Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل الخلايا البطانية لرئة الفأر الأولية

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63253
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care, UCSF Benioff Children's Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco

Summary

في هذه المقالة ، تم عزل الخلايا البطانية الرئوية الأولية واستزراعها من الفئران حديثي الولادة.

Abstract

تلعب الخلايا البطانية أدوارا مهمة في تنظيم نغمة الأوعية الدموية والمناعة والتخثر والنفاذية. يحدث الخلل البطاني في الحالات الطبية بما في ذلك مرض السكري وتصلب الشرايين والإنتان وإصابة الرئة الحادة. هناك حاجة إلى طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل الخلايا البطانية النقية من الفئران للتحقيق في دور الخلايا البطانية في التسبب في هذه الحالات وغيرها. في هذا البروتوكول ، تم تحضير الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الرئة من جراء الفئران حديثي الولادة البالغة من العمر 5-7 أيام. يتم حصاد الرئتين وفرمها وهضمها إنزيميا باستخدام كولاجيناز I ، ويتم زراعة الخلايا المطلقة طوال الليل. ثم يتم اختيار الخلايا البطانية باستخدام مضاد PECAM1 (CD-31) IgG مترافق مع الخرز المغناطيسي ، ويتم استزراع الخلايا مرة أخرى للالتقاء. ثم يحدث اختيار خلية ثانوية مع مضاد ICAM2 (CD-102) IgG مترافق مع حبات مغناطيسية لزيادة نقاء الخلايا البطانية ، ويتم استزراع الخلايا مرة أخرى للالتقاء. تستغرق العملية بأكملها حوالي 7-10 أيام قبل استخدام الخلايا للتجريب. ينتج هذا البروتوكول البسيط خلايا بطانية عالية النقاء (نقاء >92٪) يمكن استخدامها على الفور في الدراسات المختبرية ، بما في ذلك الدراسات التي تركز على إنتاج السيتوكين البطاني والكيموكين ، والتفاعلات بين الكريات البيض والبطانة ، ومسارات التخثر البطانية ، ونفاذية البطانة. مع توفر العديد من الضربات القاضية وخطوط الفئران المعدلة وراثيا ، فإن هذا الإجراء يفسح المجال أيضا لفهم وظيفة جينات معينة تعبر عنها الخلايا البطانية في الاستجابات الصحية والمرضية للإصابة والعدوى والالتهابات.

Introduction

نما الاهتمام بدراسة البطانة الوعائية مؤخرا ، حيث يحدث خلل في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في أمراض بشرية متعددة ، مثل السكتة الدماغية وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري وإصابة الرئة الحادة والإنتان والإصابات غير المعدية1،2،3،4،5. لتحديد التسبب في هذه الحالات وفهم أدوار جينات معينة في استجابات الخلايا البطانية الوقائية وغير المنظمة ، هناك حاجة إلى طرق موثوقة لعزل وزراعة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة عالية النقاء من الفئران. في حين أن العديد من الدراسات تستخدم الخلايا البطانية البشرية مثل الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) أو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية (HMVEC) ، إلا أن هناك أسبابا متعددة لاستخدام الخلايا البطانية للفأر لدراسة وظيفة البطانة والخلل الوظيفي. أولا ، هناك عدم تجانس كبير في استجابات الخلايا البطانية من متبرعين بشريين مختلفين ، مما يؤدي إلى تباين في النتائج بين التجارب الفردية6،7،8. ثانيا ، يمكن أن يؤدي إسكات أهداف الجينات في خطوط الخلايا البشرية الأولية أيضا إلى مستويات تعبير البروتينالمتغيرة 9,10. في المقابل ، هناك حد أدنى من عدم التجانس في استجابات الخلايا البطانية للفأر11 ، على افتراض أن الخلفية الجينية هي نفسها بين مجموعات الدراسة. علاوة على ذلك ، يمكن تحضير أعداد كبيرة من الخلايا البطانية للفأر عن طريق تجميع الرئتين من العديد من الفئران الوليدية. تسمح هذه العوامل بنتائج أكثر اتساقا وقابلية للتكرار بين التجارب. أخيرا ، يوفر توفر الفئران بالضربة القاضية أو المعدلة وراثيا أيضا عزل أنواع الخلايا التي تفتقر إلى البروتينات ذات الأهمية.

أدت التحديات الكبيرة في عزل السكان الأصحاء والنقيين للخلايا البطانية لرئة الفأر باستخدام الطرق المنشورة12،13،14،15،16 إلى تطوير طريقة أكثر موثوقية ومباشرة لعزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة عالية الجودة لرئة الفأر. تشمل مزايا البروتوكول الحالي استخدام الفئران حديثي الولادة ، والتي تتوفر بسهولة ، مما يحد من تربية الحيوانات وتكاليف السكن. بالإضافة إلى ذلك ، في تجربتنا ، فإن صلاحية الخلايا البطانية من الفئران حديثي الولادة أعلى بكثير من الخلايا البطانية المحضرة من الفئران البالغة. نظرا لأن الفئران الوليدية لديها أنسجة رئوية صغيرة ، يمكن حصاد الخلايا البطانية عن طريق هضم الرئتين المستأصلتين في كولاجيناز بدلا من استخدام تقطير القصبة الهوائية للكولاجيناز ، والذي يوصى بجمعه من الفئران البالغة16. هذا يقلل أيضا من الوقت بين القتل الرحيم للفئران والحصول على خلاياها البطانية في وسط زراعة الخلايا والحاضنة دون التأثير على نقاء أو إنتاجية أو استنساخ الاستجابات البطانية. أخيرا ، تم عزل مجموعات الخلايا النقية بدون قياس التدفق الخلوي ، مما قد يؤدي إلى تلف أو يؤدي إلى انخفاض غلة الخلايا البطانية14،15،17.

يؤدي البروتوكول المعدل الحالي باستمرار إلى خلايا بطانية عالية النقاء وقابلة للحياة في غضون 7-10 أيام يمكن استخدامها على الفور للتجارب في المختبر . عزل الخلايا مباشرة من الحيوانات بالضربة القاضية يقلل أيضا من التلاعب بالخلايا قبل التجربة. يمكن استخدام هذه الطرق للتحقيق في دور البروتينات المختلفة في الوظيفة البطانية لاكتشاف الأهداف العلاجية القائمة على البطانة لأمراض متعددة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو. تم استخدام ذكور C57BL / 6 من صغار الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 5-7 أيام) للدراسة. يستغرق البروتوكول بأكمله من 7 إلى 10 أيام (الشكل 1).

1. إعداد وسط الخلية البطانية

  1. تحضير الوسط القاعدي: وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 4500 مجم / لتر من الجلوكوز و 4 مللي مول من L-Glutamine (DMEM) المكمل ب 20٪ (v / v) مصل بقري جنيني معطل بالحرارة ، 100 وحدة / 100 ميكروغرام / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 25 مللي متر من HEPES (انظر جدول المواد). مرشح معقم مع مرشح 22 ميكرومتر. يخزن الوسط القاعدي على حرارة 4 درجات مئوية ويستخدمه في غضون شهر من التحضير.
  2. تحضير الوسط الكامل: وسط قاعدي مكمل ب 100 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 100 ميكروغرام / مل من مكمل نمو الخلايا البطانية ، و 1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1 مللي متر بيروفات الصوديوم (انظر جدول المواد). مرشح معقم مع مرشح 22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون شهر من التحضير.

2. الطلاء المسبق للخرز المغناطيسي المضاد للفئران13

  1. اصنع 50 مل من محلول غسيل الخرز: محلول مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل ب 0.1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA). فلتر معقم بفلتر 22 ميكرومتر ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون شهر من التحضير.
  2. دوامة الخرز المغناطيسي لبضع ثوان لإعادة تعليق الخرز والماصة 50 ميكرولتر من الخرز (2 × 107 حبات) في أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، أحدهما ل CD-31 والآخر ل CD-102 (انظر جدول المواد). أضف 1 مل من المخزن المؤقت لغسل الخرز واخلطه جيدا.
    ملاحظة: تم استخدام جميع الأحجام المذكورة لعزل الخلايا البطانية من 3-4 جراء فأر حديثي الولادة (5-7 أيام). CD-31 و CD-102 هي علامات سطح الخلية البطانية المستخدمة في اختيار المناعي المغناطيسي.
  3. ضع الأنابيب على فاصل مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية. كرر الغسيل 3 مرات باستخدام 1 مل من محلول غسيل الخرز في كل مرة.
  4. أعد تعليق الخرز بحجم حبة أصلي ، 50 ميكرولتر ، مع مخزن مؤقت لغسيل الخرز. ثم أضف 5 ميكرولتر (2.5 ميكروغرام) من الجسم المضاد (CD-31 / CD-102) إلى كل 50 ميكرولتر من الخرز.
  5. احتضان تعليق حبة على دوران لطيف على الدوار طرف إلى طرف طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسيل 4 مرات.
  6. أعد تعليق الحبيبات المناعية في الحجم الأصلي ، 50 ميكرولتر ، مع مخزن مؤقت لغسل الخرزة وتخزينها عند 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 1-2 أسابيع.

3. عزل وطلاء خلايا الرئة

  1. تحضير محلول كولاجيناز من النوع 1 في يوم العزل: أضف 25 مجم من كولاجيناز النوع 1 إلى 25 مل من HBSS (انظر جدول المواد). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع دوران لطيف ومرشح معقم باستخدام مرشح 22 ميكرومتر. يحفظ المحلول دافئا عند 37 درجة مئوية.
  2. حقن صغار الفئران البالغة من العمر 5-7 أيام في العضل بالهيبارين (25 ميكرولتر / فأر ، 1000 وحدة / مل) قبل 10 دقائق من القتل الرحيم لتقليل تنشيط الخلايا البطانية وتكوين الجلطة14,15.
  3. القتل الرحيم لجرو الفأر بقطع الرأس باستخدام مقص حاد وفقا لإرشادات AVMA لعام 2020 للقتل الرحيم. ثم قم بتثبيت الماوس على لوحة تشريح مع الجانب البطني لأعلى.
  4. رش الذبيحة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم فضح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز أولا ثم قطعه بشكل متفوق لأعلى على طول الجدران الجانبية للصدر بالكامل. يعكس القفص الصدري مرة أخرى يكشف القلب والرئتين.
    ملاحظة: استخدم ملقط ومقص أصغر لهذه الخطوة نظرا لصغر حجم الفئران الوليدية ، وتأكد من عدم اختراق القلب أو الرئتين لأن هذا سيؤدي إلى عدم كفاية إزالة الدم من الرئتين.
  5. قم بتوصيل إبرة 25 جم بحقنة سعة 10 مل ، وحقن 5 مل من DMEM البارد في البطين الأيمن للقلب لإزالة الدم من الرئتين. سوف تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض.
  6. إزالة الرئتين من التجويف الصدري ، فص واحد في وقت واحد ، عن طريق قطع الفصوص البعيدة إلى الشعب الهوائية المقابلة.
  7. اجمع كل فصوص الرئة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء مسبقا ب 20 مل من الوسط القاعدي المثلج (من الخطوة 1.1).
  8. كرر الخطوات 3.2-3.7 مع جراء الفئران الأخرى ، مع تجميع جميع فصوص الرئة في نفس الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
  9. حرك الأنبوب برفق باليد لمدة 10-15 ثانية لغسل أي خلايا دم حمراء زائدة يتم تقديرها بصريا على سطح الرئتين.
    ملاحظة: ليس من الضروري إزالة كل الدم من داخل أو حول الرئتين. ومع ذلك ، هذا يحسن النقاء. يجب إجراء أي معالجة أخرى للأنسجة في غطاء معقم.
  10. استخدم مصفاة خلوية لإزالة الرئتين من الوسائط ، ونقل الأنسجة إلى طبق زراعة أنسجة معقم يمكن التخلص منه بقطر 100 مم واللحم المفروم بمقص معقم.
  11. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 25 مل من محلول كولاجيناز مسخن مسبقا (الخطوة 3.1). قلبي برفق على خلاط دوار لمدة 45 دقيقة على حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الإفراط في الهضم لمدة 60 دقيقة يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الغلة.
  12. قم بتوصيل حقنة سعة 20 مل بقنية حادة 15 جم (انظر جدول المواد) وسحن المعلق 10-15 مرة لتفتيت الأنسجة إلى تعليق خلوي. كن قويا ، لكن تجنب الإفراط في الزبد.
    ملاحظة: لن تكون هناك قطع مرئية من الرئة ، وبدلا من ذلك ، سيكون التعليق غائما عند الانتهاء من هذه الخطوة.
  13. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. علاوة على ذلك ، شطف الأنبوب المخروطي المستخدم في الهضم ومصفاة الخلية ب 15 مل إضافية من الوسط القاعدي.
  14. جهاز الطرد المركزي التعليق الخلوي عند 400 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  15. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من الوسط الكامل. انقله إلى دورق T-75 وأضف 8 مل من الثقافة المتوسطة الكاملة عند 37 درجة مئويةفي حاضنة CO 2 رطبة بنسبة 5٪.
  16. في اليوم التالي ، اغسل القوارير مرتين ب 10 مل من محلول الملح المتوازن من هانك بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS / CMF) (انظر جدول المواد) وأضف 10 مل من الوسط الكامل.
    ملاحظة: بعد 2-3 أيام ، ستكون المزرعة متقاربة بنسبة 90-95٪ وجاهزة للعزل المناعي الأولي.

4. عزل الخلايا المناعية الأولية وزراعة الخلايا البطانية

  1. اغسل الخلايا البطانية الملتصقة مرتين باستخدام 10 مل HBSS / CMF. أضف 2 مل من محلول انفصال الخلايا الخالية من التربسين (انظر جدول المواد) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 5 دقائق. تأكد من رفع جميع الخلايا من القارورة.
    ملاحظة: يجب استخدام محلول انفصال خال من التربسين بدلا من التربسين لأن التربسين يمكن أن يعطل علامة التصاق سطح الخلية CD-31.
  2. أضف 8 مل من الوسط القاعدي لتحييد محلول انفصال الخلية ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. تدور لأسفل في 400 × غرام لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط القاعدي. انقل معلق الخلية سعة 2 مل إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
  4. حبات مغلفة دوامة مضادة ل CD-31 لبضع ثوان لإعادة تعليق الخرزات وإضافة 30 ميكرولتر من الخرز لكل 2 مل من تعليق الخلية. تأمين الغطاء.
  5. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على دوار من طرف إلى طرف. ثم ضع الأنابيب على فاصل مغناطيسي واتركها لمدة 2 دقيقة.
  6. بلطف باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، نضح طاف. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق حبيبات خلية الخرز بإضافة 3 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب ، والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  7. استبدل الأنبوب الموجود على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة ، ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية.
  8. كرر الغسلات (الخطوة 4.6-4.7) 4 مرات على الأقل حتى يبدو العنصر الطافي صافيا.
  9. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق حبيبات خلايا الخرز في وسط نمو كامل سعة 3 مل وانقلها إلى دورق T-75. أضف 7 مل من وسط النمو الكامل ، واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪.
  10. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا باستخدام HBSS / CMF ، ثم أضف 10 مل من الوسط الكامل الطازج. استبدل الوسائط ب 10 مل من الوسط الكامل الطازج كل 2-3 أيام حتى تتلاقى 90-95٪.
    ملاحظة: بمجرد أن تكون الخلايا ~ 90-95٪ متقاربة ، والتي تستغرق ~ 3-4 أيام ، تكون الثقافة جاهزة لعزل مناعي ثانوي.

5. عزل الخلايا المناعية الثانوية وزراعة الخلايا البطانية

  1. اغسل الخلايا البطانية الملتصقة مرتين ب 10 مل من HBSS / CMF. أضف 2 مل من محلول انفصال الخلايا الخالية من التربسين واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 5 دقائق. تأكد من رفع جميع الخلايا من القارورة.
  2. أضف 8 مل من الوسط القاعدي لتحييد محلول انفصال الخلايا ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. تدور لأسفل في 400 × غرام لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط القاعدي. انقل معلق الخلية سعة 2 مل إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل.
  4. حبات مغلفة دوامة مضادة ل CD-102 لبضع ثوان لإعادة تعليق الخرز وإضافة 30 ميكرولتر من الخرز لكل 2 مل من تعليق الخلية. تأمين الغطاء.
  5. احتضن الأنبوب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على دوار طرفي. ضع الأنابيب على فاصل مغناطيسي واتركها لمدة 2 دقيقة. ثم استنشق برفق المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية.
  6. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق حبيبات خلية الخرز بإضافة 3 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب ، والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  7. استبدل الأنبوب الموجود على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة قبل استنشاق المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية.
  8. كرر الغسلات (الخطوة 5.6-5.7) 4 مرات أو أكثر حتى يبدو العنصر الطافي صافيا.
  9. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق حبيبات خلايا الخرز في وسط نمو كامل سعة 3 مل وانقلها إلى دورق T-75. أضف 7 مل من وسط النمو الكامل ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪.
  10. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا باستخدام HBSS / CMF ، ثم أضف 10 مل من الوسط الكامل الطازج. استبدل الوسائط ب 10 مل من الوسط الكامل الطازج كل 2-3 أيام حتى تتلاقى 90-95٪. بمجرد أن تتلاقى الخلايا البطانية بالكامل ، فإنها تكون جاهزة للتجربة. لا ينبغي استخدام الخلايا بعد الممر السادس حيث قد تحدث الشيخوخة ، وقد تتولى أنواع الخلايا الأخرى.

6. تأكيد علامات سطح الخلية البطانية عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. بعد استخدام محلول انفصال الخلايا الخالي من التربسين لفصل الخلايا ، أعد تعليق حبيبات الخلية إلى 1 × 10 5 خلايا / مل و aliquot 100 μL من تعليق الخلية في ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة1.5 مل ، تحمل العلامات 1 و 2 و 3.
  2. اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS. أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل وكرر مرتين.
  3. أعد تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من 1x PBS. إلى الأنبوب 1 ، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق المضاد للفأر CD-31 (PECAM-1) (على سبيل المثال: phycoerythrin (PE) الجسم المضاد CD-31 المضاد للفئران) و 1 ميكرولتر من CD-102 المضاد للفأر المترافق (ICAM-2) (على سبيل المثال: فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) الجسم المضاد CD102 المضاد للفأر) (انظر جدول المواد). إلى الأنبوب 2 ، أضف عناصر التحكم المناسبة في النمط المتماثل. سيبقى الأنبوب رقم 3 غير ملوث.
  4. احتضان الأنابيب على الجليد وفي الظلام لمدة 30-45 دقيقة.
  5. أضف 1 مل من PBS إلى كل أنبوب ، دوامة برفق ، وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إزالة غسل وكرر ثلاث مرات. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 500 ميكرولتر من PBS.
  6. احتفظ بالأنابيب مغطاة بورق الألمنيوم عند 4 درجات مئوية حتى التحليل. يجب إكمال التحليل في غضون 3-4 ساعات.
  7. الحصول على بيانات التدفق باستخدام مقياس الخلايا. استخدم عينة غير ملوثة كعنصر تحكم سلبي لضبط جهد الليزر بشكل صحيح وفقا للتألق الذاتي للخلية. بوابة إجمالي عدد الخلايا مع مؤامرة مبعثرة إلى الأمام ومخطط مبعثر جانبي.
    ملاحظة: بعد استبعاد الخلايا المزدوجة ، يتم تعريف الخلايا المزدوجة CD31 + CD102 + على أنها خلايا بطانية.

Representative Results

يسمح هذا البروتوكول البسيط للمرء بعزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للفأر وزراعتها وتوصيفها على مدار 7-10 أيام (الشكل 1). باختصار ، يتم استئصال الرئتين وهضمها إنزيميا قبل الطلاء. مباشرة بعد الطلاء ، سوف تطفو الخلايا البطانية والخلايا الأخرى في وسائط زراعة الخلايا. بحلول اليوم التالي ، سيتم التصاق الخلايا البطانية والخلايا الملوثة باللوحة ، وهناك حاجة إلى تقنية غسيل قوية لإزالة الحطام والخلايا العائمة. بمجرد أن تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، يتم إجراء أول اختيار مناعي. ثم تبدأ الخلايا الموجبة CD-31 في النمو في تكوين حصوي (الشكل 2). الخلايا التي لا تحتوي على مورفولوجيا الحصاة أو النمو الزائد هي ملوثات وليست خلايا بطانية13،14،15،16.

ثم يتم إجراء اختيار مناعي ثان باستخدام حبات مغلفة مضادة ل CD-102 لزيادة نقاء الخلايا البطانية ، على غرار البروتوكولات الأخرى13,16. يمكن بعد ذلك استخدام الخلايا التي نمت إلى نقطة التقاء بعد الانتقاء المناعي الثاني للتجريب. يستخدم فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للتأكد من أن عدد الخلايا إيجابي CD-31 و CD-102 (الشكل 3).

يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا البطانية في العديد من التطبيقات ، مثل دراسة المسارات الالتهابية البطانية ووظيفة الحاجز البطاني. على سبيل المثال ، لوحظ أن العلاج باستخدام مزيج الفئران الخلوي (IFNg و TNFa و IL1b ، كل منها عند 10 نانوغرام / مل) تسبب في إنتاج IL-6 بواسطة الخلايا البطانية (الشكل 4 أ). ثم تم استخدام استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS) 18 لقياس المقاومة عبر البطانية (TER) لتدفق التيار الكهربائي عبر الطبقات الأحادية للخلايا البطانية لرئة الفئران. وقد لوحظ أن الخلايا المعالجة ب cytomix أدت إلى انخفاض في TER (الشكل 4B) ، وهو ما يتوافق مع زيادة نفاذية البطانة. توضح هذه الأمثلة كيف يمكن للخلايا البطانية المحضرة باستخدام هذا البروتوكول دراسة العمليات البطانية المختلفة. وهذا يسمح للباحثين بدراسة الجينات ذات الأهمية في الخلايا البطانية بسهولة أكبر ، بالنظر إلى الأعداد المتزايدة باستمرار من الفئران الضربة القاضية والمعدلة وراثيا.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لعزل الخلايا البطانية لرئة الفئران. يتم حصاد الرئتين من الجراء حديثي الولادة من 5-7 أيام ومفرومة. تم هضم الأنسجة المفرومة إنزيميا باستخدام كولاجيناز I. التعليق الخلوي مطلي ومثقف لمدة 2-3 أيام. ثم تخضع الخلايا لعزل مناعي أولي مع حبات مغلفة ب CD-31 ويتم استزراعها لمدة 3-4 أيام أخرى. عزل مناعي ثان مع حبات مغلفة ب CD-102 قبل زراعة 2-3 أيام أخرى. الخلايا جاهزة الآن للتجارب الوظيفية. تم إنشاء الصورة بواسطة أداة توضيح على شبكة الإنترنت ، Biorender. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مورفولوجيا الخلايا البطانية لرئة الفأر. تظهر الخلايا البطانية لرئة الفئران المستزرعة مورفولوجيا مرصوفة بالحصى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل الخلايا البطانية عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ) يتم تمثيل جميع الأحداث على مخطط نقطي للتشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC). (ب) تأكيد مخطط التشتت لكون الخلايا البطانية لرئة الفئران موجبة لكل من مولدات الضد السطحية الخلوية الخاصة بالبطانة CD-31 وCD-102. (ج) الرسم البياني لعينة النمط المتماثل والعينة الملطخة بجسم مضاد محدد CD-31 / CD-102. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يحفز Cytomix إنتاج الخلايا البطانية لرئة الفئران IL-6 ونفاذية الخلايا البطانية. عولجت الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في رئة الفئران من الفئران C57BL / 6 باستخدام cytomix (IFNg و TNFa و IL1b ، كل منها عند 10 نانوغرام / مل). (أ) تم بعد ذلك تحديد مستويات IL-6 في طافات الاستزراع عند 15 ساعة (** p < 0.01 ، n = 4 آبار / حالة). (ب) استخدم استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية لقياس المقاومة عبر البطانية (TER) بشكل متكرر على مدار 15 ساعة. تم تطبيع البيانات للمقاومة مباشرة قبل إضافة cytomix كما هو محدد وتم تحليلها من خلال تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار Tukey البعدي19 (** p < 0.01 ، n = 4 آبار / حالة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هذا البروتوكول البسيط يفسح المجال للخلايا البطانية عالية النقاء من رئتي الفئران. على الرغم من أن الوقت الإجمالي من البداية إلى النهاية هو 7-10 أيام ، إلا أن الوقت العملي يبلغ حوالي 3-4 ساعات. بالمقارنة مع الطرق الأخرى13،14،15،16 ، يتم تبسيط البروتوكول الحالي ، مع الحفاظ على الخطوات الأساسية دون المساس بالعائد والنقاء.

تجدر الإشارة إلى بعض الجوانب الحاسمة لهذا البروتوكول. أولا ، من المهم استخدام الجراء حديثي الولادة بدلا من الفئران البالغة. في تجربتنا ، لا تتكاثر الخلايا البطانية من الفئران البالغة بسهولة مثل الخلايا من الجراء حديثي الولادة ، ويمكن تجاوزها بسهولة بواسطة خلايا ذات مورفولوجيا تشبه المغزل تتفق مع الخلايا الليفية أو الخلايا الجذعية الوسيطة15,16. أحد التفسيرات المحتملة للاختلاف هو أن نمو الرئة في المرحلة السنخية في الفئران الوليدية ، والتي تتميز بالانتشار السريع للخلايا البطانية20. قد يكون هناك أيضا درجة معينة من الشيخوخة مع الشيخوخة21. يجب أن يكون وقت الهضم الأنزيمي دقيقا أيضا ، حيث يمكن أن يؤدي نقص الهضم إلى تعليق خلية واحدة منخفض العائد. في المقابل ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم إلى كمية كبيرة من موت الخلايا. لقد قررنا أن الوقت الأمثل لهضم كولاجيناز هو 45 دقيقة. ثم يتبع ذلك تفكك ميكانيكي بقنية حادة. كما تم الإبلاغ عن غرس كولاجيناز داخل القصبة الهوائية أثناء الهضم الأنزيمي14,15 ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق هذا وقتا طويلا ويؤدي إلى هضم غير مكتمل أثناء العمل الحالي. أخيرا ، تنتقل بعض البروتوكولات مباشرة إلى عزل immunobead مباشرة بعد الهضم الأنزيمي13,16. لقد وجدنا أن زراعة الخلايا من الرئة المنفصلة في الوسط لمدة يوم أو يومين قبل إجراء اختيار immunobead يزيد بشكل كبير من إنتاج الخلايا البطانية القابلة للحياة والنقية للغاية. قد يكون هذا مرتبطا بسرعة إدخال الخلايا المعزولة في وسط زراعة الأنسجة ، مما يؤدي إلى موت أقل للخلايا في المراحل المبكرة بعد إزالتها من الفئران ، وكثافة بذر أولية أعلى ، ووقت التصاق الخلايا البطانية وتتكاثر قبل أول عزل مناعي.

حدود إعداد وتحليل الخلايا البطانية للفأر هي كما يلي. يوفر كل ماوس عددا محدودا فقط من الخلايا التي يجب استخدامها في غضون مقاطع قليلة. يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تجميع هضم الرئة من عدة فئران. لسوء الحظ ، لم ننجح في جهودنا للحفاظ على الخلايا بالتبريد وإذابتها لاستخدامها في المستقبل. على الرغم من هذه القيود ، فإن الخلايا البطانية للفأر لها بعض المزايا. يمكن أن تكون مفيدة ، لا سيما في الحالات التي لا يمكن فيها استخدام الخلايا البطانية البشرية (على سبيل المثال ، الضربة القاضية الجينية) ، عندما تكون هناك حاجة إلى دراسات تكميلية لتأكيد النتائج مع الخلايا البشرية ، أو عندما يؤدي عدم تجانس استجابات الخلايا البطانية من متبرعين بشريين مختلفين إلى جعل التكاثر بين التجارب مشكلة6. يسمح عدد الخلايا البطانية المتجانسة من الفئران المتطابقة وراثيا بالتكاثر بين التجارب ودراسة جينات ومسارات محددة في ظل ظروف خلفية مستقرة.

يمكن استخدام الخلايا البطانية للفأر لتطبيقات متعددة لتوفير رؤى حول التنشيط البطاني والخلل الوظيفي في عمليات المرض المختلفة. على سبيل المثال ، تلعب الخلايا البطانية دورا أساسيا في الإنتان ، حيث تساهم في كل من الاستجابات المفيدة والمرضية من خلال أدوارها في تنشيط الالتهاب الموضعي والجهازي ، وتعزيز الاتجار بالكريات البيض وتنشيطها في الأنسجة ، وتنظيم التخثر ، وتعديل نفاذية البطانة2،22،23. يوفر هذا البروتوكول البسيط خلايا بطانية وظيفية قابلة للحياة يمكن استخدامها في المقايسات لكل من هذه العمليات البطانية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل NIH T32GM008440 (JH / EW) و NIH R01AI058106 (JH). نحن نعترف بنواة قياس التدفق الخلوي UCSF Parnassus (RRID: SCR_018206) المدعومة جزئيا من قبل Grant NIH P30 DK063720 ومنحة الأجهزة NIH S10 S10 1S10OD021822-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL conicals Corning Life Sciences 430829
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies, Inc AT-104
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" Becton Disckinson 305122
BioRender.com BioRender
Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" Covidien 8881202314
CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) BD Biosciences 553326
CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) BD Biosciences 557355
Collagenase, Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004194
DMEM, high glucose Gibco 11965092
Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Invitrogen 11035
Endothelial Cell Growth Supplment EMD Millipore Corp 02-102
Falcon cell strainers (70 µm) Corning Life Sciences 352350
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10082-147
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-10
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20B
FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) BD Biosciences 557444
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) BD Biosciences 553929
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175095
Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) Medline 0409-2720-02
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3393
HEPES (1 M) Gibco 15630106
Nonessential amino acids (100x) Gibco 11140050
PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) BD Biosciences 553373
PE Rat IgG2a,  κ Isotype Control R35-95) BD Biosciences 553930
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) Gibco 15140122
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine IL-1β Peprotech 211-11B
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A
Round bottom polystyrene test tubes Corning Life Sciences 352058
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL Millipore S2GPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Milipore SCGP00525
Sterile syringe (10 mL) Fisher Scientific 14-955-459
Sterile syringe (20 mL) Fisher Scientific 14-955-460
T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated Corning Life Sciences 3290

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
  2. Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
  3. Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
  4. Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
  5. Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
  6. Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
  7. Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
  8. Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  9. Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
  10. Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
  11. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  12. Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
  13. Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
  14. Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
  15. Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
  16. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
  17. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
  18. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  19. Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
  20. Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
  21. Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
  22. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).
  23. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).

Tags

المناعة والعدوى العدد 177
عزل الخلايا البطانية لرئة الفأر الأولية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J.… More

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (177), e63253, doi:10.3791/63253 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter