Summary
I denna artikel isolerades primära lungendotelceller och odlades från neonatala möss.
Abstract
Endotelceller spelar kritiska roller i regleringen av vaskulär ton, immunitet, koagulation och permeabilitet. Endoteldysfunktion uppstår vid medicinska tillstånd inklusive diabetes, ateroskleros, sepsis och akut lungskada. En tillförlitlig och reproducerbar metod för att isolera rena endotelceller från möss behövs för att undersöka endotelcellernas roll i patogenesen av dessa och andra tillstånd. I detta protokoll framställdes lungmikrovaskulära endotelceller från 5-7 dagar gamla neonatala musvalpar. Lungor skördas, mals och enzymatiskt smälts med kollagenas I, och frigjorda celler odlas över natten. Endotelceller väljs sedan med användning av anti-PECAM1 (CD-31) IgG konjugerat till magnetiska pärlor, och celler odlas igen till sammanflöde. Ett sekundärt cellurval sker sedan med anti-ICAM2 (CD-102) IgG konjugerat till magnetiska pärlor för att öka renheten hos endotelcellerna, och cellerna odlas igen till sammanflöde. Hela processen tar cirka 7-10 dagar innan cellerna kan användas för experiment. Detta enkla protokoll ger mycket rena (renhet >92%) endotelceller som omedelbart kan användas för in vitro-studier , inklusive studierna fokuserade på endotelcytokin och kemokinproduktion, leukocyt-endotelinteraktioner, endotelkoagulationsvägar och endotelpermeabilitet. Med många knockouts och transgena muslinjer tillgängliga, lämpar sig denna procedur också för att förstå funktionen hos specifika gener som uttrycks av endotelceller i friska och patologiska svar på skada, infektion och inflammation.
Introduction
Intresset för att studera det vaskulära endotelet har ökat nyligen, eftersom dysfunktion av mikrovaskulära endotelceller förekommer i flera mänskliga sjukdomar, såsom stroke, hjärt-kärlsjukdom, diabetes, akut lungskada, sepsis och icke-infektiösa skador 1,2,3,4,5. För att definiera patogenesen av dessa tillstånd och förstå rollerna för specifika gener i skyddande och dysreglerade endotelcellssvar finns det ett behov av tillförlitliga metoder för att isolera och odla mikrovaskulära endotelceller med hög renhet från möss. Medan många studier använder humana endotelceller såsom humana navelvenendotelceller (HUVEC) eller humana lungmikrovaskulära endotelceller (HMVEC), finns det flera skäl att använda musendotelceller för att studera endotelfunktion och dysfunktion. För det första finns det stor heterogenitet i svar från endotelceller från olika mänskliga givare, vilket leder till variation i resultat mellan enskilda experiment 6,7,8. För det andra kan tystning av genmål i primära humana cellinjer också leda till varierande proteinuttrycksnivåer 9,10. Däremot finns det minimal heterogenitet i svaren hos musendotelceller11, förutsatt att den genetiska bakgrunden är densamma mellan studiegrupperna. Dessutom kan ett stort antal endotelceller från möss framställas genom att slå samman lungor från flera neonatala möss. Dessa faktorer möjliggör mer konsekventa och reproducerbara resultat mellan experiment. Slutligen ger tillgången på knockout eller transgena möss också isolering av celltyper som saknar proteiner av intresse.
De stora utmaningarna med att isolera friska och rena populationer av muslungendotelceller med publicerade metoder 12,13,14,15,16 ledde till att man utvecklade en mer tillförlitlig och okomplicerad metod för att isolera högkvalitativa mikrovaskulära endotelceller från muslungor. Fördelarna med det nuvarande protokollet inkluderar användning av neonatala möss, som är lättillgängliga, vilket begränsar djurhållning och bostadskostnader. Dessutom, enligt vår erfarenhet, är livskraften hos endotelceller från neonatala möss väsentligt högre än endotelceller framställda från vuxna möss. Eftersom neonatala möss har liten lungvävnad kan endotelceller skördas genom att smälta utskurna lungor i kollagenas snarare än att använda trakealinstillation av kollagenas, vilket rekommenderas för insamling från vuxna möss16. Detta minskar också tiden mellan avlivning av möss och att få sina endotelceller i cellodlingsmedia och inkubatorn utan att påverka renheten eller utbytet eller reproducerbarheten av endotelsvar. Slutligen isolerades rena cellpopulationer utan flödescytometri, vilket kan skada eller leda till lägre utbyten av endotelcellerna14,15,17.
Det nuvarande modifierade protokollet leder konsekvent till hög renhet och livskraftiga endotelceller på 7-10 dagar som kan användas omedelbart för in vitro-experiment . Att isolera celler direkt från knockoutdjur minimerar också manipulationen av celler före experiment. Dessa metoder kan användas för att undersöka olika proteiners roll i endotelfunktionen för att upptäcka endotelbaserade terapeutiska mål för flera sjukdomar.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of California San Francisco. Manliga C57BL/6 neonatala musungar (ålder 5-7 dagar) användes för studien. Hela protokollet tar 7-10 dagar (figur 1).
1. Framställning av endotelcellmedium
- Förbered basmediet: Dulbeccos modifierade örnmedium med 4 500 mg / L glukos och 4 mM L-glutamin (DMEM) kompletterat med 20% (v / v) värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 100 U / 100 μg / ml penicillin / streptomycin och 25 mM HEPES (se materialtabell). Sterilfilter med 22 μM filter. Förvara basalmedium vid 4 °C och använd det inom en månad efter beredningen.
- Bered hela mediet: Basmedium kompletterat med 100 μg/ml heparin, 100 μg/ml endotelcellstillväxttillskott, 1x icke-essentiella aminosyror och 1 mM natriumpyruvat (se materialtabell). Sterilfilter med 22 μM filter. Förvaras vid 4 °C och används inom en månad efter beredning.
2. Förbeläggning av magnetiska pärlor mot råtta13
- Gör 50 ml pärltvättbuffert: Fosfatbuffrad lösning (PBS) kompletterad med 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA). Sterilfiltrera med 22 μM filter och förvara vid 4 °C och använd det inom en månad efter beredningen.
- Virvla de magnetiska pärlorna i några sekunder för att återsuspendera pärlorna och pipettera 50 μL av pärlorna (2 x 107 pärlor) i två 1,5 ml mikrocentrifugrör, en för CD-31 och en för CD-102 (se materialtabell). Tillsätt 1 ml pärltvättbuffert och blanda väl.
OBS: Alla nämnda volymer användes för att isolera endotelceller från 3-4 neonatala musungar (5-7 dagar gamla). CD-31 och CD-102 är endotelcellytmarkörerna som används för magnetiskt immunpärlval. - Placera rören på en magnetisk separator och ta bort supernatanten med en Pasteur-pipett av glas. Upprepa tvätten 3 gånger med 1 ml pärltvättbuffert varje gång.
- Återsuspendera pärlor i originalsträngvolym, 50 μL, med pärltvättbuffert. Tillsätt sedan 5 μL (2,5 μg) antikropp (CD-31/CD-102) till varje 50 μL pärlor.
- Inkubera strängsuspensionen vid försiktig rotation på en rotator över natten vid 4 °C eller i 3 timmar vid rumstemperatur. Upprepa tvätt 4 gånger.
- Återsuspendera immunkulorna i den ursprungliga volymen, 50 μl, med pärltvättbuffert och förvara vid 4 °C och använd inom 1-2 veckor.
3. Isolering och plätering av lungcellerna
- Bered kollagenaslösning av typ 1 på isoleringsdagen: Tillsätt 25 mg kollagenas av typ 1 till 25 ml HBSS (se materialförteckning). Inkubera vid 37 °C i 1 timme med försiktig rotation och sterilfilter med 22 μM filter. Värm lösningen vid 37 °C.
- Injicera 5-7 dagar gamla musungar intramuskulärt med heparin (25 μl/mus, 1 000 E/ml) 10 min före avlivning för att minimera endotelcellsaktivering och koagulationsbildning14,15.
- Avliva musvalpen med halshuggning med vass sax i enlighet med AVMA-riktlinjerna för eutanasi 2020. Fäst sedan musen på ett dissektionskort med ventral sida uppåt.
- Spraya slaktkroppen med 70% etanol, exponera sedan brösthålan genom att först klippa membranet och sedan skära överlägset uppåt längs hela bröstets sidoväggar. Reflekterande bröstkorgen utsätter sedan hjärtat och lungorna.
OBS: Använd mindre pincett och sax för detta steg med tanke på den lilla storleken på neonatala möss, och se till att inte genomborra hjärtat eller lungorna eftersom detta kommer att leda till otillräcklig blodborttagning från lungorna. - Fäst en 25 G nål på en 10 ml spruta och injicera 5 ml kall DMEM i hjärtats högra kammare för att avlägsna blod från lungorna. Lungorna blir vita.
- Ta bort lungorna från brösthålan, en lob i taget, genom att skära loberna distala till motsvarande bronkier.
- Slå samman alla lunglober i ett 50 ml koniskt rör förfyllt med 20 ml iskallt basalmedium (från steg 1.1).
- Upprepa steg 3.2-3.7 med de andra musvalparna och slå samman alla lunglober i samma 50 ml koniska rör.
- Skaka försiktigt röret för hand i 10-15 s för att tvätta eventuella överskott av röda blodkroppar som visuellt uppskattas på lungans yta.
OBS: Det är inte nödvändigt att ta bort allt blod inifrån eller runt lungorna; Detta förbättrar dock renheten. All ytterligare vävnadshantering måste göras i en steril huva. - Använd en cellsil för att ta bort lungorna från mediet och överför vävnaden till en steril, engångs 100 mm diameter vävnadsodlingsfat och hacka med steriliserad sax.
- Överför den malda vävnaden till 50 ml E-röret med 25 ml förvärmd kollagenaslösning (steg 3.1). Skaka försiktigt på en roterande mixer i 45 min vid 37 °C.
OBS: Översmältning i jämn 60 min kan leda till lägre avkastning. - Fäst en 20 ml spruta på en 15 G trubbig kanyl (se Materialtabell) och triturera suspensionen 10-15 gånger för att bryta upp vävnaden till en cellulär suspension. Var kraftfull, men undvik överskumning.
OBS: Det kommer inte längre att finnas synliga bitar av lungan, och istället kommer suspensionen att vara grumlig när detta steg är klart. - Filtrera suspensionen genom en 70 μm cellsil till ett nytt 50 ml koniskt rör. Skölj vidare det koniska röret som används för matsmältningen och cellsilen med ytterligare 15 ml basalmedium.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 400 x g i 8 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanen med en Pasteur-pipet av glas och suspendera pelleten igen i 2 ml komplett medium. Överför till en T-75-kolv och tillsätt 8 ml komplett mediumkultur vid 37 °C i en fuktad 5 % CO2-inkubator .
- Följande dag, tvätta kolvarna två gånger med 10 ml Hank's Balanced Salt Solution utan kalcium och magnesium (HBSS/CMF) (se materialtabell) och tillsätt 10 ml komplett medium.
OBS: Efter 2-3 dagar kommer kulturen att vara 90-95% sammanflytande och redo för primär immunobeadisolering.
4. Primär immunobead isolering och odling av endotelceller
- Tvätta vidhäftande endotelceller två gånger med 10 mL HBSS/CMF. Tillsätt 2 ml trypsinfri cellavskiljningslösning (se materialtabell) och inkubera vid 37 °C i ~5 minuter. Se till att alla celler har lyfts från kolven.
OBS: En trypsinfri avskiljningslösning måste användas istället för trypsin eftersom trypsin kan störa cellytans vidhäftningsmarkör CD-31. - Tillsätt 8 ml basalmedium för att neutralisera cellavskiljningslösningen och överför innehållet till ett 15 ml koniskt rör. Snurra ner vid 400 x g i 4 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten med en glaspasteurpipett och suspendera cellerna i 2 ml basmedium. Överför 2 ml cellsuspension till ett 5 ml runt bottenpolystyrenrör (se materialförteckning).
- Vortex anti-CD-31-belagda pärlor i några sekunder för att resuspendera pärlorna och tillsätt 30 μL pärlor för varje 2 ml cellsuspension. Säkra locket.
- Inkubera röret i 10 minuter vid rumstemperatur på en änd-över-ände rotator. Placera sedan rören på en magnetisk separator och låt stå i 2 minuter.
- Använd försiktigt en Pasteur-pipett av glas, aspirera supernatanten. Ta bort röret från magneten, resuspendera pärlcellpelleten genom att tillsätta 3 ml basalmedium till röret och pipettera upp och ner flera gånger.
- Sätt tillbaka röret på magnetseparatorn i 2 minuter och aspirera sedan försiktigt supernatanten med en Pasteur-pipett av glas.
- Upprepa tvättar (steg 4.6-4.7) minst 4 gånger tills supernatanten är klar.
- Efter den slutliga tvättningen, suspendera pärlcellpelleten i 3 ml komplett odlingsmedium och överför den till en T-75-kolv. Tillsätt 7 ml av hela odlingsmediet och inkubera vid 37 °C i en fuktad 5 % CO2-inkubator .
- Nästa dag tvätta cellerna med HBSS/CMF, tillsätt sedan 10 ml färskt komplett medium. Byt ut media med 10 ml färskt komplett medium var 2-3: e dag tills 90-95% sammanflytande.
OBS: När cellerna är ~ 90-95% sammanflytande, vilket tar ~ 3-4 dagar, är kulturen redo för sekundär immunobeadisolering.
5. Sekundär immunobead isolering och odling av endotelceller
- Tvätta vidhäftande endotelceller två gånger med 10 ml HBSS/CMF. Tillsätt 2 ml trypsinfri cellavskiljningslösning och inkubera vid 37 °C i ~5 minuter. Se till att alla celler har lyfts från kolven.
- Tillsätt 8 ml basalmedium för att neutralisera cellavskiljningslösningen och överför till ett 15 ml koniskt rör. Snurra ner vid 400 x g i 4 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten med en Pasteur-pipet av glas och suspendera cellerna igen i 2 ml basmedium. Överför 2 ml cellsuspensionen till ett 5 ml runt bottenpolystyrenrör.
- Vortex anti-CD-102-belagda pärlor i några sekunder för att resuspendera pärlorna och tillsätt 30 μL pärlor för varje 2 ml cellsuspension. Säkra locket.
- Inkubera röret i 10 minuter vid rumstemperatur på en rotator som slutar över änden. Placera rören på en magnetisk separator och låt stå i 2 minuter. Aspirera sedan försiktigt supernatanen med en Pasteur-pipett av glas.
- Ta bort röret från magneten, resuspendera pärlcellpelleten genom att tillsätta 3 ml basalmedium till röret och pipettera upp och ner flera gånger.
- Sätt tillbaka röret på magnetseparatorn i 2 minuter innan du försiktigt aspirerar supernatanten med en Pasteur-pipett av glas.
- Upprepa tvättar (steg 5.6-5.7) 4 gånger eller mer tills supernatanten är klar.
- Efter den slutliga tvättningen, suspendera pärlcellpelleten i 3 ml komplett odlingsmedium och överför den till en T-75-kolv. Tillsätt 7 ml komplett odlingsmedium och inkubera vid 37 °C i en fuktad 5 % CO2-inkubator .
- Nästa dag tvätta cellerna med HBSS/CMF, tillsätt sedan 10 ml färskt komplett medium. Byt ut media med 10 ml färskt komplett medium var 2-3: e dag tills 90-95% sammanflytande. När endotelcellerna är helt sammanflytande är de redo för experiment. Cellerna bör inte användas efter passage sex eftersom åldrande kan uppstå och andra celltyper kan ta över.
6. Bekräftelse av endotelcellens ytmarkörer genom flödescytometri
- Efter användning av trypsinfri cellavskiljningslösning för att avlägsna cellerna, resuspendera cellpelleten till 1 x 10 5 celler / ml och alikvot 100 μL av cellsuspensionen i tre1,5 ml mikrocentrifugrör, märkta 1, 2 och 3.
- Tvätta celler med 1 ml 1x PBS. Centrifugera vid 500 x g i 2 min vid 4 °C. Ta bort tvättbufferten och upprepa två gånger.
- Återsuspendera cellpelleten i 100 μL 1x PBS. Till rör 1, tillsätt 1 μL konjugerad anti-mus CD-31 (PECAM-1) antikropp (ex: phycoerythrin (PE) anti-mus CD-31-antikropp) och 1 μL konjugerad anti-mus CD-102 (ICAM-2) (ex: fluoresceinisotiocyanat (FITC) anti-mus CD102-antikropp) (se Materialtabell). Till rör 2, lägg till lämpliga isotypkontroller. Rör nr 3 kommer att förbli ofärgat.
- Inkubera rören på is och i mörker i 30-45 min.
- Tillsätt 1 ml PBS till varje rör, virvla försiktigt och centrifugera vid 500 x g i 2 minuter vid 4 °C. Ta bort, tvätta och upprepa tre gånger. Återsuspendera den slutliga pelleten i 500 μL PBS.
- Håll rören täckta med aluminiumfolie vid 4 °C tills analys. Analysen måste slutföras inom 3-4 h.
- Hämta flödesdata med hjälp av en cytometer. Använd ett ofärgat prov som en negativ kontroll för att korrekt ställa in laserspänning enligt cellens autofluorescens. Grind total cellpopulation med ett framåtriktat spridningsdiagram och sidospridningsdiagram.
OBS: Efter uteslutning av dubletter definieras CD31 + CD102 + dubbelpositiva celler som endotelceller.
Representative Results
Detta enkla protokoll gör att man kan isolera, odla och karakterisera musmikrovaskulära endotelceller under 7-10 dagar (figur 1). Kortfattat skärs lungorna ut och smälts enzymatiskt före plätering. Omedelbart efter plätering kommer endotelceller och andra celler att flyta i cellodlingsmedia. Följande dag kommer endotelceller och de förorenande cellerna att fästas på plattan, och en kraftfull tvättteknik behövs för att avlägsna skräp och de flytande cellerna. När cellerna når sammanflödet utförs det första immunobeadvalet. De CD-31-positiva cellerna börjar sedan växa i en kullerstensformation (figur 2). Celler som inte har kullerstensmorfologi eller överväxt är föroreningar och inte endotelceller13,14,15,16.
Ett andra immunpärlval utförs sedan med hjälp av anti-CD-102-belagda pärlor för att öka renheten hos endotelceller, liknande andra protokoll13,16. Celler som har vuxit till sammanflöde efter andra immunpärlvalet kan sedan användas för experiment. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) används för att bekräfta att cellpopulationen är CD-31- och CD-102-positiv (figur 3).
Dessa endotelceller kan sedan användas för många applikationer, såsom att studera endotelinflammatoriska vägar och endotelbarriärfunktion. Till exempel observerades att behandling med murin cytomix (IFNg, TNFa och IL1b, vardera vid 10 ng / ml) inducerade IL-6-produktion av endotelceller (figur 4A). Därefter användes ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing)18 för att mäta transendotelresistens (TER) mot flödet av elektrisk ström över murina lungendotelcellsmonolager. Det observerades att cellerna behandlade med cytomix ledde till en minskning av TER (figur 4B), vilket överensstämmer med ökad endotelpermeabilitet. Dessa exempel illustrerar hur endotelcellerna framställda med detta protokoll kan studera olika endotelprocesser. Detta gör det möjligt för utredare att lättare studera gener av intresse i endotelceller, med tanke på det ständigt växande antalet tillgängliga knockout och transgena möss.
Figur 1: Schematisk för isolering av murina lungendotelceller. Lungor från 5-7 dagar gamla neonatala valpar skördas och hakas. Malet vävnad smältes enzymatiskt med kollagenas I. Cellulär suspension pläteras och odlas i 2-3 dagar. Celler genomgår sedan primär immunobeadisolering med CD-31-belagda pärlor och odlas i ytterligare 3-4 dagar. Andra immunobead isolering med CD-102-belagda pärlor innan odling ytterligare 2-3 dagar. Cellerna är nu redo för funktionella experiment. Bilden skapades av ett webbaserat illustrationsverktyg, Biorender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologi hos murina lungendotelceller. Odlade murina lungendotelceller visar en kullerstensmorfologi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Analys av endotelceller med flödescytometri. (A) Alla händelser visualiseras i ett punktdiagram över Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC). (B) Spridningsdiagrambekräftelse av murina lungendotelceller som är positiva för både endotelspecifika cellyteantigener CD-31 och CD-102. c) Histogram över isotypprovet och provet färgat med CD-31/CD-102-specifik antikropp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cytomix inducerar murin lungendotelcell IL-6-produktion och endotelcellpermeabilitet. Murina mikrovaskulära endotelceller från C57BL / 6-möss behandlades med cytomix (IFNg, TNFa och IL1b, vardera vid 10 ng / ml). (A) IL-6-nivåer kvantifierades sedan i odlingssupernatanter vid 15 timmar (**p<0,01, n = 4 brunnar/tillstånd). (B) Elektrisk cell-substratimpedansavkänning användes för att mäta transendotelresistansen (TER) upprepade gånger under 15 timmar. Data normaliserades till resistensen omedelbart före tillsatsen av cytomixen som betecknad och analyserades genom tvåvägsvariansanalys (ANOVA) följt av Tukey efter test19 (**p<0,01, n = 4 brunnar/tillstånd). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta enkla protokoll lämpar sig för endotelceller med hög renhet från murina lungor. Även om den totala tiden från början till slut är 7-10 dagar, är den praktiska tiden cirka 3-4 timmar. Jämfört med andra metoder13,14,15,16 är det nuvarande protokollet strömlinjeformat och håller viktiga steg utan att kompromissa med avkastning och renhet.
Det är värt att notera några kritiska aspekter av detta protokoll. För det första är det viktigt att använda neonatala valpar snarare än vuxna möss. Enligt vår erfarenhet förökar sig endotelceller från vuxna möss inte lika lätt som celler från neonatala valpar, och de överskrids lätt av celler med spindelliknande morfologi som överensstämmer med fibroblaster eller mesenkymala stamceller15,16. En möjlig förklaring till skillnaden är att lungutvecklingen befinner sig i det alveolära stadiet hos neonatala möss, kännetecknad av snabbare proliferation av endotelceller20. Det kan också finnas en viss grad av åldrande medåldrande 21. Enzymatisk matsmältningstid måste också vara exakt, eftersom underdigestion kan leda till en encellssuspension med lågt utbyte. Däremot kan övermatsmältning leda till en betydande mängd celldöd. Vi har bestämt att den optimala tiden för kollagenasuppslutning bestäms till 45 minuter. Detta följs sedan av mekanisk dissociation med en trubbig kanyl. Instilling intratrakealt kollagenas under enzymatisk nedbrytning har också rapporterats14,15; Detta kan dock vara tidskrävande och leder till ofullständig matsmältning under det aktuella arbetet. Slutligen fortsätter vissa protokoll direkt till immunobead isolering omedelbart efter enzymatisk nedbrytning13,16. Vi har funnit att odling av cellerna från den dissocierade lungan i mediet under en dag eller två innan immunpärlvalet väsentligt ökar utbytet av livskraftiga och mycket rena endotelceller. Detta kan vara relaterat till hastigheten att få isolerade celler i vävnadsodlingsmediet, vilket leder till mindre celldöd i de tidiga stadierna efter avlägsnande från mössen, högre initial sådddensitet och tid för endotelcellerna att fästa och proliferera före den första immunobeadisoleringen.
Begränsningar av beredning och analys av musendotelceller är följande. Varje mus tillhandahåller endast ett begränsat antal celler som måste användas inom några få passager. Detta problem kan övervinnas genom att samla lungsmältning från flera möss. Tyvärr misslyckas vi i våra ansträngningar att kryokonservera och tina cellerna för framtida bruk. Trots dessa begränsningar har musendotelceller vissa fördelar. De kan vara till hjälp, särskilt i situationer där mänskliga endotelceller antingen inte kan användas (t.ex. genknockout), när kompletterande studier krävs för att bekräfta resultat med mänskliga celler, eller när heterogeniteten av svar från endotelceller från olika mänskliga givare gör reproducerbarheten mellan experiment problematisk6. Den homogena endotelcellpopulationen från genetiskt identiska möss möjliggör reproducerbarhet mellan experiment och studier av specifika gener och vägar under stabila bakgrundsförhållanden.
Musendotelceller kan användas för flera applikationer för att ge insikter i endotelaktivering och dysfunktion i olika sjukdomsprocesser. Till exempel spelar endotelceller en integrerad roll i sepsis, vilket bidrar till både fördelaktiga och patologiska svar genom sina roller för att aktivera lokaliserad och systemisk inflammation, främja leukocythandel och aktivering i vävnader, reglera koagulation och modulera endotelpermeabilitet 2,22,23. Detta enkla protokoll ger livskraftiga, funktionella endotelceller som kan användas i analyser för var och en av dessa endotelprocesser.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH T32GM008440 (JH/EW) och NIH R01AI058106 (JH). Vi erkänner UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID: SCR_018206) som delvis stöds av Grant NIH P30 DK063720 och av NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
- Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
- Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
- Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
- Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
- Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
- Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
- Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
- Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
- Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
- Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227 (2019).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
- Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55 (2015).
- Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H.
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
