Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63253
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care, UCSF Benioff Children's Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco

Summary

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Abstract

Las células endoteliales desempeñan un papel crítico en la regulación del tono vascular, la inmunidad, la coagulación y la permeabilidad. La disfunción endotelial ocurre en afecciones médicas que incluyen diabetes, aterosclerosis, sepsis y lesión pulmonar aguda. Se necesita un método confiable y reproducible para aislar células endoteliales puras de ratones para investigar el papel de las células endoteliales en la patogénesis de estas y otras afecciones. En este protocolo, se prepararon células endoteliales microvasculares pulmonares a partir de cachorros de ratón neonatales de 5-7 días de edad. Los pulmones se cosechan, se pican y se digieren enzimáticamente con colagenasa I, y las células liberadas se cultivan durante la noche. Las células endoteliales se seleccionan utilizando IgG anti-PECAM1 (CD-31) conjugada con perlas magnéticas, y las células nuevamente se cultivan para confluir. Luego se produce una selección celular secundaria con IgG anti-ICAM2 (CD-102) conjugada a perlas magnéticas para aumentar la pureza de las células endoteliales, y las células nuevamente se cultivan para confluencia. Todo el proceso toma aproximadamente 7-10 días antes de que las células puedan ser utilizadas para la experimentación. Este protocolo simple produce células endoteliales altamente puras (pureza >92%) que pueden usarse inmediatamente para estudios in vitro , incluidos los estudios centrados en la producción de citoquinas y quimiocinas endoteliales, interacciones leucocitos-endoteliales, vías de coagulación endotelial y permeabilidad endotelial. Con muchos knockouts y líneas de ratones transgénicos disponibles, este procedimiento también se presta para comprender la función de genes específicos expresados por las células endoteliales en respuestas sanas y patológicas a lesiones, infecciones e inflamación.

Introduction

El interés en el estudio del endotelio vascular ha crecido recientemente, ya que la disfunción de las células endoteliales microvasculares ocurre en múltiples enfermedades humanas, como accidentes cerebrovasculares, enfermedades cardiovasculares, diabetes, lesión pulmonar aguda, sepsis y lesiones no infecciosas 1,2,3,4,5. Para definir la patogénesis de estas condiciones y comprender los roles de genes específicos en las respuestas de células endoteliales protectoras y desreguladas, existe la necesidad de métodos confiables para aislar y cultivar células endoteliales microvasculares de alta pureza de ratones. Si bien muchos estudios utilizan células endoteliales humanas como las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) o las células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HMVEC), existen múltiples razones para usar células endoteliales de ratón para estudiar la función y disfunción endotelial. En primer lugar, existe una heterogeneidad considerable en las respuestas de las células endoteliales de diferentes donantes humanos, lo que conduce a la variabilidad en los resultados entre los experimentos individuales 6,7,8. En segundo lugar, el silenciamiento de las dianas génicas en líneas celulares humanas primarias también puede conducir a niveles variables de expresión de proteínas 9,10. En contraste, existe una heterogeneidad mínima en las respuestas de las células endoteliales de ratón11, asumiendo que el fondo genético es el mismo entre los grupos de estudio. Además, se puede preparar un gran número de células endoteliales de ratón agrupando pulmones de varios ratones neonatos. Estos factores permiten resultados más consistentes y reproducibles entre experimentos. Finalmente, la disponibilidad de ratones knockout o transgénicos también permite el aislamiento de tipos celulares que carecen de proteínas de interés.

Los considerables desafíos con el aislamiento de poblaciones sanas y puras de células endoteliales pulmonares de ratón utilizando métodos publicados 12,13,14,15,16 llevaron al desarrollo de un método más confiable y directo para aislar células endoteliales microvasculares de pulmón de ratón de alta calidad. Las ventajas del protocolo actual incluyen el uso de ratones neonatos, que están fácilmente disponibles, lo que limita los costos de cría de animales y alojamiento. Además, en nuestra experiencia, la viabilidad de las células endoteliales de ratones neonatos es sustancialmente mayor que las células endoteliales preparadas a partir de ratones adultos. Debido a que los ratones neonatos tienen tejido pulmonar pequeño, las células endoteliales se pueden recolectar digiriendo los pulmones extirpados en colagenasa en lugar de usar la instilación traqueal de colagenasa, que se recomienda para la recolección de ratones adultos16. Esto también reduce el tiempo entre la eutanasia de ratones y la obtención de sus células endoteliales en medios de cultivo celular y la incubadora sin afectar la pureza o el rendimiento o la reproducibilidad de las respuestas endoteliales. Por último, las poblaciones de células puras fueron aisladas sin citometría de flujo, lo que puede dañar o conducir a menores rendimientos de las células endoteliales14,15,17.

El protocolo modificado actual conduce consistentemente a células endoteliales viables y de alta pureza en 7-10 días que pueden usarse inmediatamente para experimentos in vitro . Aislar células directamente de animales knockout también minimiza la manipulación de las células antes de la experimentación. Estos métodos podrían usarse para investigar el papel de varias proteínas en la función endotelial para descubrir objetivos terapéuticos basados en endotelios para múltiples enfermedades.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco. Para el estudio se utilizaron crías de ratón neonatal macho C57BL/6 (edad 5-7 días). Todo el protocolo tarda de 7 a 10 días (Figura 1).

1. Preparación del medio celular endotelial

  1. Prepare el medio basal: Medio Eagle Modificado de Dulbecco con 4,500 mg/L de glucosa y 4 mM de L-Glutamina (DMEM) suplementado con 20% (v/v) de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 U/100 μg/mL de penicilina/estreptomicina y 25 mM de HEPES (ver Tabla de Materiales). Filtro estéril con filtro de 22 μM. Conservar el medio basal a 4 °C y utilizarlo en el plazo de un mes a partir de su preparación.
  2. Prepare el medio completo: Medio basal suplementado con 100 μg/mL de heparina, 100 μg/mL de suplemento de crecimiento celular endotelial, 1x aminoácidos no esenciales y 1 mM de piruvato de sodio (ver Tabla de Materiales). Filtro estéril con filtro de 22 μM. Conservar a 4 °C y utilizar en el plazo de un mes a partir de la preparación.

2. Prerecubrimiento de perlas magnéticas anti-rata13

  1. Hacer 50 ml de tampón de lavado de perlas: solución tamponada con fosfato (PBS) suplementada con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (p/v). Filtro estéril con filtro de 22 μM y conservar a 4 °C y utilizar en el plazo de un mes a partir de la preparación.
  2. Vaporizar las perlas magnéticas durante unos segundos para resuspender las perlas y pipetear 50 μL de las perlas (2 x 107 perlas) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, uno para CD-31 y otro para CD-102 (ver Tabla de materiales). Agregue 1 ml de tampón de lavado de perlas y mezcle bien.
    NOTA: Todos los volúmenes mencionados se utilizaron para aislar células endoteliales de 3-4 crías de ratón neonatales (5-7 días de edad). CD-31 y CD-102 son los marcadores de superficie celular endotelial utilizados para la selección de inmunoperlas magnéticas.
  3. Coloque los tubos en un separador magnético y retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. Repita el lavado 3 veces con 1 ml de tampón de lavado de perlas cada vez.
  4. Resuspender las perlas en el volumen original de la perla, 50 μL, con tampón de lavado de perlas. Luego agregue 5 μL (2.5 μg) de anticuerpo (CD-31/CD-102) a cada 50 μL de perlas.
  5. Incubar la suspensión del talón en una rotación suave en un rotador de extremo a extremo durante la noche a 4 °C o durante 3 h a temperatura ambiente. Repita el lavado 4 veces.
  6. Resuspender las inmunoperlas en el volumen original, 50 μL, con tampón de lavado de perlas y almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 1-2 semanas.

3. Aislamiento y recubrimiento de las células pulmonares

  1. Prepare la solución de colagenasa tipo 1 el día del aislamiento: Agregue 25 mg de colagenasa tipo 1 a 25 ml de HBSS (consulte la Tabla de materiales). Incubar a 37 °C durante 1 h con rotación suave y filtro estéril utilizando un filtro de 22 μM. Mantener la solución caliente a 37 °C.
  2. Inyectar cachorros de ratón de 5-7 días de edad por vía intramuscular con heparina (25 μL/ratón, 1.000 U/ml) 10 min antes de la eutanasia para minimizar la activación de las células endoteliales y la formación de coágulos14,15.
  3. Eutanasia al cachorro de ratón con decapitación usando tijeras afiladas de acuerdo con las Pautas AVMA 2020 para la eutanasia. Luego, fije el mouse a una placa de disección con el lado ventral hacia arriba.
  4. Rocíe la carcasa con etanol al 70%, luego exponga la cavidad torácica cortando primero el diafragma y luego cortando superiormente hacia arriba a lo largo de todas las paredes laterales del tórax. Reflejar la caja torácica en ese entonces expone el corazón y los pulmones.
    NOTA: Use fórceps y tijeras más pequeños para este paso dado el pequeño tamaño de los ratones neonatos, y asegúrese de no perforar el corazón o los pulmones, ya que esto conducirá a una extracción inadecuada de sangre de los pulmones.
  5. Conecte una aguja de 25 G a una jeringa de 10 ml e inyecte 5 ml de DMEM frío en el ventrículo derecho del corazón para extraer sangre de los pulmones. Los pulmones se volverán blancos.
  6. Retire los pulmones de la cavidad torácica, un lóbulo a la vez, cortando los lóbulos distales a los bronquios correspondientes.
  7. Agrupar todos los lóbulos pulmonares en un tubo cónico de 50 ml precargado con 20 ml de medio basal helado (a partir del paso 1.1).
  8. Repita los pasos 3.2-3.7 con los otros cachorros de ratón, agrupando todos los lóbulos pulmonares en el mismo tubo cónico de 50 ml.
  9. Agite suavemente el tubo a mano durante 10-15 s para lavar cualquier exceso de glóbulos rojos que se aprecie visualmente en la superficie de los pulmones.
    NOTA: No es necesario extraer toda la sangre de dentro o alrededor de los pulmones; Sin embargo, esto mejora la pureza. Cualquier manipulación adicional de tejidos debe realizarse en una campana estéril.
  10. Use un colador celular para extraer los pulmones del medio y transfiera el tejido a un plato de cultivo de tejido estéril y desechable de 100 mm de diámetro y pique con tijeras esterilizadas.
  11. Transfiera el tejido picado al tubo cónico de 50 ml con 25 ml de solución de colagenasa precalentada (paso 3.1). Agitar suavemente en una batidora giratoria durante 45 min a 37 °C.
    NOTA: La sobredigestión durante incluso 60 minutos puede conducir a rendimientos más bajos.
  12. Conecte una jeringa de 20 ml a una cánula roma de 15 G (consulte la Tabla de materiales) y triture la suspensión de 10 a 15 veces para romper el tejido en una suspensión celular. Sea vigoroso, pero evite la espuma excesiva.
    NOTA: Ya no habrá piezas visibles del pulmón y, en cambio, la suspensión estará turbia al completar este paso.
  13. Filtrar la suspensión a través de un filtro de células de 70 μm en un tubo cónico fresco de 50 ml. Además, enjuague el tubo cónico utilizado para la digestión y el colador celular con 15 ml adicionales de medio basal.
  14. Centrifugar la suspensión celular a 400 x g durante 8 min a 4 °C.
  15. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio y volver a suspender el pellet en 2 ml de medio completo. Pasar a un matraz T-75 y añadir 8 ml de cultivo medio completo a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% deCO2 .
  16. Al día siguiente, lave los frascos dos veces con 10 ml de la solución salina equilibrada de Hank sin calcio y magnesio (HBSS/CMF) (consulte la Tabla de materiales) y agregue 10 ml de medio completo.
    NOTA: Después de 2-3 días, el cultivo será 90-95% confluente y listo para el aislamiento primario de inmunoperlas.

4. Aislamiento primario de inmunoperlas y cultivo de células endoteliales

  1. Lave las células endoteliales adherentes dos veces con 10 mL HBSS/CMF. Añadir 2 ml de solución de desprendimiento celular libre de tripsina (ver Tabla de materiales) e incubar a 37 °C durante ~5 min. Asegúrese de que todas las celdas se han levantado del matraz.
    NOTA: Se debe usar una solución de desprendimiento sin tripsina en lugar de tripsina, ya que la tripsina puede interrumpir el marcador de adhesión de la superficie celular CD-31.
  2. Agregue 8 ml de medio basal para neutralizar la solución de desprendimiento celular y transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 ml. Girar hacia abajo a 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
  3. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio y resuspender las células en 2 ml de medio basal. Transfiera la suspensión de 2 ml de celda a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml (consulte la Tabla de materiales).
  4. Perlas recubiertas anti-CD-31 Vortex durante unos segundos para resuspender las perlas y añadir 30 μL de perlas por cada 2 ml de suspensión celular. Asegure la tapa.
  5. Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador de extremo a extremo. Luego coloque los tubos en un separador magnético y déjelos durante 2 minutos.
  6. Suavemente usando una pipeta Pasteur de vidrio, aspirar el sobrenadante. Retire el tubo del imán, resuspenda el pellet de células de perla agregando 3 ml de medio basal al tubo y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  7. Vuelva a colocar el tubo del separador magnético durante 2 minutos y, a continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
  8. Repita los lavados (paso 4.6-4.7) al menos 4 veces hasta que el sobrenadante parezca claro.
  9. Después del lavado final, resuspender el pellet de células de perla en un medio de crecimiento completo de 3 ml y transferirlo a un matraz T-75. Añadir 7 ml del medio de cultivo completo e incubar a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
  10. Al día siguiente, lave las celdas con HBSS/CMF, luego agregue 10 ml de medio completo fresco. Reemplace los medios con 10 ml de medio completo fresco cada 2-3 días hasta que el 90-95% sea confluente.
    NOTA: Una vez que las células son ~ 90-95% confluentes, lo que toma ~ 3-4 días, el cultivo está listo para el aislamiento secundario de inmunoperlas.

5. Aislamiento secundario de inmunoperlas y cultivo de células endoteliales

  1. Lave las células endoteliales adherentes dos veces con 10 ml de HBSS/CMF. Añadir 2 ml de solución de desprendimiento celular libre de tripsina e incubar a 37 °C durante ~5 min. Asegúrese de que todas las celdas se han levantado del matraz.
  2. Agregue 8 ml de medio basal para neutralizar la solución de desprendimiento celular y transfiérala a un tubo cónico de 15 ml. Girar hacia abajo a 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
  3. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio y resuspender las células en 2 ml de medio basal. Transfiera la suspensión de 2 ml de celda a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
  4. Perlas recubiertas anti-CD-102 Vortex durante unos segundos para resuspender las perlas y añadir 30 μL de perlas por cada 2 mL de suspensión celular. Asegure la tapa.
  5. Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador de extremo a extremo. Coloque los tubos en un separador magnético y déjelos actuar durante 2 minutos. A continuación, aspire suavemente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
  6. Retire el tubo del imán, resuspenda el pellet de células de perla agregando 3 ml de medio basal al tubo y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  7. Vuelva a colocar el tubo del separador magnético durante 2 minutos antes de aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
  8. Repita los lavados (paso 5.6-5.7) 4 veces o más hasta que el sobrenadante parezca claro.
  9. Después del lavado final, resuspender el pellet de células de perla en un medio de crecimiento completo de 3 ml y transferirlo a un matraz T-75. Añadir 7 ml de medio de crecimiento completo e incubar a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
  10. Al día siguiente, lave las celdas con HBSS/CMF, luego agregue 10 ml de medio completo fresco. Reemplace los medios con 10 ml de medio completo fresco cada 2-3 días hasta que el 90-95% sea confluente. Una vez que las células endoteliales están completamente confluentes, están listas para la experimentación. Las células no deben usarse más allá del paso seis, ya que puede ocurrir senescencia y otros tipos de células pueden tomar el control.

6. Confirmación de los marcadores de superficie celular endotelial mediante citometría de flujo

  1. Después de usar la solución de desprendimiento celular libre de tripsina para separar las células, resuspenda el pellet celular a 1 x 10 5 células/ml y alícuota 100 μL de la suspensión celular en tres tubos de microcentrífuga de1,5 ml, marcados como 1, 2 y 3.
  2. Lave las celdas con 1 ml de 1x PBS. Centrifugar a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Retire el tampón de lavado y repita dos veces.
  3. Resuspender el pellet celular en 100 μL de 1x PBS. Al tubo 1, agregue 1 μL de anticuerpo conjugado contra el ratón CD-31 (PECAM-1) (por ejemplo, anticuerpo CD-31 contra el ratón con ficoeritrina (PE)) y 1 μL de CD-102 conjugado contra el ratón (ICAM-2) (por ejemplo, anticuerpo CD102 contra el ratón anti-ratón con isotiocianato de fluoresceína (FITC)) (consulte la Tabla de materiales). Al tubo 2, agregue los controles de isotipo apropiados. El tubo nº 3 permanecerá sin teñir.
  4. Incubar los tubos en hielo y en la oscuridad durante 30-45 min.
  5. Añadir 1 ml de PBS a cada tubo, vórtice suavemente y centrifugar a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Retire el lavado y repita tres veces. Resuspender el pellet final en 500 μL de PBS.
  6. Mantener los tubos cubiertos con papel de aluminio a 4 °C hasta el análisis. El análisis debe completarse dentro de 3-4 h.
  7. Adquiera datos de flujo utilizando un citómetro. Utilice una muestra no teñida como control negativo para ajustar correctamente el voltaje del láser de acuerdo con la autofluorescencia celular. Población total de celdas de puerta con una gráfica dispersa hacia adelante y una gráfica de dispersión lateral.
    NOTA: Después de excluir dobletes, las células CD31+ CD102+ doble positivas se definen como células endoteliales.

Representative Results

Este protocolo simple permite aislar, cultivar y caracterizar células endoteliales microvasculares de ratón durante 7-10 días (Figura 1). Brevemente, los pulmones se extirpan y se digieren enzimáticamente antes de la chapa. Inmediatamente después del recubrimiento, las células endoteliales y otras células flotarán en medios de cultivo celular. Al día siguiente, las células endoteliales y las células contaminantes se adherirán a la placa, y se necesita una técnica de lavado vigorosa para eliminar los desechos y las células flotantes. Una vez que las células alcanzan la confluencia, se realiza la primera selección de inmunoperlas. Las células CD-31-positivas comienzan a crecer en una formación de adoquines (Figura 2). Las células que no tienen morfología de adoquines o crecen demasiado son contaminantes y no células endoteliales13,14,15,16.

Luego se realiza una segunda selección de inmunoperlas utilizando perlas recubiertas anti-CD-102 para aumentar la pureza de las células endoteliales, similar a otros protocolos13,16. Las células que han crecido hasta la confluencia después de la segunda selección de inmunoperlas se pueden usar para la experimentación. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se utiliza para confirmar que la población celular es positiva para CD-31 y CD-102 (Figura 3).

Estas células endoteliales se pueden utilizar para muchas aplicaciones, como el estudio de las vías inflamatorias endoteliales y la función de barrera endotelial. Por ejemplo, se observó que el tratamiento con citomix murino (IFNg, TNFa e IL1b, cada uno a 10 ng/mL) indujo la producción de IL-6 por las células endoteliales (Figura 4A). Luego se utilizó la detección de impedancia de sustrato celular eléctrico (ECIS)18 para medir la resistencia transendotelial (TER) al flujo de corriente eléctrica a través de monocapas de células endoteliales pulmonares murinas. Se observó que las células tratadas con cytomix condujeron a una disminución del TER (Figura 4B), lo que es consistente con una mayor permeabilidad endotelial. Estos ejemplos ilustran cómo las células endoteliales preparadas utilizando este protocolo pueden estudiar diversos procesos endoteliales. Esto permite a los investigadores estudiar más fácilmente los genes de interés en las células endoteliales, dado el número cada vez mayor de ratones knockout y transgénicos disponibles.

Figure 1
Figura 1: Esquema para el aislamiento de células endoteliales pulmonares murinas. Los pulmones de los cachorros neonatales de 5-7 días de edad se cosechan y pican. El tejido picado se digiere enzimáticamente con colagenasa I. La suspensión celular se platea y se cultiva durante 2-3 días. Luego, las células se someten a aislamiento primario de inmunoperlas con perlas recubiertas de CD-31 y se cultivan durante otros 3-4 días. Segundo aislamiento de inmunoperlas con perlas recubiertas de CD-102 antes de cultivar otros 2-3 días. Las células ahora están listas para la experimentación funcional. La imagen fue creada por una herramienta de ilustración basada en la web, Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfología de las células endoteliales pulmonares murinas. Las células endoteliales pulmonares murinas cultivadas muestran una morfología de adoquines. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de células endoteliales por citometría de flujo. (A) Todos los eventos se visualizan en un diagrama de puntos de la dispersión hacia adelante (FSC) y la dispersión lateral (SSC). (B) Confirmación del diagrama de dispersión de que las células endoteliales pulmonares murinas son positivas para los antígenos de superficie celular endotelial específicos CD-31 y CD-102. (C) Histograma de la muestra isotipo y muestra teñida con el anticuerpo específico CD-31/CD-102. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cytomix induce la producción de IL-6 de células endoteliales pulmonares murinas y la permeabilidad de las células endoteliales. Las células endoteliales microvasculares de pulmón murino de ratones C57BL / 6 se trataron con citomix (IFNg, TNFa e IL1b, cada uno a 10 ng / ml). (A) Los niveles de IL-6 se cuantificaron en sobrenadantes de cultivo a las 15 h (**p<0,01, n = 4 pocillos/condición). (B) Se utilizó la detección de impedancia de sustrato celular eléctrico para medir la resistencia transendotelial (TER) repetidamente durante 15 h. Los datos se normalizaron a la resistencia inmediatamente antes de la adición de la citomezcla designada y se analizaron mediante análisis bidireccional de varianza (ANOVA) seguido de la prueba posterior de Tukey19 (**p<0,01, n = 4 pocillos/condición). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo simple se presta a células endoteliales de alta pureza de pulmones murinos. Aunque el tiempo total de principio a fin es de 7-10 días, el tiempo práctico es de alrededor de 3-4 h. En comparación con otros métodos13,14,15,16, el protocolo actual se simplifica, manteniendo los pasos esenciales sin comprometer el rendimiento y la pureza.

Vale la pena señalar algunos aspectos críticos de este protocolo. Primero, es importante usar cachorros neonatales en lugar de ratones adultos. En nuestra experiencia, las células endoteliales de ratones adultos no proliferan tan fácilmente como las células de cachorros neonatales, y son fácilmente invadidas por células con morfología fusiforme consistente con fibroblastos o células madre mesenquimales15,16. Una posible explicación para la diferencia es que el desarrollo pulmonar está en la etapa alveolar en ratones neonatos, caracterizada por la proliferación más rápida de células endoteliales20. También puede haber algún grado de senescencia con el envejecimientode 21 años. El tiempo de digestión enzimática también debe ser preciso, ya que la subdigestión puede conducir a una suspensión unicelular de bajo rendimiento. Por el contrario, la digestión excesiva puede conducir a una cantidad sustancial de muerte celular. Hemos determinado que el tiempo óptimo para la digestión de la colagenasa es de 45 minutos. Esto es seguido por la disociación mecánica con una cánula roma. También se ha descrito la instilación de colagenasa intratraqueal durante la digestión enzimática14,15; Sin embargo, esto puede llevar mucho tiempo y conduce a una digestión incompleta durante el trabajo actual. Por último, algunos protocolos proceden directamente al aislamiento de inmunoperlas inmediatamente después de la digestión enzimática13,16. Hemos encontrado que cultivar las células del pulmón disociado en el medio durante uno o dos días antes de hacer la selección de inmunoperlas aumenta sustancialmente el rendimiento de células endoteliales viables y altamente puras. Esto puede estar relacionado con la velocidad de obtener células aisladas en el medio de cultivo de tejidos, lo que conduce a una menor muerte celular en las primeras etapas después de la eliminación de los ratones, una mayor densidad de siembra inicial y el tiempo para que las células endoteliales se adhieran y proliferen antes del primer aislamiento de inmunoperlas.

Las limitaciones de la preparación y análisis de las células endoteliales de ratón son las siguientes. Cada ratón solo proporciona un número limitado de celdas que deben usarse dentro de unos pocos pasajes. Este problema se puede superar agrupando la digestión pulmonar de varios ratones. Desafortunadamente, no tenemos éxito en nuestros esfuerzos por criopreservar y descongelar las células para su uso futuro. A pesar de estas limitaciones, las células endoteliales del ratón tienen algunas ventajas. Pueden ser útiles, particularmente en situaciones en las que las células endoteliales humanas no se pueden usar (por ejemplo, eliminación de genes), cuando se requieren estudios complementarios para corroborar los resultados con células humanas, o cuando la heterogeneidad de las respuestas de las células endoteliales de diferentes donantes humanos hace que la reproducibilidad entre experimentos sea problemática6. La población homogénea de células endoteliales de ratones genéticamente idénticos permite la reproducibilidad entre experimentos y el estudio de genes y vías específicas en condiciones de fondo estables.

Las células endoteliales de ratón se pueden utilizar para múltiples aplicaciones para proporcionar información sobre la activación endotelial y la disfunción en diferentes procesos de enfermedad. Por ejemplo, las células endoteliales desempeñan un papel integral en la sepsis, contribuyendo a las respuestas beneficiosas y patológicas a través de sus funciones en la activación de la inflamación localizada y sistémica, la promoción del tráfico de leucocitos y la activación en los tejidos, la regulación de la coagulación y la modulación de la permeabilidad endotelial 2,22,23 . Este protocolo simple proporciona células endoteliales viables y funcionales que se pueden usar en ensayos para cada uno de estos procesos endoteliales.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH T32GM008440 (JH / EW) y NIH R01AI058106 (JH). Reconocemos el UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID: SCR_018206) apoyado en parte por Grant NIH P30 DK063720 y por NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL conicals Corning Life Sciences 430829
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies, Inc AT-104
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" Becton Disckinson 305122
BioRender.com BioRender
Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" Covidien 8881202314
CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) BD Biosciences 553326
CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) BD Biosciences 557355
Collagenase, Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004194
DMEM, high glucose Gibco 11965092
Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Invitrogen 11035
Endothelial Cell Growth Supplment EMD Millipore Corp 02-102
Falcon cell strainers (70 µm) Corning Life Sciences 352350
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10082-147
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-10
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20B
FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) BD Biosciences 557444
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) BD Biosciences 553929
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175095
Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) Medline 0409-2720-02
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3393
HEPES (1 M) Gibco 15630106
Nonessential amino acids (100x) Gibco 11140050
PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) BD Biosciences 553373
PE Rat IgG2a,  κ Isotype Control R35-95) BD Biosciences 553930
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) Gibco 15140122
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine IL-1β Peprotech 211-11B
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A
Round bottom polystyrene test tubes Corning Life Sciences 352058
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL Millipore S2GPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Milipore SCGP00525
Sterile syringe (10 mL) Fisher Scientific 14-955-459
Sterile syringe (20 mL) Fisher Scientific 14-955-460
T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated Corning Life Sciences 3290

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
  2. Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
  3. Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
  4. Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
  5. Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
  6. Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
  7. Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
  8. Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  9. Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
  10. Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
  11. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  12. Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
  13. Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
  14. Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
  15. Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
  16. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
  17. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
  18. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  19. Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
  20. Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
  21. Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
  22. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).
  23. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).

Tags

Inmunología e infección Número 177
Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J.… More

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (177), e63253, doi:10.3791/63253 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter