Summary
Her har vi brugt alizarinrød farvning til at vise, at eksponering for blyacetat forårsager en knoglemasseændring i zebrafisklarver. Denne farvningsmetode kan tilpasses til undersøgelse af knogletab i zebrafisklarver forårsaget af andre farlige giftstoffer.
Abstract
Kemisk induceret knogletab på grund af bly (Pb) eksponering kan udløse en række negative virkninger på både menneskelige og dyrs skeletsystemer. De specifikke virkninger og mekanismer i zebrafisk er dog fortsat uklare. Alizarin rød har en høj affinitet for calciumioner og kan hjælpe med at visualisere knoglen og illustrere skeletmineralmasse. I denne undersøgelse havde vi til formål at detektere blyacetat (PbAc) -induceret knogletab i zebrafisklarver ved hjælp af alizarin rød farvning. Zebrafiskembryoner blev behandlet med en række PbAc-koncentrationer (0, 5, 10, 20 mg/l) mellem 2 og 120 timer efter befrugtning. Helmonteret skeletfarvning blev udført på larver 9 dage efter befrugtning, og det samlede farvede område blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software. Resultaterne viste, at det mineraliserede væv blev farvet i rødt, og det farvede område faldt signifikant i PbAc-eksponeringsgruppen med en dosisafhængig ændring i knoglemineralisering. Dette papir præsenterer en farvningsprotokol til undersøgelse af skeletændringer i PbAc-inducerede knogledefekter. Metoden kan også anvendes i zebrafisklarver til påvisning af knogletab induceret af andre kemikalier.
Introduction
Nylige undersøgelser har bekræftet, at osteoporose på grund af glukokortikoider, aromatasehæmmere og overdreven alkoholforbrug er almindeligt 1,2. Bly (Pb) er et giftigt metal, der findes i planter, jord og vandmiljøer3. Selvom de negative virkninger af Pb på menneskekroppen har tiltrukket sig stor opmærksomhed, skal dens irreversible indvirkning på knoglen undersøges yderligere. Blyforgiftning forårsager en bred vifte af patologiske ændringer i både det udviklende og voksne skelet, der påvirker normale livsaktiviteter. Undersøgelser har fundet en sammenhæng mellem kronisk Pb-eksponering og knogleskade4, herunder nedsatte knoglestrukturer5,6, reduceret knoglemineraltæthed og endda øget risiko for osteoporose7.
Mineraliseret væv er af stor betydning for knoglestyrke8, og knoglemineraliseringsmatrixaflejring er et kritisk indeks for knogledannelse9. Alizarin rød har en høj affinitet for calciumioner, og alizarin rød farvning er en standardprocedure til vurdering af knogledannelse10. Ifølge denne metode farves mineraliseret væv rødt, mens alt andet væv forbliver gennemsigtigt. Det farvede område kvantificeres derefter ved digital billedanalyse11.
Zebrafisk er en vigtig modelorganisme, der i vid udstrækning anvendes i lægemiddelopdagelses- og sygdomsmodeller. Genetiske undersøgelser i zebrafisk og mennesker har vist ligheder i de underliggende mekanismer for skeletmorfogenese på molekylært niveau12. Desuden er screening af lægemidler med høj kapacitet eller biomolekyle mere mulig i store koblinger af zebrafisk end murinmodeller, hvilket letter den mekanistiske undersøgelse af proosteogene eller osteotoksiske molekyler13. Differentiel farvning af skeletet i toto10 bruges ofte til at studere skeletdysplasi hos små hvirveldyr og pattedyrfostre. Alizarin rød farvning blev udført for at undersøge knogleudviklingstoksiciteten af kemikalier i zebrafisklarver. Heri brugte vi bly som et eksempel til at beskrive en protokol til påvisning af blyacetatinducerede knogledefekter i zebrafisklarver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er skitseret her, er blevet gennemgået og godkendt af Animal Care Institute of The Ethics Committee of Soochow University.
1. Fiskeopdræt og embryonindsamling 14
- Foder fisk tre gange hver dag; sikre, at zebrafisken holdes på 28,5 ± 0,5 °C med en lys/mørk cyklus på 14:10 timer.
- Adskil den voksne han- og hunfisk ved hjælp af isolationsbrætter i gydetanke i forholdet 2:1 mellem han og hun om aftenen.
- Næste morgen skal du fjerne isolationstavlerne kl. 9.00 og samle embryonerne 2 timer senere.
- Embryonerne anbringes i en biokemisk inkubator, der holdes ved 28,5 °C før forsøget.
2. Kemisk eksponering
- Forbered moderbestanden: vej blyacetattrihydrat (5 g), og opløs det i ultrarent vand (50 ml) under omrøring.
FORSIGTIG: PbAc er giftig. Brug passende støvmasker, beskyttelsesbeklædning og handsker. Udfør eksperimentet under en røghætte. - Vælg og fordel tilfældigt zebrafiskembryoner i rene 6-brøndsplader (30 embryoner pr. brønd i 3 ml zebrafiskavlsvand; se tabel 1 for dets sammensætning). Behandle embryonerne med PbAc (0, 5, 10, 20 mg/l) fra 2 til 120 timer efter befrugtning (hpf).
BEMÆRK: Koncentrationerne af PbAc blev valgt i henhold til dosis-range-finding eksperimenterne. Resultaterne viste, at LC50 af blyacetat på zebrafiskembryoner var 41.044 mg / L ved 120 hpf. Derfor blev den højeste koncentration sat til halvdelen af LC50 og en række opløsninger fremstillet ved 2 gange fortynding. - Foder larverne to gange om dagen fra 5 dage efter befrugtning (dpf). Zebrafiskembryonerne holdes på 28,5 ± 0,5 °C med en lys/mørk cyklus på 14:10 timer.
- Opdater det Pb-frie medium (zebrafiskavlsvand) hver 24. time indtil 9 dpf.
BEMÆRK: Efter afslutningen af eksperimenterne blev alle blyholdige opløsninger hældt i en udpeget væsketank og behandlet af eksperimentets ledelsescenter.
3. Alizarin rød farvning
BEMÆRK: Brug passende støvmasker, beskyttelsesbeklædning og handsker under hele farvningsprocessen. Sammensætningerne af alle opløsninger er vist i tabel 1.
- Specifikke farvningstrin
BEMÆRK: Farvningsprocessen blev udført i en 24-brøndsplade ved stuetemperatur. Når hver opløsning er tilsat, skal du placere 24-brøndspladen på rystebordet indstillet med lav hastighed.- 10 zebrafisklarver fjernes tilfældigt fra hver gruppe ved 9 dpf, og fiskene fikseres i 1 ml 2% paraformaldehyd/1x fosfatbufferet saltvand i 2 timer.
- Dekanter opløsningen og vask zebrafisklarverne med 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 i 10 min.
- Dekanter opløsningen og inkuberes larverne i følgende opløsninger i 5 minutter hver til affarvning: vandfri ethanolopløsning (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) og 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
- Dekanter opløsningen, fjern pigmentet ved blegning med en opløsning bestående af 3%H2O2og 0,5% KOH, og observer en gang hvert 10. minut, indtil pigmentet er helt fjernet.
- Skyl zebrafisklarverne flere gange med 25% glycerin/0,1% KOH i 10 min hver, indtil der ikke er bobler.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå bobler; Ellers vil boblerne i zebrafiskkroppen fremstå som et sort synsfelt under mikroskopet, hvilket vil påvirke observationer og kvantitativ analyse. - Plet larverne ved at lægge 1 ml 0,01% alizarin i blød i 50 min.
- Dekantér opløsningen og tilsæt 1 ml 50% glycerin/0,1% KOH i 10 minutter for at rydde baggrunden. Opbevar fiskene i frisk 50% glycerin/0,1% KOH til efterfølgende observation.
4. Erhvervelse af billeder
- Overfør en larve på glasrutsjebanen hver gang, og hold larven midt i væskedråbet.
- Overhold larverne under et stereomikroskop.
- Tænd kameraet, åbn softwaren (se materialetabellen), og behold standardindstillingerne.
- Klik på AE, og vælg en passende eksponeringstid (60 ms i dette eksperiment) for at få det bedste billede.
- Tag alle billederne under de samme indstillinger. Gem billederne i .tif format til senere analyse.
5. Billedanalyse
BEMÆRK: Se den supplerende fil for et eksempel med et sæt prøvegrafer til billedanalyse.
- Dobbeltklik på ImageJ-ikonet , og analyser de billeder, der er gemt i trin 4.5.
- Klik på Filer | Åbn for at åbne de billeder, der er gemt i trin 4.5.
- Klik på Billede | Skriv, vælg 8-bit.
- Klik på Rediger | Omvendt.
- Klik på Analyser | Kalibrer, vælg Ukalibreret OD i pop op-grænsefladen, marker Global kalibrering nederst til venstre i den nederste grænseflade, og klik på OK.
- Klik på Analyser | Indstil skala | Klik for at fjerne skala i popup-grænsefladen, tjek Global nedenfor, og klik på OK.
- Klik på Analyser | Indstil målinger, vælg elementområdet i pop op-grænsefladen, marker grænsen til tærskel nedenfor (for kun at måle det valgte interval), og klik på OK.
- Klik på Billede | Juster | Tærskel, skub skyderen midt i pop op-grænsefladen for at vælge den relevante tærskel (skift tærsklen for hvert billede), så alle mål, der skal testes i et billede, er valgt, og klik på Indstil.
- Klik på Analyser | Mål. Registrer datoerne for hver gruppe.
- Brug envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest til at analysere forskellene og indstille signifikansniveauet til p < 0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alizarin rød farvning er en følsom og specifik metode til måling af ændringer i knoglemineralisering i zebrafisklarver. I denne undersøgelse har vi observeret, at PbAc havde negative virkninger på zebrafisklarver, herunder død, misdannelse, nedsat hjertefrekvens og kropslængdeforkortelse. Desuden blev mineralskeletområderne af zebrafisklarver evalueret for at undersøge PbAc-induceret knogletab. Ved 9 dpf (figur 1A) mineraliseres mange knogler i hovedskelettet og farves derfor i rødt, såsom parasphenoid (PS), operkel (OP), ceratobranchial (CB) og notochord (NC). I modsætning hertil forekommer otolitter (OT) (ikke-benede strukturer) brun-sort snarere end rød. Digital analyse blev udført for at kvantificere det samlede farvede område i hvert billede. Sammenlignet med kontrolgruppen viste blyacetatgrupper behandlet med 10 og 20 mg/l PbAc et signifikant fald (p < 0,001) i det farvede område (figur 1B). Ændringerne i knoglemineralisering viste dosisafhængighed.
Figur 1: Virkninger af forskellige koncentrationer af PbAc på zebrafisklarvernes kranium . (A) Billeder af det dorsale aspekt af hovedbenet farvet med alizarinrødt i larver ved 9 dpf. Det mineraliserede væv er farvet i rødt. Skalastænger = 0,5 mm. (B) Ændringer i det relative mineraliserede areal ved 9 dpf; 10 larver pr. gruppe. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM. Tre replikater blev udført. p < 0,001 ***. Forkortelser: PS = parasphenoid; OP = operkel; OT = otolith; CB = ceratobranchial; NC = notokord; dpf = dage efter befrugtning. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | Sammensætning | |
| Zebrafisk ynglende vand | pH 7-7,3, 27-29 °C, ledningsevne 450-550 μs, saltholdighed 0,25-0,75 %0, opløst ilt >6 mg/l, fotoperiode 14/10 timer, hårdhed 100-200 mg/l, klor 0 mg/l, ammoniaknitrogenkoncentration <0,02 mg/l, nitrit <1 mg/l, nitrat <50 mg/l, kuldioxid <50 mg/l | |
| Blandet opløsning (50 ml) af 2% paraformaldehyd og 1x PBS | 25 ml 4% paraformaldehyd, 5 ml 10x PBS-buffer og dobbeltdestilleret vand (ddH2O) q.s. til 50 ml | |
| Blandet opløsning (50 ml) på 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 10 mM MgCl2 | 5 ml af 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 ml af 1 M MgCl 2 og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| Blandet opløsning (50 ml) af 80% vandfri ethanol, 10 mM MgCl2 og 100 mM Tris-HCI (pH = 7,5) | 42,1 ml 95% vandfri ethanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5), 0,5 ml 1 M MgCl 2 og ddH2 O q.s. til 50 ml | |
| Blandet opløsning (50 ml) af 50 % vandfri ethanol og 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 26,3 ml 95% vandfri ethanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| Blandet opløsning (50 ml) af 25 % vandfri ethanol og 100 mM Tris-HCI (pH=7,5) | 13,2 ml 95% vandfri ethanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| Blandet opløsning af 3% H2O2-opløsning og 0,5% KOH-opløsning | Lige store mængder på 6% H 2O2 og 1% KOH blandet før brug | |
| Blandet opløsning (50 ml) af 25% glycerin og 0,1% KOH | 12,5 ml 100% glycerin, 0,25 ml 20% KOH og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| 0,01% Alizarin (50 ml) | 1 ml på 0,5% Alizarin, 12,5 ml 100% glycerin, 5 ml 1 M Tris-HCI (pH = 7,5) og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| Blandet opløsning (50 ml) af 50% glycerin og 0,1% KOH | 25 ml 100% glycerin, 0,25 ml 20% KOH og ddH2O q.s. til 50 ml | |
Tabel 1: Sammensætning af opløsninger anvendt i alizarin rød farvning protokol. Forkortelse: q.s. = kvante tilstrækkelig (efter behov).
Supplerende fil: Et sæt prøvegrafer til billedanalyse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisken er en velegnet model til at studere knoglemetabolisk sygdom. Sammenlignet med gnavermodeller er zebrafiskmodeller relativt hurtige at etablere, og måling af sygdommens sværhedsgrad er lettere. I vildtype zebrafisklarver forekommer mineralisering af hovedskelettet ved 5 dpf og det aksiale skelet ved 7 dpf15. Således er kraniale knogler som PS, OP, CB og NC veludviklede ved 9 dpf. Efter at larverne var helt affarvede og blegede, blev blødt væv ryddet, hvilket resulterede i et gennemsigtigt udseende af fiskekroppen. Det alizarin røde farvningsmiddel blev tilsat for at plette og visualisere mineralknoglerne i zebrafisk i rødt.
Billedanalyse er afgørende for at opnå pålidelige eksperimentelle konklusioner i dette eksperiment. Fotografier af zebrafisk med god kropsholdning og ren baggrund blev udvalgt til kvantitativ analyse. Når vi kvantificerer det farvede område for et enkelt billede, beregnes alle mineraliserede knogler farvet i rødt af en fisk. Således kan vi sammenligne knoglemasseændringerne mellem de blyeksponerede og kontrolgrupperne. I denne undersøgelse forårsagede PbAc-eksponering udviklingstoksicitet hos zebrafisk, og der blev observeret en signifikant reduktion i det farvede område af mineralben i 10 og 20 mg / L PbAc-eksponeringsgrupperne ved 9 dpf. Således reducerede tidlig embryonal eksponering for PbAc knoglemassen af zebrafisklarver. Figur 1 viser PbAc-induceret knogletab visualiseret ved alizarinrød farvning i zebrafisklarverne.
Farvestoffer, der binder til forkalket matrix, bruges til at mærke hele skelettet. Calcein er en fluorescerende kromofor, der også specifikt kan binde sig til calcium i levende væv og er blevet brugt til at mærke knoglestrukturer og studere knoglevækst10. I modsætning til calcein genererer alizarinrød farvning af fast væv en permanent registrering af skeletforandringer, der kan lette sammenligninger af flere prøver. Mikrocomputertomografi (Micro CT) kan give nøjagtig kvantitativ analyse af mineraliseret væv ved at erhverve en række 2D-røntgenstråler. På grund af zebrafiskens lille størrelse og mange af knoglerne i det udviklende zebrafiskskelet er tynde, kan Micro CT-analyseværktøjer imidlertid ikke nøjagtigt karakterisere disse knogler16.
Fluorescerende transgene reporterlinjer hjælper også med at visualisere skeletudvikling i levende larver eller endnu mere modne fisk i realtid17. På samme måde tillader alizarinrød S in vivo-farvning vurdering af levende fisk og kontinuerlig sporing af misdannelser18. Således er alizarin rød farvning en nyttig og omkostningseffektiv måde at analysere knogletab i zebrafisklarver. På grund af kompleksiteten af de eksperimentelle trin og antallet af anvendte opløsninger kan de endelige resultater af analysen af alizarin rødfarvede billeder imidlertid blive påvirket af den eksperimentelle operation. Endvidere er det vanskeligt at anvende denne farvningsmetode til voksne zebrafisk på grund af øget kropsvolumen og blødt væv; Mikro CT-analyse eller transgene linjer ville være et bedre valg til skeletbilleddannelse af voksne zebrafisk. Sammenfattende kan protokollen, der præsenteres her, bruges til at studere ændringerne i knoglemineralisering i zebrafisklarver efter eksponering for kemiske giftstoffer. Denne procedure kan være nyttig til at etablere en zebrafiskmodel til at studere knoglesygdomme og udvikle nye terapeutiske lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) og Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
