.1% 明胶。将 7 mL 的 0.1% 明胶溶液加入 75 cm2 烧瓶中。旋转烧瓶，使明胶溶液覆盖烧瓶的整个底部。让烧瓶在室温下在细胞培养罩中孵育30分钟。
- 孵育30分钟后，使用连接到真空抽吸的移液管除去多余的明胶。使用前让烧瓶在培养箱中再停留30分钟。
- 在37°C水浴中解冻一瓶STO细胞。使用 P1000 移液器，立即将解冻的细胞转移到含有 5 mL 新鲜制备的 STO 培养基的 15 mL 锥形管中。
注意：STO细胞是小鼠胚胎成纤维细胞，常规用作细胞培养方案中的饲养细胞。 - 使用血清移液管轻轻混合锥形管中的细胞。将整个体积（6 mL）的细胞加入涂有明胶的75 cm2 烧瓶中。旋转烧瓶以确保细胞悬液沿烧瓶底部均匀分布。
- 向烧瓶中加入 6 mL 新鲜 STO 培养基，总体积为 12 mL。如上所述旋转烧瓶，以确保细胞和培养基沿着烧瓶底部均匀分布。将烧瓶置于37°C培养箱中以使细胞粘附。让细胞在培养箱中增殖，直到它们达到~60-70%汇合度。
- 传代STO细胞：
- 在37°C水浴中温热STO细胞培养基，1xPBS和0.25%胰蛋白酶-EDTA。
- 按照步骤1.2.2.1中所述，用温热的1x PBS轻轻冲洗含有STO细胞的烧瓶两次。
- 使用 P1000 移液器向烧瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。将烧瓶置于37°C培养箱中5分钟。
- 孵育5分钟后，从培养箱中取出烧瓶。轻轻敲击烧瓶以分离任何贴壁细胞。
- 向烧瓶中加入9mLSTO培养基以淬灭胰蛋白酶并如上所述收集10mL胰蛋白酶化的细胞悬液。将 10 mL 细胞悬液加入 15 mL 锥形管中，并以 100 × g 离心 5 分钟。
- 如上所述，除去上清液并将细胞重悬于10mL STO培养基中。对于额外的传代，将 1 mL 重悬的细胞加入 75 cm2 烧瓶中。加入 11 mL STO 培养基，旋转烧瓶以确保细胞和培养基沿烧瓶底部均匀分布，然后将烧瓶放入培养箱中。
- 非活性STO细胞培养和O9-1细胞基础培养基制备：
- 通过将 500 mL DMEM 与 15% FBS、1% 青霉素/链霉素、2 nM L-谷氨酰胺、0.1 mM 最小非必需氨基酸、1 nM 丙酮酸钠和 55 μM β-巯基乙醇混合来制备 O9-1 细胞基础培养基。
- 通过将 4 mL 的 1x PBS 直接添加到丝裂霉素 C 小瓶中，在 1x PBS 中以 0.5 mg/mL 的浓度制备丝裂霉素 C 溶液。用P1000移液器多次移液。为了进一步将丝裂霉素C溶解在1x PBS中，将小瓶放在涡旋混合器或台式摇杆上45分钟至1小时。
- 通过将终浓度为 0.01 mg/mL 的丝裂霉素 C 添加到标准 STO 培养基中处理 STO 板来灭活 STO 细胞。将STO板置于培养箱内2小时，注意通过尽量减少在培养箱外花费的时间来保护含有丝裂霉素C的烧瓶免受光照。丝裂霉素处理后，按照步骤1.2.2.1中所述在1x PBS中洗涤细胞两次。
注意：丝裂霉素C抑制STO细胞的增殖，因此它们可用于在几天内产生条件培养基，而不会在烧瓶中过度融合。 - 去除 1x PBS 后，将 12 mL O9-1 基础培养基加入灭活的 STO 细胞培养物中并孵育 24 小时。收集经过调理、灭活的 STO + O9-1 基础培养基，并将其置于用箔纸包裹的 50 mL 锥形管中以保护其免受光照。
- 如上所述，将 12 mL 新鲜 O9-1 基础培养基加入灭活的 STO 细胞培养物中。通过每24小时向含有灭活STO细胞的相同侧腹添加新鲜的O 9-1基础培养基来重复此步骤。
注意：丝裂霉素C处理后，失活的STO细胞不能增殖;因此，含有灭活STO细胞的烧瓶可以重复使用以产生条件培养基。 - 将装有条件，灭活的STO + O9-1基础培养基的箔纸包裹的50 mL锥形管储存在4°C，直到总共收集了500 mL培养基。
- O9-1细胞培养：
- 使用 500 mL 条件 STO + O9-1 基础培养基制备 O9-1 细胞生长培养基，并加入 103 单位白血病抑制因子 （LIF） 和 25 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （碱性FGF）。
- 如步骤1.3.2-1.3.3所述制备0.1%明胶包衣烧瓶。
- 在37°C水浴中解冻一瓶O9-1细胞。立即将解冻的细胞转移到含有 5 mL 新鲜制备的 O9-1 生长培养基的 15 mL 锥形管中。
注意：O9-1细胞系是从小鼠产生的唯一稳定的多能神经嵴细胞系。该细胞系通常用于 神经嵴体外 实验。 - 使用血清移液管轻轻混合细胞。将整个 6 mL 细胞加入涂有明胶的 75 cm2 烧瓶中。
- 向烧瓶中加入 6 mL O9-1 生长培养基，总体积为 12 mL。将烧瓶置于37°C培养箱中以使细胞粘附。让细胞在培养箱中增殖，直到它们达到~60-70%汇合度。
- 传代O9-1细胞：
- 在37°C水浴中温热的O 9-1生长培养基，1x PBS和0.25%胰蛋白酶-EDTA。
- 按照步骤1.2.2.1中所述，用温热的1x PBS轻轻冲洗含有O9-1细胞的板两次。
- 向烧瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，并将其置于37°C培养箱中5分钟。
- 孵育5分钟后，从培养箱中取出烧瓶并轻轻敲击烧瓶以分离任何贴壁细胞。
- 向烧瓶中加入 9 mL O9-1 生长培养基以淬灭胰蛋白酶。收集 10 mL 胰蛋白酶化细胞悬液，并将 10 mL 该细胞悬液加入 15 mL 锥形管中。将试管以100 ×g 离心5分钟。
- 除去上清液并将细胞重悬于10mL的O9-1生长培养基中。对于额外的传代，将 1 mL 重悬的细胞加入 75 cm2 烧瓶中。加入11mL的O9-1生长培养基，并将装有细胞的烧瓶置于37°C培养箱中的12mL培养基中。
2. 共培养系统中的电镀细胞
- 电镀C2C12电池室：
- 胰蛋白酶消化后（如步骤1.2中所述），将C2C12细胞沉淀重悬于10mL的C2C12培养基中。通过去除 0.5 mL 重悬的 C2C12 细胞并将其添加到含有 9.5 mL 新鲜 C2C12 培养基的新 15 mL 锥形管中，在 C2C12 培养基中以 1：20 的比例稀释细胞。用血清移液管轻轻混合悬浮液。
- 使用 P1000 移液管将 1 mL 的 1：20 稀释的 C2C12 细胞加入新的 4 室孔的每个孔中，并将 4 室孔放入培养箱中。
- 电镀O9-1电池插件：
- 胰蛋白酶消化后，将 O9-1 细胞沉淀重悬于 10 mL O9-1 生长培养基中。通过去除 0.5 mL 重悬的 C2C12 细胞并将其添加到含有 9.5 mL 新鲜 O9-1 生长培养基的新 15 mL 锥形管中，在 O9-1 生长培养基中以 1：20 的比例稀释细胞。用血清移液管轻轻混合悬浮液。
- 将单个渗透性插入物（参见 材料表）放入装有 1 mL O9-1 生长培养基的新 4 室孔的每个孔内。
注意：这个4室孔应与包含步骤2.1.3中的C2C12电池的孔不同。 - 使用 P1000 移液器向每个插入物中加入 300 μL 稀释的 O9-1 细胞悬液。确保每个插入物的底部浸没在装有 1.3 mL O9-1 生长培养基的孔中。将孔放入37°C培养箱中。
- （可选）。在O9-1细胞或C2C12细胞中进行siRNA敲低。
- 在接种O9-1细胞插入物或C2C12细胞室孔后18-24小时通过siRNA进行基因敲低。
- 根据制造商的建议和实验所需的浓度，在还原血清培养基（参见 材料表）中稀释siRNA和转染试剂。轻轻混合稀释的siRNA和转染试剂（1：1），并将混合物在室温下孵育7分钟。
注意：在该协议中，使用50 nM浓度，因为确定该siRNA浓度以导致靶基因表达的充分敲低。 - 根据实验设计将siRNA-脂质复合物添加到O9-1细胞插入物或C2C12细胞室孔中，并将细胞与siRNA-脂质复合物孵育~36-48小时。
- 根据制造商的建议和实验所需的浓度，在还原血清培养基（参见 材料表）中稀释siRNA和转染试剂。轻轻混合稀释的siRNA和转染试剂（1：1），并将混合物在室温下孵育7分钟。
- 在接种O9-1细胞插入物或C2C12细胞室孔后18-24小时通过siRNA进行基因敲低。
3.进行伤口测定并定量评估肌母细胞迁移
- 伤口测定：
- 在继续这部分协议之前，让O9-1细胞插入物和C2C12细胞室孔在培养箱中粘附和增殖，直到两个细胞达到~70-80%汇合度。如果细胞生长>90%汇合，请不要进行划痕测定，因为细胞只会从孔中分离。
- 将1x PBS和C2C12培养基放入37°C水浴中加热。
- 从C2C12室中取出上清液培养基，并用1x PBS洗涤细胞一次。取出 1x PBS，并立即用无菌 P10 移液器吸头刮擦细胞。
- 将无菌 P10 移液器吸头牢固地沿单个方向穿过，以跨越细胞单层的整个长度或宽度（例如，从右到左，从上到下）。确保只刮擦每个含有细胞的孔一次。
注意：为了优化刮擦结果，请在相似的汇合度水平下刮擦不同实验条件的刮擦孔。为此，请确保每个4室孔具有针对每个所需实验条件的细胞（例如，孔#1阴性对照，孔#2阳性对照）。此外，每次划痕使用新的无菌P10移液器，每次对移液器施加相似量的力。不要尝试在每个孔中产生多个划痕。 - 刮擦后，使用 P1000 移液器吸头快速将 1 mL 的 1x PBS 加回孔中。对每个将被划伤的孔重复此过程。
注意：鉴于与每个划痕相关的可变性，建议在每个实验条件下使用多个孔（n = 3）来创建伤口。迅速工作，因为在这些步骤中最大限度地减少细胞没有 1x PBS 的持续时间至关重要。从每个孔中取出 1x PBS 后，不应超过 5 秒在每个孔中产生伤口。
- 将无菌 P10 移液器吸头牢固地沿单个方向穿过，以跨越细胞单层的整个长度或宽度（例如，从右到左，从上到下）。确保只刮擦每个含有细胞的孔一次。
- 生成伤口并将1x PBS重新添加到每个孔中后，使用明场倒置显微镜对划痕进行成像，并使用此图像作为基线伤口大小（时间0）。要拍摄图像，请执行以下步骤：
- 按下电源按钮打开计算机和显微镜（请参阅 材料表）。将腔室载玻片放在载物台上，并将物镜刻度盘旋转至5倍放大倍率。
- 双击计算机桌面上的软件图标打开成像软件（请参阅 材料表）。单击软件主屏幕上的 相机 选项卡。单击 “实时 ”按钮以可视化 AxioCam IC 选项卡上的单元格。
- 确保将滤光片完全拉出，以使光线通过相机和计算机屏幕。手动移动和/或旋转腔室载玻片，将伤口区域定位在 AxioCam IC 选项卡上实时图像的中心。
- 要拍摄图像，请单击捕捉以打开包含图像的 AxioCam IC 选项卡旁边的新选项卡。
- 要保存此静止图像，请单击软件主页左上角的文件|另存为|在文件名框中输入文件名。将图形保存为卡尔蔡司图像（*.czi）格式（默认设置），并在左侧栏中选择桌面，将文件作为.czi文件保存到桌面，该文件只能在Zen lite 2012软件程序中打开。
- 若要将图片另存为.tiff，请单击“ 文件”|另存为| 然后在“文件名”框中输入 文件名 。将图形另存为标记图像文件 （*.tiff），方法是单击 保存类型 按钮并从下拉菜单中选择 *.tiff 。
注意：.tiff格式可以在任何图像处理软件中打开。 - 手动重新定位腔室载玻片，在同一孔中伤口的其他点再拍摄2-3张图像。
注意：总的来说，这将导致每个孔中伤口的3-4个非重叠，高放大倍率的图像。
- 从每个孔中取出 1x PBS，并加入 1 mL C2C12 培养基。
注意：在伤口产生后，在将溶液取出或添加到腔室孔中时，请注意不要过于积极地移液，因为这可能会导致细胞从腔室孔中分离。此外，倾斜腔室，以便在每个孔的角落进行抽吸和重新引入溶液，以最大限度地减少细胞单层破坏。 - 通过将含有O9-1细胞的插入物手动放置在室孔的每个孔中来组装孔插入共培养系统。轻轻地将插入物向下推入孔中，使插入物的底部位于下面的C2C12细胞上方。将孔插入构建物返回到培养箱。
注意：不要让插入物的底部物理接触并机械地破坏下面的C2C12电池。 - 让细胞迁移总共9-12小时。为了确定最佳迁移时间，请在伤口创建后6小时检查细胞，然后每2-3小时检查一次。当处于对照或阳性对照条件的细胞开始完全覆盖伤口时结束实验。
注意：鉴于构造的非接触性质，在检查间隔迁移进程时，不需要从孔中取出上覆的插入物。根据诸如该测定中使用的细胞类型，伤口生成时的细胞密度，产生的伤口宽度以及操纵细胞的实验条件（例如基因敲低，重组蛋白添加）等因素，将观察到迁移变异性。这些试剂的浓度应在制造商建议的指导下通过实验确定。
4. 迁移成肌细胞的免疫荧光染色和成像
- 终止迁移测定和解构孔插入系统：
- 在9-12小时迁移期（或实验条件指定的替代时间）后取出O9-1细胞插入物。使用 P1000 移液器小心吸出 C2C12 培养基。向腔室孔中加入 0.5 mL 的 1x PBS，并在迁移后拍摄细胞的最终图像。
- 小心地吸出所有 0.5 mL 的 1x PBS 与培养基混合，并使用试剂盒说明从腔室孔中取出塑料室，留下包含 C2C12 细胞的底层载玻片。
注意：移除腔室孔时，请注意不要破坏粘附在载玻片上的C2C12细胞。
- 进行免疫染色：
- 立即将载玻片放入含有4%多聚甲醛（PFA）的载玻片支架中，并在室温下孵育10分钟。倒出4%PFA，向载玻片架中加入含有0.1%Triton X-100的1x PBS（1x PBST），在室温下洗涤载玻片15分钟。倒出1x PBST并将1x PBS添加到载玻片架中，以在室温下洗涤载玻片10分钟。再次重复此步骤，总共两次 1x PBS 洗涤。
- 从载玻片架上取下载玻片。用疏水笔描摹载玻片的外边缘，在载玻片周围创建疏水边界，以防止溶液从载玻片溢出。注意不要破坏贴壁细胞。
- 向载玻片中加入 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 封闭溶液（用 1x PBS 稀释）（每张载玻片 ~0.5 mL）。确保溶液包含在步骤4.2.4中创建的疏水边界内。将载玻片在室温下在加湿的载玻片室中孵育1小时。
注意：尽管鬼笔环肽免疫染色不需要BSA阻断，但协议中的此步骤允许与荧光抗体染色偶联。 - 封闭1小时后，从载玻片中倒出封闭溶液，向载玻片中加入鬼笔环肽抗体（通过将5μL抗体添加到995μLBSA溶液中，在1%BSA封闭溶液中稀释至1：200）并在4°C孵育过夜。同样，确保溶液包含在步骤4.2.4中创建的疏水边界内。鉴于鬼笔环肽抗体与Alexa Fluor-488染料偶联，在添加到载玻片之前和之后尽量减少抗体试剂的光照。
- 第二天，将载玻片放在避光的载玻片支架中（例如，用箔纸包裹载玻片支架或使用非透明载玻片架）。在室温下用1x PBS洗涤载玻片支架中的细胞10分钟。重复洗涤，总共三次10分钟洗涤。
- 加入含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，并用玻璃盖玻片安装载玻片。使用标准荧光显微镜对迁移的细胞进行成像。
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Representative Results
NCC对鼠成肌细胞迁移能力的影响
该测定首先用于评估NCC对成肌细胞迁移能力的影响。 图1 概述了该测定的示意图模型。为了测试这种影响，使用单独生长的成肌细胞（没有NCC插入物）与在插入物存在下生长的成肌细胞进行了划痕测定。作为阳性对照，将500 ng/mL重组Wnt5a（rWnt5a）加入到带有NCC插入物的腔室孔中。rWnt5a的浓度是通过在C2C12细胞中进行的剂量反应分析确定的（补充图S1）。NCC插入物的代表性图像显示在 补充图S2中，表明NCC在这个时间点是健康的。免疫荧光显示，在与 50 nM 的 Wnt5a siRNA 孵育后， Wnt5a 在蛋白质水平上具有强大的敲低作用（补充图 S3）。在迁移9小时后，发现与在没有NCC插入物的情况下测定的成肌细胞相比，NCC的存在显着增加了成肌细胞的迁移能力（72.6%伤口再填充区域与59.1%伤口再填充区域，p = 0.033）。将rWnt5a添加到共培养孔中加速了肌母细胞迁移，一些伤口区域在9小时时间点显示出完全恢复，如图 2所示。正如预期的那样，所有三种条件下的迁移性成肌细胞都表现出正常的迁移细胞形态，包括形成良好和突出的丝状伪足和薄片伪足以及肌动蛋白细胞骨架突起的不对称极化（图2C）。
NCC衍生的Wnt5a对成肌细胞极化迁移的重要性
为了评估NCC衍生的Wnt5a对肌母细胞迁移的旁分泌作用，在NCCs中siRNA介导的Wnt5a敲低后，在成肌细胞中进行伤口愈合测定。首先，通过实时定量聚合酶链反应验证了NCC中的Wnt5a敲低效率。与阴性对照（加扰）siRNA相比，发现用50 nM siRNA处理Wnt5a可将Wnt5a基因表达降低64%（图3A）。使用该浓度，在组装共培养物之前48小时用对照siRNA或Wnt5a siRNA转染O9-1细胞插入物。C2C12细胞在正常条件下生长，并在适当的汇合处产生伤口。伤口生成后，立即向每个孔中加入阴性对照或Wnt5a敲低NCC插入物。迁移期10 h后，发现与对照NCCs测定的成肌细胞相比，NCC中Wnt5a的敲低显着降低了潜在的肌母细胞迁移能力（39.1%伤口再填充区域与74.8%伤口再填充区域，p < 0.001）。此外，在存在NCC的情况下敲低Wnt5a的成肌细胞通过免疫染色显示出异常的细胞形态，包括细胞质面积减少和肌动蛋白细胞骨架投影减少（图3D）。为了挽救肌母细胞迁移，将500 ng / mL的rWnt5a外源补充添加到含有Wnt5a敲低插入物的共培养孔中。发现添加外源性rWnt5a可以完全挽救在这些成肌细胞中观察到的迁移和形态缺陷（图3C，D）。
Wnt5a通过成肌细胞中的ROR2信号传导作为极化迁移的驱动因素
为了更好地了解该旁分泌模型中的信号接收细胞机制，在成肌细胞中的ROR2受体敲低后重复测定。在该实验中，在伤口产生前~40小时转染成肌细胞50nM的ROR2 siRNA，这足以将ROR2基因表达降低54%（图4A）。 在此期间，NCC插入物在正常条件下平行生长。在成肌细胞达到适当的汇合度后，进行划痕测定，并组装共培养孔插入物。在存在NCC插入片段的情况下迁移10小时后，与用阴性对照siRNA处理的成肌细胞相比，ROR2敲低成肌细胞表现出迁移能力降低（48.1%伤口再填充区域与75.7%伤口再填充区域，p = 0.019）（图4B，C）。添加 500 ng/mL rWnt5a 未能挽救 ROR2 敲低后的肌母细胞迁移能力，表明 ROR2 耗竭破坏了成肌细胞接收 Wnt5a 信号的能力（图 4B，C）。鬼笔环肽的免疫染色证实了迁移数据，并表明补充rWnt5a不能恢复ROR2敲低成肌细胞中鬼笔环肽阳性薄片和丝状伪足的减少（图4D）。
图1：测定的示意图模型。 步骤1包括使用STO饲养层细胞对C2C12成肌细胞和NCC进行 体外 扩增。步骤2涉及在共培养系统中接种NCC和C2C12细胞。步骤3包括在下面的C2C12细胞中进行的伤口测定，以评估细胞迁移能力。步骤4涉及鬼笔环肽的免疫染色，以评估迁移细胞的细胞学结构和形态。缩写：NCC = 神经嵴细胞;Ab = 抗体。 请点击此处查看此图的大图。
图2：神经嵴细胞的存在增加了肌 母细胞的迁移能力。 （A）伤口生成时神经嵴细胞（NCC）插入物的存在导致肌母细胞迁移的改善。在NCC-C2C12共培养物中添加外源重组Wnt5a（rWnt5a）对肌母细胞迁移的积极影响最强。（B）伤口生成后9小时平均肌母细胞重新填充区域的量化（误差条显示标准偏差）。（C）伤口生成后9小时在伤口边界对成肌细胞进行鬼笔环肽染色。虚线矩形显示迁移前沿的鬼笔环肽染色的成肌细胞。对于 在B中定量的每个实验条件，总共使用n = 3个样品。比例尺 = 200 μm（ 对于 A 和 C）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：神经嵴细胞衍生的 Wnt5a 是肌母细胞迁移所必需的。 （A）Wnt5a的相对mRNA表达以验证NCC中siRNA介导的敲低。 （B）在NCC中Wnt5a敲低后，C2C12成肌细胞的迁移显着减少。 添加外源性rWnt5a足以挽救成肌细胞中的这种迁移缺陷。 （C）在伤口产生后10小时量化平均成肌细胞重新填充区域（误差线显示标准偏差）。（D）伤口产生后10小时在伤口边界对成肌细胞进行鬼笔环肽染色。虚线矩形显示迁移前沿的鬼笔环肽染色的成肌细胞。对于用C定量的每个实验条件，总共使用n = 3个样品。比例尺 = 200 μm（对于 B 和 D）。缩写：NCC = 神经嵴细胞;siRNA = 小干扰RNA。请点击此处查看此图的大图。
图 4：Wnt5a 通过成肌 细胞中的 ROR2 受体发出信号以驱动迁移。 （A） ROR2 的相对mRNA表达以验证siRNA介导的C2C12细胞中的敲低。（B）尽管存在NCC，但成肌细胞中 ROR2 的敲低降低了它们的迁移能力。 外源性rWnt5a在 ROR2 敲低后未能挽救肌母细胞迁移。（C）在伤口产生后10小时量化平均成肌细胞重新填充区域（误差线显示标准偏差）。（D）伤口产生后10小时在伤口边界对成肌细胞进行鬼笔环肽染色。虚线矩形显示迁移前沿的鬼笔环肽染色的成肌细胞。对于用 C定量的每个实验条件，总共使用n = 3个样品。比例尺 = 200 μm。缩写：NCC = 神经嵴细胞;siRNA = 小干扰RNA。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：重组Wnt5a补充剂的剂量依赖性分析。 重组Wnt5a补充试验0 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL的剂量依赖性分析发现，500 ng/mL的外源性rWnt5a是体外12小时迁移期间驱动肌母细胞迁移和鬼笔环肽细胞结构变化的最佳浓度 。 比例尺 = 200 μm。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：孔插入物的代表性图像。 含有用 （A） 50 nM 阴性对照 siRNA 和 （B） 50 nM Wnt5a siRNA 处理的 O9-1 神经嵴细胞的孔插入物的明场图像。比例尺 = 200 μm。缩写：siRNA = 小干扰RNA。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：siRNA介导的Wnt5a敲低后O9-1细胞中Wnt5a蛋白表达的代表性图像。 在含有用 （A） 50 nM 阴性对照 siRNA 和 （B） 50 nM Wnt5a siRNA 处理的含有 O9-1 神经嵴细胞的细胞培养孔中对 Wnt5a 蛋白进行免疫荧光染色。比例尺= 20μM.缩写：siRNA =小干扰RNA;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
非规范Wnt/平面细胞极性（PCP）信号通路是一种至关重要的细胞信号通路，与多种发育过程24，25和疾病过程24，26有关。在胚胎发育过程中，非规范的Wnt信号涉及来自信号发送细胞的分子信号的广泛网络，最终诱导信号接收细胞的形态，不对称组织和定向迁移的变化11。先前的研究表明，驱动这种信号传导的特定配体 - 受体途径是多种多样的，上下文依赖性的，并且通常在细胞类型12，13，14，15之间有所不同。由于这种分子复杂性，使用体内常规遗传重组方法评估旁非典型Wnt信号相互作用的能力受到限制。虽然体外系统越来越多地被用作研究非规范Wnt细胞表型的替代方法，但可用的协议仅关注途径的下游信号接收方面，并且无法充分模拟这些信号事件的细胞间和旁分泌性质。因此，本研究的目的是为非接触式共培养系统开发一种方案，该系统在体外概括了旁分泌Wnt相互作用。该协议的重点是在体外模拟功能性非规范Wnt信号的两个特征方面，包括细胞内丝蛋白和极化迁移能力的组织。
作为概念验证，该协议应用于研究心脏发育背景下的旁分泌机制。在心脏发生过程中，心脏NCC和SHF祖细胞之间的相互信号事件对于心流出道（OFT）的适当成熟至关重要27，28，29。先前的工作表明，在小鼠心脏发育过程中，咽部SHF细胞中NCC介导的Wnt/PCP信号传导是SHF祖细胞掺入发育中的OFT和正常OFT比对所必需的21。Schleiffarth等人等人已经表明，编码Wnt/PCP配体Wnt5的基因的基因敲除已被证明会破坏SHF祖细胞组织和迁移能力，导致心脏OFT22，23，30的透视缩短和错位。随着已建立的小鼠NCC （O9-1）31和肌母细胞（C2C12）细胞系，该协议表明与NCC共培养与鬼笔环肽阳性细胞质丝状伪足和板状伪足增加有关，并在伤口愈合测定中提高肌母细胞迁移能力。这些体外分子和功能终点建立在先前发表的NCC操作方案31的基础上，并密切模拟Wnt5a全球敲除小鼠中描述的体内表型变化，验证了该模型的实用性。
为了确定驱动NCC和成肌细胞之间非规范Wnt信号传导的特定分子途径，对NCC中编码候选配体 Wnt5a的基因及其在成肌细胞中的相应受体 ROR2进行了平行的细胞特异性敲低实验。正如预期的那样，敲低信号发送（NCC中的Wnt5a ）和信号接收（成肌细胞中的ROR2 ）细胞中的分子独立破坏了Wnt/PCP相关的肌动蛋白细胞结构变化并抑制了肌母细胞迁移。重要的是，仅在NCC-Wnt5a敲低条件下观察到重组Wnt5a的表型挽救，该条件支持NCC衍生的Wnt5a 通过ROR2受体激活成肌细胞中的PCP信号传导的机制。这些结果与小鼠遗传研究的数据一致，这些研究将Wnt5a-ROR2轴确定为胚胎心脏发育过程中NCC和SHF细胞之间关键的Wnt/PCP信号轴3，21。虽然在该协议中没有经过实验测试，但尚不清楚SHF衍生的Wnt5a是否通过ROR2受体向神经嵴提供相互的旁分泌信号。该假设可以通过在孔插入构建体的顶部重复C2C12细胞和底部的O9-1细胞来使用该协议进行测试。如果SHF衍生的Wnt5a确实通过NCC-ROR2提供互惠的旁分泌信号，那么人们可以预期C2C12细胞中 Wnt5a 的敲低会抑制底层O9-1细胞的迁移能力和肌动蛋白聚合。
该协议有几个独特的优势。首先，它是一种非接触式孔插入系统，结合了伤口愈合测定和免疫染色技术的顺序使用，以评估同一信号接收细胞群中的功能和分子Wnt/PCP特征。这不仅为非规范Wnt诱导的细胞内丝组织和体 外 极化迁移变化的表型提供了一种可靠的方法，而且还允许对信号转导机制进行更精细的评估。虽然该协议提供了有关Wnt5a-ROR2分子的原理证明，但该模型也很容易评估非规范Wnt信号通路中其他配体和受体的作用。可以进一步调整免疫染色方案，以评估多种潜在的下游效应蛋白（例如，RhoA，p-JNK，Daam1，Rac1）的表达，这些蛋白已被证明可以在 体内转 导非规范的Wnt信号。此外，这些不同效应分子的蛋白质水平可以与迁移或肌动蛋白细胞结构表型相关。其次，共培养系统的非接触性质允许在Wnt/PCP途径中独立操纵特定的信号发送分子与信号接收分子。在这些具有代表性的结果中，选择进行细胞特异性siRNA敲低。然而，该方案也适合使用药物抑制剂或转基因细胞系来评估临床应用的候选配体受体途径。类似地，可以通过向共培养基中添加分子或药物化合物来进行表型挽救实验，如重组Wnt5a所示。靶向这些化合物以选择性地挽救信号发送与信号接收紊乱，进一步验证了旁分泌机制途径，这是使用当前 体内 模型系统不允许的。
该协议有许多关键步骤。首先，重要的是要确保原代细胞在整个方案中扩增并保持在适当的汇合度。如果允许C2C12成肌细胞增殖至100%汇合，它们将开始融合并从成肌细胞分化为肌管。因此，这些细胞必须以描述的适当密度传代。其次，鉴于需要STO饲养层细胞来产生条件培养基来生长O9-1细胞，因此必须用丝裂霉素C适当灭活STO细胞，并在解冻和接种O9-1细胞之前使用灭活的STO细胞制造足够的（至少500mL）O9-1生长培养基。也许该协议中最关键的步骤是在肌母细胞单层 32，33 中生成具有均匀几何形状和宽度的适当划痕。步骤 3.1.4 详细介绍了优化协议这部分的几个技巧。尽管有这些建议，但应该承认，与标准2D划痕测定相关的可变性仍然是技术挑战和该协议的局限性。因此，有必要对每个实验条件进行多次技术重复。
最后，尽管这里介绍的结果是使用小鼠NCC和成肌细胞生成的，但该协议原则上可以适应包括任何感兴趣的信号发送和信号接收细胞。因此，该系统不仅可用于在各种发育背景下推进旁分泌非规范Wnt信号传导的基本机制，而且还可用于测试Wnt/PCP相关疾病过程的治疗机制。例子包括药物筛选抑制Wnt/PCP诱导的恶性细胞迁移能力或恢复患者来源的终末细胞类型的定向迁移，这些细胞在基线时具有缺陷的PCP信号传导能力。除了非规范的Wnt信号通路外，该协议还可以适用于研究其他旁分泌信号机制和两种细胞类型之间的通路。例如，siRNA介导的O9-1细胞中其他途径（例如Notch，Bmp/Tgf-β，Fgf）中已知分泌分子的敲低可以与潜在成肌细胞中增殖，分化或凋亡标志物的免疫染色相结合。
总之，该协议建立了一个新颖且高度可处理的实验方案来研究非规范Wnt相关细胞内丝组织和 体外 极化迁移的机制。这里描述的方法通过保持Wnt相互作用的细胞间和旁分泌性质来改进现有技术，并允许对该途径的信号发送与信号接收成分进行独立评估。该协议可广泛用于研究两种细胞类型之间的基本旁分泌Wnt/PCP信号传导机制，并筛选针对Wnt/PCP相关疾病过程的新治疗化合物。
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Disclosures
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以解释为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH授予O.T.的F30HL154324以及S.R.K.的K08HL121191和R03HL154301的部分支持。作者要承认，本手稿中图 1 中的原理 图 是用 biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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