Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af primære muselungeendotelceller

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63253
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care, UCSF Benioff Children's Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco

Summary

I denne artikel blev primære lungeendotelceller isoleret og dyrket fra neonatale mus.

Abstract

Endotelceller spiller kritiske roller i reguleringen af vaskulær tone, immunitet, koagulation og permeabilitet. Endoteldysfunktion forekommer ved medicinske tilstande, herunder diabetes, aterosklerose, sepsis og akut lungeskade. En pålidelig og reproducerbar metode til at isolere rene endotelceller fra mus er nødvendig for at undersøge endotelcellernes rolle i patogenesen af disse og andre tilstande. I denne protokol blev lungemikrovaskulære endotelceller fremstillet fra 5-7 dage gamle neonatale museunger. Lunger høstes, hakkes og fordøjes enzymatisk med kollagenase I, og frigivne celler dyrkes natten over. Endotelceller vælges derefter ved hjælp af anti-PECAM1 (CD-31) IgG konjugeret til magnetiske perler, og celler dyrkes igen til sammenløb. En sekundær celleudvælgelse forekommer derefter med anti-ICAM2 (CD-102) IgG konjugeret til magnetiske perler for at øge endotelcellernes renhed, og cellerne dyrkes igen til sammenløb. Hele processen tager ca. 7-10 dage, før cellerne kan bruges til eksperimentering. Denne enkle protokol giver meget rene (renhed >92%) endotelceller, der straks kan anvendes til in vitro-undersøgelser , herunder undersøgelserne med fokus på endotelcytokin- og kemokinproduktion, leukocyt-endotelinteraktioner, endotelkoagulationsveje og endotelpermeabilitet. Med mange knockouts og transgene muselinjer til rådighed, egner denne procedure sig også til at forstå funktionen af specifikke gener udtrykt af endotelceller i sunde og patologiske reaktioner på skade, infektion og betændelse.

Introduction

Interessen for at studere det vaskulære endotel er vokset for nylig, da dysfunktion af mikrovaskulære endotelceller forekommer i flere menneskelige sygdomme, såsom slagtilfælde, hjerte-kar-sygdomme, diabetes, akut lungeskade, sepsis og ikke-infektiøse skader 1,2,3,4,5. For at definere patogenesen af disse tilstande og forstå specifikke geners roller i beskyttende og dysregulerede endotelcelleresponser er der behov for pålidelige metoder til at isolere og dyrke mikrovaskulære endotelceller med høj renhed fra mus. Mens mange undersøgelser bruger humane endotelceller såsom humane navlestrengendotelceller (HUVEC) eller humane lungemikrovaskulære endotelceller (HMVEC), er der flere grunde til at bruge museendotelceller til at studere endotelfunktion og dysfunktion. For det første er der betydelig heterogenitet i respons fra endotelceller fra forskellige humane donorer, hvilket fører til variation i resultaterne mellem individuelle forsøg 6,7,8. For det andet kan hæmning af genmål i primære humane cellelinjer også føre til variable proteinekspressionsniveauer 9,10. I modsætning hertil er der minimal heterogenitet i reaktionerne fra museendotelceller11, forudsat at den genetiske baggrund er den samme mellem studiegrupperne. Desuden kan et stort antal museendotelceller fremstilles ved at samle lunger fra flere neonatale mus. Disse faktorer giver mulighed for mere konsistente og reproducerbare resultater mellem eksperimenter. Endelig giver tilgængeligheden af knockout eller transgene mus også isolering af celletyper, der mangler proteiner af interesse.

De betydelige udfordringer med at isolere sunde og rene populationer af muselungeendotelceller ved hjælp af offentliggjorte metoder 12,13,14,15,16 førte til udvikling af en mere pålidelig og ligetil metode til isolering af højkvalitets muselungemikrovaskulære endotelceller. Fordelene ved den nuværende protokol omfatter brug af neonatale mus, som er let tilgængelige, hvilket begrænser husdyrhold og opstaldningsomkostninger. Derudover er det vores erfaring, at levedygtigheden af endotelceller fra nyfødte mus er væsentligt højere end endotelceller fremstillet af voksne mus. Fordi neonatale mus har lille lungevæv, kan endotelceller høstes ved at fordøje udskårne lunger i kollagenase i stedet for at bruge trakeal instillation af collagenase, som anbefales til opsamling fra voksne mus16. Dette reducerer også tiden mellem aflivning af mus og at få deres endotelceller ind i cellekulturmedier og inkubatoren uden at påvirke renheden eller udbyttet eller reproducerbarheden af endotelresponser. Endelig blev rene cellepopulationer isoleret uden flowcytometri, hvilket kan beskadige eller føre til lavere udbytter af endotelcellerne14,15,17.

Den nuværende modificerede protokol fører konsekvent til høj renhed og levedygtige endotelceller på 7-10 dage, der straks kan bruges til in vitro-forsøg . Isolering af celler direkte fra knockout-dyr minimerer også manipulation af celler før forsøg. Disse metoder kan bruges til at undersøge forskellige proteiners rolle i endotelfunktionen for at opdage endotelbaserede terapeutiske mål for flere sygdomme.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California San Francisco. C57BL/6 neonatale museunger (5-7 dage) blev anvendt til undersøgelsen. Hele protokollen tager 7-10 dage (figur 1).

1. Fremstilling af endotelcellemedium

  1. Forbered basalmediet: Dulbeccos modificerede ørnemedium med 4.500 mg / l glucose og 4 mM L-glutamin (DMEM) suppleret med 20% (v / v) varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 E / 100 μg / ml penicillin / streptomycin og 25 mM HEPES (se materialetabel). Sterilt filter med 22 μM filter. Basalsubstratet opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en måned efter tilberedningen.
  2. Forbered det komplette medium: Basalmedium suppleret med 100 μg / ml heparin, 100 μg / ml endotelcellevæksttilskud, 1x ikke-essentielle aminosyrer og 1 mM natriumpyruvat (se materialetabel). Sterilt filter med 22 μM filter. Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en måned efter tilberedning.

2. Forbelægning af magnetiske perler mod rotter13

  1. Lav 50 ml perlevaskebuffer: Fosfatbufret opløsning (PBS) suppleret med 0,1% (w / v) bovint serumalbumin (BSA). Sterilt filter med 22 μM filter og opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en måned efter tilberedning.
  2. Vortex de magnetiske perler i et par sekunder for at resuspendere perlerne og pipette 50 μL af perlerne (2 x 107 perler) i to 1,5 ml mikrocentrifugerør, et til CD-31 og et til CD-102 (se materialetabel). Tilsæt 1 ml perlevaskebuffer og bland godt.
    BEMÆRK: Alle de nævnte volumener blev brugt til at isolere endotelceller fra 3-4 neonatale museunger (5-7 dage gamle). CD-31 og CD-102 er endotelcelleoverflademarkørerne, der anvendes til magnetisk immunoperlevalg.
  3. Rørene anbringes på en magnetisk separator, og supernatanten fjernes med en Pasteur-pipette af glas. Gentag vask 3 gange med 1 ml perlevaskebuffer hver gang.
  4. Resuspender perler i originalt perlevolumen, 50 μL, med perlevaskebuffer. Derefter tilsættes 5 μL (2,5 μg) antistof (CD-31/CD-102) til hver 50 μL perler.
  5. Der inkuberes perlesuspension ved forsigtig rotation på en ende-over-ende-rotator natten over ved 4 °C eller i 3 timer ved stuetemperatur. Gentag vask 4 gange.
  6. Immunperlerne resuspenderes i det oprindelige volumen, 50 μL, med perlevaskebuffer og opbevares ved 4 °C og anvendes inden for 1-2 uger.

3. Isolering og plettering af lungecellerne

  1. Forbered type 1 kollagenaseopløsning på isolationsdagen: Tilsæt 25 mg type 1 collagenase til 25 ml HBSS (se materialetabel). Der inkuberes ved 37 °C i 1 time med let rotation og sterilt filter med 22 μM filter. Opbevar opløsningen varm ved 37 °C.
  2. Injicer 5-7 dage gamle museunger intramuskulært med heparin (25 μL/mus, 1.000 E/ml) 10 minutter før eutanasi for at minimere endotelcelleaktivering og koagulationsdannelse14,15.
  3. Aflive musehvalpen med halshugning ved hjælp af en skarp saks i overensstemmelse med AVMA-retningslinjerne for eutanasi fra 2020. Fastgør derefter musen til et dissektionsbræt med ventral side opad.
  4. Sprøjt slagtekroppen med 70% ethanol, udsæt derefter brysthulen ved først at skære membranen og derefter skære overlegent opad langs hele brystets laterale vægge. Reflektering af brystkassen udsætter derefter hjertet og lungerne.
    BEMÆRK: Brug mindre tang og saks til dette trin i betragtning af den lille størrelse af neonatale mus, og sørg for ikke at gennembore hjertet eller lungerne, da dette vil føre til utilstrækkelig blodfjernelse fra lungerne.
  5. Sæt en 25 G kanyle på en 10 ml sprøjte, og injicer 5 ml kold DMEM i hjertets højre ventrikel for at fjerne blod fra lungerne. Lungerne bliver hvide.
  6. Fjern lungerne fra brysthulen, en lap ad gangen, ved at skære lapperne distale til de tilsvarende bronchi.
  7. Alle lungelapperne samles i et 50 ml konisk rør, der er fyldt med 20 ml iskoldt basalmedium (fra trin 1.1).
  8. Gentag trin 3.2-3.7 med de andre museunger, og saml alle lungelapper i det samme 50 ml koniske rør.
  9. Omrør forsigtigt røret med hånden i 10-15 s for at vaske overskydende røde blodlegemer, der visuelt værdsættes på overfladen af lungerne.
    BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at fjerne alt blod fra indersiden af eller omkring lungerne; Dette forbedrer dog renheden. Enhver yderligere vævshåndtering skal udføres i en steril hætte.
  10. Brug en cellesi til at fjerne lungerne fra mediet, og overfør vævet til en steril engangs vævskulturskål med en diameter på 100 mm og hakket med steriliseret saks.
  11. Det hakkede væv overføres til det 50 ml koniske rør med 25 ml forvarmet kollagenaseopløsning (trin 3.1). Omrør forsigtigt på en roterende mixer i 45 minutter ved 37 °C.
    BEMÆRK: Overfordøjelse i selv 60 min kan føre til lavere udbytter.
  12. Sæt en 20 ml sprøjte på en 15 G stump kanyle (se materialetabel) og triturer suspensionen 10-15 gange for at bryde vævet op til en cellesuspension. Vær energisk, men undgå at skumme for meget.
    BEMÆRK: Der vil ikke længere være synlige stykker af lungen, og i stedet vil suspensionen være uklar efter afslutningen af dette trin.
  13. Suspensionen filtreres gennem en 70 μm cellesi i et frisk 50 ml konisk rør. Skyl endvidere det koniske rør, der anvendes til fordøjelsen, og cellesilen med yderligere 15 ml basalmedium.
  14. Cellesuspensionen centrifugeres ved 400 x g i 8 minutter ved 4 °C.
  15. Supernatanten fjernes med en Pasteur-pipet af glas, og pelletsen resuspenderes i 2 ml komplet substrat. Overfør til en T-75-kolbe, og tilsæt 8 ml komplet mediumkultur ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -inkubator.
  16. Den følgende dag vaskes kolber to gange med 10 ml Hank's Balanced Salt Solution uden calcium og magnesium (HBSS/CMF) (se materialetabellen) og tilsættes 10 ml komplet substrat.
    BEMÆRK: Efter 2-3 dage vil kulturen være 90-95% sammenflydende og klar til primær immunperleisolering.

4. Primær immunperleisolering og dyrkning af endotelceller

  1. Vask vedhængende endotelceller to gange med 10 mL HBSS/CMF. Tilsæt 2 ml trypsinfri celleløsrivelsesopløsning (se materialetabel) og inkuber ved 37 °C i ~5 min. Sørg for, at alle cellerne er løftet fra kolben.
    BEMÆRK: En trypsinfri løsrivelsesopløsning skal bruges i stedet for trypsin, da trypsin kan forstyrre celleoverfladens vedhæftningsmarkør CD-31.
  2. Tilsæt 8 ml basalmedium for at neutralisere cellefrigørelsesopløsningen og overfør indholdet til et 15 ml konisk rør. Spin ned ved 400 x g i 4 min ved stuetemperatur.
  3. Supernatanten fjernes med en Pasteur-pipet af glas, og cellerne resuspenderes i 2 ml basalmedium. Overfør 2 ml cellesuspensionen til et 5 ml rundbundet polystyrenrør (se materialetabel).
  4. Vortex anti-CD-31 belagte perler i et par sekunder for at resuspendere perlerne og tilføje 30 μL perler for hver 2 ml cellesuspension. Fastgør låget.
  5. Inkuber røret i 10 minutter ved stuetemperatur på en ende-over-ende rotator. Placer derefter rørene på en magnetisk separator og lad dem stå i 2 minutter.
  6. Sug forsigtigt supernatanten med en Pasteur-pipette af glas. Fjern røret fra magneten, resuspender perlecellepillen ved at tilsætte 3 ml basalmedium til røret og pipette op og ned flere gange.
  7. Sæt røret på magnetseparatoren igen i 2 min, og sug derefter forsigtigt supernatanten til med en Pasteur-pipette af glas.
  8. Gentag vaskene (trin 4.6-4.7) mindst 4 gange, indtil supernatanten fremstår klar.
  9. Efter den endelige vask resuspenderes perlecellepelleten i 3 ml komplet vækstmedium og overføres til en T-75-kolbe. Der tilsættes 7 ml af hele vækstmediet, og der inkuberes ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -inkubator.
  10. Næste dag vaskes cellerne med HBSS/CMF, og der tilsættes derefter 10 ml frisk komplet medium. Udskift medier med 10 ml frisk komplet medium hver 2-3 dag, indtil 90-95% sammenflydende.
    BEMÆRK: Når cellerne er ~ 90-95% sammenflydende, hvilket tager ~ 3-4 dage, er kulturen klar til sekundær immunperleisolering.

5. Sekundær immunperleisolering og dyrkning af endotelceller

  1. Adhærente endotelceller vaskes to gange med 10 ml HBSS/CMF. Tilsæt 2 ml trypsinfri celleløsrivelsesopløsning og inkuber ved 37 °C i ~5 min. Sørg for, at alle cellerne er løftet fra kolben.
  2. Tilsæt 8 ml basalmedium for at neutralisere celleløsrivelsesopløsning og overfør til et 15 ml konisk rør. Spin ned ved 400 x g i 4 min ved stuetemperatur.
  3. Supernatanten fjernes med en Pasteur-pipet af glas, og cellerne resuspenderes i 2 ml basalmedium. Overfør 2 ml cellesuspensionen til et 5 ml rundbundet polystyrenrør.
  4. Vortex anti-CD-102 belagte perler i et par sekunder for at resuspendere perlerne og tilføje 30 μL perler for hver 2 ml cellesuspension. Fastgør låget.
  5. Inkuber røret i 10 minutter ved stuetemperatur på en ende-over-ende rotator. Placer rørene på en magnetisk separator og lad dem stå i 2 min. Derefter suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
  6. Fjern røret fra magneten, resuspender perlecellepillen ved at tilsætte 3 ml basalmedium til røret og pipette op og ned flere gange.
  7. Sæt røret på magnetseparatoren igen i 2 minutter, før supernatanten forsigtigt suges til med en Pasteur-pipette af glas.
  8. Gentag vaskene (trin 5.6-5.7) 4 gange eller mere, indtil supernatanten fremstår klar.
  9. Efter den endelige vask resuspenderes perlecellepelleten i 3 ml komplet vækstmedium og overføres til en T-75-kolbe. Der tilsættes 7 ml komplet vækstmedium, og der inkuberes ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -inkubator.
  10. Næste dag vaskes cellerne med HBSS/CMF, og der tilsættes derefter 10 ml frisk komplet medium. Udskift medier med 10 ml frisk komplet medium hver 2-3 dag, indtil 90-95% sammenflydende. Når endotelcellerne er fuldt sammenflydende, er de klar til eksperimentering. Cellerne bør ikke bruges ud over passage seks, da ældning kan forekomme, og andre celletyper kan overtage.

6. Bekræftelse af endotelcelleoverflademarkørerne ved flowcytometri

  1. Efter brug af trypsinfri celleløsrivelsesopløsning til at løsne cellerne, resuspenderes cellepellet til 1 x 10 5 celler / ml og alikvote 100 μL af cellesuspensionen i tre1,5 ml mikrocentrifugerør, mærket 1, 2 og 3.
  2. Vask celler med 1 ml 1x PBS. Der centrifugeres ved 500 x g i 2 minutter ved 4 °C. Fjern vaskebufferen, og gentag den to gange.
  3. Resuspender cellepillen i 100 μL 1x PBS. Til rør 1 tilsættes 1 μL konjugeret CD-31-antistof (PECAM-1) anti-mus (f.eks. phycoerythrin (PE) CD-31-antistof mod mus) og 1 μL konjugeret CD-102 (ICAM-2) (f.eks. fluoresceinisothiocyanat (FITC) CD102-antistof mod mus) (se materialetabel). Til rør 2 tilsættes de relevante isotypekontroller. Rør nr. 3 forbliver ubesmittet.
  4. Inkuber rørene på is og i mørke i 30-45 min.
  5. Der tilsættes 1 ml PBS til hvert rør, hvirvelstrømmen, og centrifugeres ved 500 x g i 2 minutter ved 4 °C. Fjern vask og gentag tre gange. Den endelige pellet resuspenderes i 500 μL PBS.
  6. Opbevar rørene dækket med aluminiumsfolie ved 4 °C indtil analysen. Analysen skal afsluttes inden for 3-4 timer.
  7. Hent flowdata ved hjælp af et cytometer. Brug en ubejdset prøve som negativ kontrol til korrekt indstilling af laserspænding i henhold til celleautofluorescens. Gate total cellepopulation med et fremadrettet spredt plot og side scatter plot.
    BEMÆRK: Efter udelukkelse af dubletter defineres CD31+ CD102+ dobbeltpositive celler som endotelceller.

Representative Results

Denne enkle protokol gør det muligt at isolere, dyrke og karakterisere mikrovaskulære endotelceller hos mus over 7-10 dage (figur 1). Kort fortalt udskæres lungerne og fordøjes enzymatisk inden plettering. Umiddelbart efter plettering vil endotelceller og andre celler flyde i cellekulturmedier. Den følgende dag klæbes endotelceller og de forurenende celler til pladen, og en kraftig vasketeknik er nødvendig for at fjerne snavs og de flydende celler. Når cellerne når sammenløb, udføres det første immunoperlevalg. De CD-31-positive celler begynder derefter at vokse i en brostensformation (figur 2). Celler, der ikke har brostensmorfologi eller overgroning, er forurenende stoffer og ikke endotelceller13,14,15,16.

En anden immunobead udvælgelse udføres derefter ved hjælp af anti-CD-102 coatede perler for at øge renheden af endotelceller, svarende til andre protokoller13,16. Celler, der er vokset til sammenløb efter anden immunobead udvælgelse kan derefter anvendes til eksperimentering. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) bruges til at bekræfte, at cellepopulationen er CD-31- og CD-102-positiv (figur 3).

Disse endotelceller kan derefter bruges til mange applikationer, såsom at studere endotelinflammatoriske veje og endotelbarrierefunktion. For eksempel blev det observeret, at behandling med murine cytomix (IFNg, TNFa og IL1b, hver ved 10 ng / ml) inducerede IL-6-produktion af endotelceller (figur 4A). Derefter blev elektrisk celle-substratimpedanssensing (ECIS)18 brugt til at måle transendotelmodstand (TER) til strømmen af elektrisk strøm over murine lungeendotelcellemonolag. Det blev observeret, at cellerne behandlet med cytomix førte til et fald i TER (figur 4B), hvilket er i overensstemmelse med øget endotelpermeabilitet. Disse eksempler illustrerer, hvordan endotelcellerne fremstillet ved hjælp af denne protokol kan studere forskellige endotelprocesser. Dette gør det lettere for efterforskere at studere gener af interesse i endotelceller i betragtning af det stadigt voksende antal tilgængelige knockout- og transgene mus.

Figure 1
Figur 1: Skematisk for isolering af murine lungeendotelceller. Lunger fra 5-7 dage gamle neonatale hvalpe høstes og hakkes. Hakket væv blev enzymatisk fordøjet med kollagenase I. Cellulær suspension er belagt og dyrket i 2-3 dage. Celler gennemgår derefter primær immunperleisolering med CD-31-coatede perler og dyrkes i yderligere 3-4 dage. Anden immunperleisolering med CD-102-coatede perler inden dyrkning af yderligere 2-3 dage. Celler er nu klar til funktionelle eksperimenter. Billedet blev skabt af et webbaseret illustrationsværktøj, Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologi af murine lungeendotelceller. Dyrkede murin lungeendotelceller viser en brostensmorfologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Analyse af endotelceller ved flowcytometri. (A) Alle begivenheder visualiseres på et prikplot af Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC). (B) Scatter plot-bekræftelse af, at murine lungeendotelceller er positive for begge endotelspecifikke celleoverfladeantigener CD-31 og CD-102. C) Histogram af isotypeprøven og prøven farvet med CD-31/CD-102-specifikt antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Cytomix inducerer murine lungeendotelcelle IL-6 produktion og endotelcellepermeabilitet. Murine lungemikrovaskulære endotelceller fra C57BL/6-mus blev behandlet med cytomix (IFNg, TNFa og IL1b, hver ved 10 ng/ml). (A) IL-6-niveauerne blev derefter kvantificeret i kultursupernatanter ved 15 timer (**p<0,01, n = 4 huller/tilstand). (B) Elektrisk celle-substratimpedans-sensing blev brugt til at måle transendotelmodstanden (TER) gentagne gange over 15 timer. Data blev normaliseret til resistensen umiddelbart før tilsætningen af cytoblandingen som betegnet og blev analyseret ved tovejsvariansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey post-test19 (**p<0,01, n = 4 brønde / tilstand). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne enkle protokol egner sig til endotelceller med høj renhed fra murine lunger. Selvom den samlede tid fra start til slut er 7-10 dage, er den praktiske tid omkring 3-4 timer. Sammenlignet med andre metoder13,14,15,16 er den nuværende protokol strømlinet og holder vigtige trin uden at gå på kompromis med udbytte og renhed.

Det er værd at bemærke nogle kritiske aspekter af denne protokol. For det første er det vigtigt at bruge neonatale hvalpe frem for voksne mus. Det er vores erfaring, at endotelceller fra voksne mus ikke formerer sig så let som celler fra nyfødte unger, og de bliver let løbet over ende af celler med spindellignende morfologi, der er i overensstemmelse med fibroblaster eller mesenkymale stamceller15,16. En mulig forklaring på forskellen er, at lungeudviklingen er i det alveolære stadium hos nyfødte mus, karakteriseret ved den hurtigere spredning af endotelceller20. Der kan også være en vis grad af ældning med aldring21. Enzymatisk fordøjelsestid skal også være præcis, da underfordøjelse kan føre til et lavt udbytte enkeltcellesuspension. I modsætning hertil kan overfordøjelse føre til en betydelig mængde celledød. Vi har fastslået, at den optimale tid til fordøjelse af kollagenase bestemmes til at være 45 minutter. Dette efterfølges derefter af mekanisk dissociation med en stump kanyle. Indstilling af intratrakeal kollagenase under enzymatisk fordøjelse er også blevet rapporteret14,15; Dette kan dog være tidskrævende og fører til ufuldstændig fordøjelse under det nuværende arbejde. Endelig fortsætter nogle protokoller direkte til immunperleisolering umiddelbart efter enzymatisk fordøjelse13,16. Vi har fundet ud af, at dyrkning af cellerne fra den dissocierede lunge i mediet i en dag eller to, før immunperlevalget foretages, øger udbyttet af levedygtige og meget rene endotelceller betydeligt. Dette kan være relateret til hastigheden af at få isolerede celler ind i vævskulturmediet, hvilket fører til mindre celledød i de tidlige stadier efter fjernelse fra musene, højere indledende såtæthed og tid for endotelcellerne til at klæbe og sprede sig før den første immunperleisolering.

Begrænsninger i forberedelsen og analyserne af museendotelceller er som følger. Hver mus indeholder kun et begrænset antal celler, der skal bruges inden for få passager. Dette problem kan løses ved at samle lungefordøjelsen fra flere mus. Desværre lykkes det os ikke at nedfryse og optø cellerne til fremtidig brug. På trods af disse begrænsninger har museendotelceller nogle fordele. De kan være nyttige, især i situationer, hvor humane endotelceller enten ikke kan anvendes (f.eks. genknockout), når komplementære undersøgelser er nødvendige for at bekræfte resultater med humane celler, eller når heterogeniteten af respons fra endotelceller fra forskellige humane donorer gør reproducerbarhed mellem eksperimenter problematisk6. Den homogene endotelcellepopulation fra genetisk identiske mus muliggør reproducerbarhed mellem eksperimenter og undersøgelse af specifikke gener og veje under stabile baggrundsbetingelser.

Museendotelceller kan bruges til flere applikationer for at give indsigt i endotelaktivering og dysfunktion i forskellige sygdomsprocesser. For eksempel spiller endotelceller en integreret rolle i sepsis, hvilket bidrager til både gavnlige og patologiske reaktioner gennem deres roller i aktivering af lokaliseret og systemisk inflammation, fremme leukocythandel og aktivering i væv, regulering af koagulation og modulering af endotelpermeabilitet 2,22,23. Denne enkle protokol giver levedygtige, funktionelle endotelceller, der kan bruges i assays for hver af disse endotelprocesser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH T32GM008440 (JH / EW) og NIH R01AI058106 (JH). Vi anerkender UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID: SCR_018206) delvist støttet af Grant NIH P30 DK063720 og af NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL conicals Corning Life Sciences 430829
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies, Inc AT-104
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" Becton Disckinson 305122
BioRender.com BioRender
Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" Covidien 8881202314
CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) BD Biosciences 553326
CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) BD Biosciences 557355
Collagenase, Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004194
DMEM, high glucose Gibco 11965092
Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Invitrogen 11035
Endothelial Cell Growth Supplment EMD Millipore Corp 02-102
Falcon cell strainers (70 µm) Corning Life Sciences 352350
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10082-147
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-10
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20B
FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) BD Biosciences 557444
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) BD Biosciences 553929
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175095
Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) Medline 0409-2720-02
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3393
HEPES (1 M) Gibco 15630106
Nonessential amino acids (100x) Gibco 11140050
PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) BD Biosciences 553373
PE Rat IgG2a,  κ Isotype Control R35-95) BD Biosciences 553930
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) Gibco 15140122
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine IL-1β Peprotech 211-11B
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A
Round bottom polystyrene test tubes Corning Life Sciences 352058
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL Millipore S2GPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Milipore SCGP00525
Sterile syringe (10 mL) Fisher Scientific 14-955-459
Sterile syringe (20 mL) Fisher Scientific 14-955-460
T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated Corning Life Sciences 3290

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
  2. Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
  3. Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
  4. Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
  5. Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
  6. Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
  7. Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
  8. Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  9. Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
  10. Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
  11. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  12. Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
  13. Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
  14. Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
  15. Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
  16. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
  17. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
  18. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  19. Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
  20. Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
  21. Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
  22. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).
  23. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).

Tags

Immunologi og infektion udgave 177
Isolering af primære muselungeendotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J.… More

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (177), e63253, doi:10.3791/63253 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter