Summary
В этой статье первичные эндотелиальные клетки легких были выделены и культивированы у новорожденных мышей.
Abstract
Эндотелиальные клетки играют решающую роль в регуляции сосудистого тонуса, иммунитета, коагуляции и проницаемости. Эндотелиальная дисфункция возникает при таких заболеваниях, как диабет, атеросклероз, сепсис и острое повреждение легких. Надежный и воспроизводимый метод выделения чистых эндотелиальных клеток у мышей необходим для исследования роли эндотелиальных клеток в патогенезе этих и других состояний. В этом протоколе микрососудистые эндотелиальные клетки легких были получены от 5-7-дневных новорожденных мышей. Легкие собирают, измельчают и ферментативно переваривают с помощью коллагеназы I, а высвобожденные клетки культивируют в течение ночи. Затем эндотелиальные клетки отбираются с использованием анти-PECAM1 (CD-31) IgG, конъюгированного с магнитными шариками, и клетки снова культивируются до слияния. Затем происходит вторичный отбор клеток с помощью анти-ICAM2 (CD-102) IgG, конъюгированного с магнитными шариками, чтобы повысить чистоту эндотелиальных клеток, и клетки снова культивируются до слияния. Весь процесс занимает примерно 7-10 дней, прежде чем клетки можно будет использовать для экспериментов. Этот простой протокол дает высокочистые (чистота >92%) эндотелиальные клетки, которые могут быть немедленно использованы для исследований in vitro , включая исследования, посвященные выработке эндотелиальных цитокинов и хемокинов, лейкоцитарно-эндотелиальным взаимодействиям, путям эндотелиальной коагуляции и проницаемости эндотелия. При наличии множества нокаутов и трансгенных линий мышей эта процедура также позволяет понять функцию специфических генов, экспрессируемых эндотелиальными клетками, в здоровых и патологических реакциях на травму, инфекцию и воспаление.
Introduction
Интерес к изучению эндотелия сосудов возрос в последнее время, так как дисфункция микрососудистых эндотелиальных клеток возникает при множественных заболеваниях человека, таких как инсульт, сердечно-сосудистые заболевания, диабет, острое повреждение легких, сепсис и неинфекционные повреждения 1,2,3,4,5. Чтобы определить патогенез этих состояний и понять роль специфических генов в защитных и нерегулируемых реакциях эндотелиальных клеток, необходимы надежные методы выделения и культивирования микрососудистых эндотелиальных клеток высокой чистоты у мышей. В то время как во многих исследованиях используются эндотелиальные клетки человека, такие как эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) или микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HMVEC), существует множество причин для использования эндотелиальных клеток мыши для изучения функции эндотелия и дисфункции. Во-первых, существует значительная гетерогенность в ответах эндотелиальных клеток от разных доноров человека, что приводит к вариабельности результатов между отдельными экспериментами 6,7,8. Во-вторых, подавление генов-мишеней в первичных клеточных линиях человека также может привести к вариабельным уровням экспрессии белка 9,10. Напротив, существует минимальная гетерогенность в ответах эндотелиальных клетокмыши 11, предполагая, что генетический фон одинаков между исследуемыми группами. Кроме того, большое количество эндотелиальных клеток мыши может быть получено путем объединения легких нескольких новорожденных мышей. Эти факторы позволяют получить более последовательные и воспроизводимые результаты между экспериментами. Наконец, наличие нокаутных или трансгенных мышей также обеспечивает изоляцию типов клеток, в которых отсутствуют интересующие белки.
Значительные проблемы с выделением здоровых и чистых популяций эндотелиальных клеток легких мышей с использованием опубликованных методов 12,13,14,15,16 привели к разработке более надежного и простого метода выделения высококачественных микрососудистых эндотелиальных клеток легких мыши. Преимущества текущего протокола включают использование неонатальных мышей, которые легко доступны, ограничивая расходы на животноводство и содержание. Кроме того, по нашему опыту, жизнеспособность эндотелиальных клеток новорожденных мышей значительно выше, чем эндотелиальных клеток, полученных от взрослых мышей. Поскольку новорожденные мыши имеют маленькую легочную ткань, эндотелиальные клетки могут быть собраны путем переваривания иссеченных легких в коллагеназу, а не с помощью трахеальной инстилляции коллагеназы, которая рекомендуется для сбора у взрослых мышей16. Это также сокращает время между эвтаназией мышей и попаданием их эндотелиальных клеток в питательные среды и инкубатор, не влияя на чистоту, выход или воспроизводимость эндотелиальных реакций. Наконец, чистые клеточные популяции были выделены без проточной цитометрии, что может повредить или привести к снижению выхода эндотелиальных клеток14,15,17.
Текущий модифицированный протокол последовательно приводит к высокой чистоте и жизнеспособным эндотелиальным клеткам за 7-10 дней, которые могут быть немедленно использованы для экспериментов in vitro . Выделение клеток непосредственно от нокаутированных животных также сводит к минимуму манипуляции с клетками перед экспериментами. Эти методы могут быть использованы для изучения роли различных белков в функции эндотелия, чтобы обнаружить терапевтические мишени на основе эндотелия для множественных заболеваний.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Для исследования использовали детенышей новорожденных мышей мужского пола C57BL/6 (возраст 5-7 дней). Весь протокол занимает 7-10 дней (рис. 1).
1. Подготовка среды эндотелиальных клеток
- Подготовьте базальную среду: модифицированную среду Dulbecco Eagle с 4,500 мг / л глюкозы и 4 мМ L-глютамина (DMEM) с добавлением 20% (об. / об.) инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ЕД/100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина и 25 мМ HEPES (см. Таблицу материалов). Стерильный фильтр с фильтром 22 мкМ. Храните базальную среду при температуре 4 °C и используйте в течение месяца после приготовления.
- Подготовьте полную среду: базальную среду с добавлением 100 мкг/мл гепарина, 100 мкг/мл добавки для роста эндотелиальных клеток, 1x заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата натрия (см. Таблицу материалов). Стерильный фильтр с фильтром 22 мкМ. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение месяца после приготовления.
2. Предварительное покрытие антикрысиных магнитных шариков13
- Сделайте 50 мл буфера для промывки шариков: фосфатно-буферный раствор (PBS) с добавлением 0,1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA). Стерильный фильтр с фильтром 22 мкМ хранить при температуре 4 °C и использовать в течение месяца после приготовления.
- Встряхните магнитные шарики в течение нескольких секунд, чтобы ресуспендировать шарики, и пипетка 50 мкл шариков (2 x 107 шариков) в две микроцентрифужные пробирки по 1,5 мл, одну для CD-31 и одну для CD-102 (см. Таблицу материалов). Добавьте 1 мл буфера для промывки шариков и хорошо перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все указанные объемы были использованы для выделения эндотелиальных клеток у 3-4 детенышей новорожденных мышей (5-7 дней). CD-31 и CD-102 являются поверхностными маркерами эндотелиальных клеток, используемыми для магнитной иммуноферментной селекции. - Поместите трубки на магнитный сепаратор и удалите надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки. Повторяйте стирку 3 раза с 1 мл буфера для стирки шариков каждый раз.
- Ресуспендируйте шарики в исходном объеме шарика, 50 мкл, с буфером для промывки шариков. Затем добавьте 5 мкл (2,5 мкг) антитела (CD-31 / CD-102) к каждым 50 мкл шариков.
- Инкубируйте суспензию шариков при осторожном вращении на ротаторе в течение ночи при температуре 4 °C или в течение 3 ч при комнатной температуре. Повторите стирку 4 раза.
- Ресуспендировать иммуногранулы в исходном объеме 50 мкл с буфером для промывки шариков и хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение 1-2 недель.
3. Изоляция и покрытие клеток легких
- Приготовьте раствор коллагеназы 1-го типа в день изоляции: добавьте 25 мг коллагеназы 1-го типа к 25 мл HBSS (см. Таблицу материалов). Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч с мягким вращением и стерильным фильтром с использованием фильтра 22 мкМ. Хранить раствор в тепле при температуре 37 °C.
- За 10 минут до эвтаназии внутримышечно внутримышечно вводят гепарин (25 мкл / мышь, 1,000 ЕД / мл), чтобы свести к минимуму активацию эндотелиальных клеток и образование сгустка14,15.
- Усыпьте детеныша мыши с обезглавливанием острыми ножницами в соответствии с Рекомендациями AVMA по эвтаназии 2020 года. Затем прикрепите мышь к диссекционной доске брюшной стороной вверх.
- Опрыскайте тушку 70% этанолом, затем обнажив грудную полость, сначала разрезав диафрагму, а затем разрезав вверх вдоль всех боковых стенок грудной клетки. Отражение грудной клетки назад обнажает сердце и легкие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меньшие щипцы и ножницы для этого шага, учитывая небольшой размер новорожденных мышей, и убедитесь, что вы не прокалываете сердце или легкие, так как это приведет к недостаточному удалению крови из легких. - Прикрепите иглу 25 г к шприцу объемом 10 мл и введите 5 мл холодного DMEM в правый желудочек сердца, чтобы удалить кровь из легких. Легкие побелеют.
- Удаляйте легкие из грудной полости, по одной доле за раз, разрезая доли дистальнее соответствующих бронхов.
- Объедините все доли легких в коническую трубку объемом 50 мл, предварительно заполненную 20 мл ледяной базальной среды (начиная с шага 1.1).
- Повторите шаги 3.2-3.7 с другими детенышами мыши, объединив все доли легких в одну и ту же коническую трубку объемом 50 мл.
- Аккуратно помешивайте трубку вручную в течение 10-15 с, чтобы смыть излишки эритроцитов, визуально оцененные на поверхности легких.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять всю кровь из легких или вокруг них; Однако это улучшает чистоту. Любая дальнейшая обработка тканей должна производиться в стерильном капюшоне. - Используйте клеточное ситечко, чтобы удалить легкие из среды, и перенесите ткань в стерильную одноразовую чашку для культивирования тканей диаметром 100 мм и измельчите стерилизованными ножницами.
- Перенесите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 50 мл с 25 мл предварительно подогретого раствора коллагеназы (этап 3.1). Осторожно перемешивайте на вращающемся миксере в течение 45 минут при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное переваривание даже в течение 60 минут может привести к снижению урожайности. - Присоедините шприц объемом 20 мл к тупой канюле весом 15 г (см. Таблицу материалов) и тритуируйте суспензию 10-15 раз, чтобы разбить ткань на клеточную суспензию. Будьте энергичны, но избегайте чрезмерного вспенивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Больше не будет видно кусочков легкого, и вместо этого приостановка будет мутной после завершения этого шага. - Отфильтруйте суспензию через клеточный фильтр 70 мкм в свежую коническую пробирку объемом 50 мл. Далее промойте коническую трубку, используемую для пищеварения, и клеточный фильтр дополнительными 15 мл базальной среды.
- Центрифугу клеточной суспензии при 400 х г в течение 8 мин при 4 °С.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки и ресуспендируйте гранулу в 2 мл полной среды. Переложите в колбу Т-75 и добавьте 8 мл полной средней культуры при 37 ° C в увлажненном 5% инкубаторе CO2 .
- На следующий день дважды промойте колбы 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка без кальция и магния (HBSS / CMF) (см. Таблицу материалов) и добавьте 10 мл полной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2-3 дня культура будет на 90-95% сливаться и готова к первичному выделению иммуногранул.
4. Первичное выделение иммуногранул и культивирование эндотелиальных клеток
- Дважды промойте адгезивные эндотелиальные клетки 10 мл Hbss / CMF. Добавьте 2 мл раствора для отслоения клеток, не содержащего трипсина (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 ° C в течение ~ 5 мин. Убедитесь, что все ячейки извлечены из колбы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо трипсина необходимо использовать раствор для отслоения трипсина, так как трипсин может нарушить маркер адгезии клеточной поверхности CD-31. - Добавьте 8 мл базальной среды, чтобы нейтрализовать раствор для отслоения клеток и перенести содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл. Отжим при 400 x g в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки и ресуспендируйте клетки в 2 мл базальной среды. Перенесите суспензию ячеек объемом 2 мл в полистирольную трубку с круглым дном объемом 5 мл (см. Таблицу материалов).
- Шарики с вихревым покрытием против CD-31 в течение нескольких секунд, чтобы ресуспендировать шарики, и добавьте 30 мкл шариков на каждые 2 мл клеточной суспензии. Закрепите крышку.
- Инкубируйте пробирку в течение 10 минут при комнатной температуре на ротаторе. Затем поместите пробирки на магнитный сепаратор и оставьте на 2 мин.
- Аккуратно с помощью стеклянной пастеровской пипетки аспирируйте надосадочную жидкость. Извлеките трубку из магнита, ресуспендируйте гранулу шариковой ячейки, добавив в пробирку 3 мл базальной среды, и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз.
- Замените трубку на магнитном сепараторе на 2 мин, а затем тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
- Повторите промывку (шаг 4.6-4.7) не менее 4 раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной.
- После окончательной промывки ресуспендируйте гранулу шариковых клеток в 3 мл полной питательной среды и перенесите ее в колбу Т-75. Добавьте 7 мл полной питательной среды и инкубируйте при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 .
- На следующий день промойте клетки HBSS / CMF, затем добавьте 10 мл свежей полной среды. Заменяйте среду 10 мл свежей полной среды каждые 2-3 дня до тех пор, пока не вытечет 90-95%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только клетки сливаются на ~ 90-95%, что занимает ~ 3-4 дня, культура готова к выделению вторичных иммуногранул.
5. Выделение вторичных иммуногранул и культивирование эндотелиальных клеток
- Дважды промойте прилипшие эндотелиальные клетки 10 мл HBSS/CMF. Добавьте 2 мл раствора для отслоения клеток, не содержащего трипсина, и инкубируйте при 37 ° C в течение ~ 5 мин. Убедитесь, что все ячейки извлечены из колбы.
- Добавьте 8 мл базальной среды для нейтрализации раствора для отслоения клеток и переведите в коническую пробирку объемом 15 мл. Отжим при 400 x g в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки и ресуспендируйте клетки в 2 мл базальной среды. Перенесите суспензию ячеек объемом 2 мл в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
- Шарики с вихревым покрытием против CD-102 в течение нескольких секунд, чтобы ресуспендировать шарики, и добавьте 30 мкл шариков на каждые 2 мл клеточной суспензии. Закрепите крышку.
- Инкубируйте пробирку в течение 10 минут при комнатной температуре на ротаторе «конец к концу». Поместите пробирки на магнитный сепаратор и оставьте на 2 мин. Затем аккуратно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
- Извлеките трубку из магнита, ресуспендируйте гранулу шариковой ячейки, добавив в пробирку 3 мл базальной среды, и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз.
- Замените трубку на магнитном сепараторе на 2 минуты, прежде чем осторожно отсасывать надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера.
- Повторите промывку (шаг 5.6-5.7) 4 раза или более до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной.
- После окончательной промывки ресуспендируйте гранулу шариковых клеток в 3 мл полной питательной среды и перенесите ее в колбу Т-75. Добавьте 7 мл полной питательной среды и инкубируйте при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 .
- На следующий день промойте клетки HBSS / CMF, затем добавьте 10 мл свежей полной среды. Заменяйте среду 10 мл свежей полной среды каждые 2-3 дня до тех пор, пока не вытечет 90-95%. Как только эндотелиальные клетки полностью сливаются, они готовы к экспериментам. Клетки не следует использовать после шестого прохода, так как может произойти старение, и другие типы клеток могут взять верх.
6. Подтверждение маркеров поверхности эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии
- После использования раствора для отсоединения клеток, не содержащего трипсина, для отделения клеток ресуспендируют клеточную гранулу до 1 x 10 5 клеток / мл и аликвотируют 100 мкл клеточной суспензии в три микроцентрифужные пробирки по1,5 мл, меченные 1, 2 и 3.
- Промойте клетки 1 мл 1x PBS. Центрифуга при 500 x g в течение 2 мин при 4 °C. Снимите буфер для стирки и повторите дважды.
- Ресуспендировать гранулу ячейки в 100 мкл 1x PBS. В пробирку 1 добавьте 1 мкл конъюгированного антитела против мыши CD-31 (PECAM-1) (например, антитело к фикоэритрину (ПЭ) против мышиного CD-31) и 1 мкл конъюгированного антитела против мыши CD-102 (ICAM-2) (например, антитело против CD102 против флуоресцеина изотиоцианата (FITC)) (см. Таблицу материалов). К трубке 2 добавьте соответствующие элементы управления изотипом. Тюбик No3 останется неокрашенным.
- Инкубируйте пробирки на льду и в темноте в течение 30-45 минут.
- Добавьте по 1 мл PBS в каждую пробирку, осторожно встряхните и центрифугу при 500 x g в течение 2 мин при 4 ° C. Снимите смойте и повторите три раза. Ресуспендировать конечную гранулу в 500 мкл PBS.
- Держите пробирки покрытыми алюминиевой фольгой при температуре 4 °C до анализа. Анализ должен быть завершен в течение 3-4 часов.
- Получите данные о потоке с помощью цитометра. Используйте неокрашенный образец в качестве отрицательного контроля, чтобы правильно установить напряжение лазера в соответствии с автофлуоресценцией клетки. Общее количество ячеек с прямой рассеянной диаграммой и боковой диаграммой рассеяния.
ПРИМЕЧАНИЕ: После исключения дублетов двойные положительные клетки CD31+ CD102+ определяются как эндотелиальные клетки.
Representative Results
Этот простой протокол позволяет выделять, культивировать и характеризовать микрососудистые эндотелиальные клетки мыши в течение 7-10 дней (рис. 1). Вкратце, легкие иссекаются и ферментативно перевариваются перед покрытием. Сразу после нанесения покрытия эндотелиальные клетки и другие клетки будут плавать в средах для культивирования клеток. К следующему дню эндотелиальные клетки и загрязняющие клетки будут приклеены к пластине, и для удаления мусора и плавающих клеток потребуется энергичная техника промывки. Как только клетки достигают слияния, выполняется первый отбор иммуногранул. Затем CD-31-положительные клетки начинают расти в булыжном образовании (рис. 2). Клетки, которые не имеют морфологии булыжника или разрастаются, являются загрязнителями, а не эндотелиальными клетками13,14,15,16.
Затем проводится второй отбор иммуногранул с использованием шариков с покрытием против CD-102 для повышения чистоты эндотелиальных клеток, аналогично другим протоколам13,16. Клетки, которые выросли до слияния после второго отбора иммуногранул, затем могут быть использованы для экспериментов. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) используется для подтверждения того, что клеточная популяция является CD-31- и CD-102-положительной (рис. 3).
Эти эндотелиальные клетки затем могут быть использованы для многих применений, таких как изучение воспалительных путей эндотелия и функции эндотелиального барьера. Например, было замечено, что лечение мышиным цитомиксом (IFNg, TNFa и IL1b, каждый в дозе 10 нг / мл) индуцировало продукцию IL-6 эндотелиальными клетками (рис. 4A). Затем для измерения трансэндотелиального сопротивления (TER) к потоку электрического тока через монослои эндотелиальных клеток легких мышей использовали Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 . Было замечено, что клетки, обработанные цитомиксом, приводили к снижению TER (рис. 4B), что согласуется с повышенной проницаемостью эндотелия. Эти примеры иллюстрируют, как эндотелиальные клетки, полученные с использованием этого протокола, могут изучать различные эндотелиальные процессы. Это позволяет исследователям легче изучать гены, представляющие интерес в эндотелиальных клетках, учитывая постоянно растущее число доступных нокаутных и трансгенных мышей.
Рисунок 1: Схема выделения эндотелиальных клеток легких мышей. Легкие 5-7-дневных новорожденных щенков собирают и измельчают. Измельченную ткань ферментативно расщепляют с помощью коллагеназы I. Клеточную суспензию покрывают и культивируют в течение 2-3 дней. Затем клетки подвергаются первичной изоляции иммуногранул с шариками, покрытыми CD-31, и культивируются еще 3-4 дня. Второе выделение иммуногранул с шариками, покрытыми CD-102, перед культивированием еще 2-3 дня. Теперь клетки готовы к функциональным экспериментам. Изображение было создано с помощью веб-инструмента для создания иллюстраций Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфология эндотелиальных клеток легких мышей. Культивируемые мышиные эндотелиальные клетки легких демонстрируют булыжную морфологию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии. (A) Все события визуализируются на точечной диаграмме прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). (B) Точечная диаграмма подтверждает положительный результат эндотелиальных клеток легких мышей как на эндотелиально-специфические клеточные поверхностные антигены CD-31, так и на CD-102. (C) Гистограмма образца изотипа и образца, окрашенного специфическим антителом CD-31/CD-102. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Цитомикс индуцирует выработку IL-6 эндотелиальными клетками легких у мышей и проницаемость эндотелиальных клеток. Мышиные микрососудистые эндотелиальные клетки легких от мышей C57BL / 6 обрабатывали цитомиксом (IFNg, TNFa и IL1b, каждый в дозе 10 нг / мл). (A) Затем уровни IL-6 количественно определяли в культуральных супернатантах через 15 ч (**p<0,01, n = 4 лунки/состояние). (B) Для многократного измерения трансэндотелиального сопротивления (TER) в течение 15 часов использовалось электрическое измерение импеданса клетки-субстрата. Данные были нормализованы к резистентности непосредственно перед добавлением цитомикса в соответствии с назначением и были проанализированы с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки19 (**p<0,01, n = 4 лунки / состояние). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот простой протокол подходит для эндотелиальных клеток высокой чистоты из легких мышей. Хотя общее время от начала до конца составляет 7-10 дней, практическое время составляет около 3-4 часов. По сравнению с другими методами13,14,15,16 текущий протокол оптимизирован, сохраняя основные этапы без ущерба для выхода и чистоты.
Стоит отметить некоторые критические аспекты этого протокола. Во-первых, важно использовать новорожденных щенков, а не взрослых мышей. По нашему опыту, эндотелиальные клетки взрослых мышей размножаются не так легко, как клетки новорожденных щенков, и они легко заполонены клетками с веретенообразной морфологией, соответствующей фибробластам или мезенхимальным стволовым клеткам15,16. Одно из возможных объяснений этой разницы заключается в том, что развитие легких происходит на альвеолярной стадии у новорожденных мышей, характеризующейся более быстрой пролиферацией эндотелиальных клеток20. Также может быть некоторая степень старения с возрастом21 год. Время ферментативного переваривания также должно быть точным, так как недостаточное переваривание может привести к низкому выходу одноклеточной суспензии. Напротив, чрезмерное переваривание может привести к значительной гибели клеток. Мы определили, что оптимальное время для переваривания коллагеназы составляет 45 минут. Затем следует механическая диссоциация тупой канюлей. Также сообщалось о закапывании интратрахеальной коллагеназы во время ферментативного пищеварения14,15; Однако это может занять много времени и привести к неполному перевариванию во время текущей работы. Наконец, некоторые протоколы переходят непосредственно к выделению иммуногранул сразу после ферментативного переваривания13,16. Мы обнаружили, что культивирование клеток из диссоциированного легкого в среде в течение дня или двух перед отбором иммуногранул существенно увеличивает выход жизнеспособных и высокочистых эндотелиальных клеток. Это может быть связано со скоростью попадания изолированных клеток в среду для культивирования тканей, что приводит к меньшей гибели клеток на ранних стадиях после удаления у мышей, более высокой начальной плотности посева и времени для прилипания и размножения эндотелиальных клеток до первого выделения иммуногранул.
Ограничения препарата и анализа эндотелиальных клеток мыши заключаются в следующем. Каждая мышь предоставляет только ограниченное количество ячеек, которые необходимо использовать в течение нескольких проходов. Эту проблему можно преодолеть, объединив легочный дайджест от нескольких мышей. К сожалению, мы безуспешно пытаемся криоконсервировать и разморозить клетки для будущего использования. Несмотря на эти ограничения, эндотелиальные клетки мыши имеют некоторые преимущества. Они могут быть полезны, особенно в ситуациях, когда эндотелиальные клетки человека либо не могут быть использованы (например, нокаут генов), когда требуются дополнительные исследования для подтверждения результатов с клетками человека, либо когда гетерогенность ответов эндотелиальных клеток от разных доноров человека делает воспроизводимость между экспериментами проблематичной6. Гомогенная популяция эндотелиальных клеток генетически идентичных мышей обеспечивает воспроизводимость между экспериментами и изучением конкретных генов и путей в стабильных фоновых условиях.
Эндотелиальные клетки мыши можно использовать для различных применений, чтобы дать представление об активации эндотелия и дисфункции при различных процессах заболевания. Например, эндотелиальные клетки играют неотъемлемую роль в сепсисе, способствуя как полезным, так и патологическим реакциям благодаря своей роли в активации локализованного и системного воспаления, стимулировании транспорта и активации лейкоцитов в тканях, регулировании коагуляции и модуляции проницаемости эндотелия 2,22,23. Этот простой протокол обеспечивает жизнеспособные, функциональные эндотелиальные клетки, которые могут быть использованы в анализах для каждого из этих эндотелиальных процессов.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH T32GM008440 (JH/EW) и NIH R01AI058106 (JH). Мы признаем ядро проточной цитометрии UCSF Parnassus (RRID: SCR_018206), частично поддерживаемое грантом NIH P30 DK063720 и грантом NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
- Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
- Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
- Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
- Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
- Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
- Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
- Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
- Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
- Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
- Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
- Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
- Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H.
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
